Avaliação de uma reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa universal aninhada para a detecção de lissavírus

Resumo

Um Pan-lyssavirus Nested transcrição reversa da polimerase em cadeia foi desenvolvida para detectar especificamente todos os lissavírus conhecidos. A validação utilizando amostras cerebrais da raiva de diferentes espécies animais mostrou que este método tem sensibilidade e especificidade equivalentes ao teste padrão-ouro de anticorpos fluorescentes e pode ser utilizado para o diagnóstico rotineiro da raiva.

Resumo

Para detectar o vírus da raiva e outras espécies-membro do gênero lyssavirus dentro da família Rhabdoviridae, a reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa do Pan-lyssavirus (nested RT-PCR) foi desenvolvida para detectar a região conservada do gene do nucleoproteína (N) dos lyssavirus. O método aplica a transcrição reversa (RT) usando o RNA viral como o molde e o oligo (descolamento)₁₅ e os hexâmeros aleatórios como primers para sintetizar o ADN complementar viral (cDNA). Em seguida, o cDNA viral é usado como um modelo para amplificar um fragmento de gene N 845 BP no PCR de primeira rodada usando primers externos, seguido de PCR Nested segundo round para amplificar o fragmento final de 371 BP usando primers internos. Este método pode detectar diferentes clados genéticos de vírus da raiva (rabv). A validação, usando 9.624 espécimes cerebrais de oito espécies animais domésticos em 10 anos de diagnósticos clínicos de raiva e vigilância na China, mostrou que o método tem 100% de sensibilidade e 99,97% de especificidade em comparação com a fluorescente direta teste de anticorpos (FAT), o método padrão-ouro recomendado pela Organização Mundial da saúde (OMS) e pela Organização Mundial para a saúde animal (OIE). Além disso, o método também poderia ampliar especificamente o fragmento de gene N alvo de 15 outras espécies de lyssavirus aprovadas e duas novas no 10º relatório do Comitê Internacional de taxonomia de vírus (ICTV), avaliada por uma detecção mímica de sintetizados N plasmídeos do gene de todos os lyssavirus. O método fornece uma alternativa conveniente ao FAT para o diagnóstico da raiva e foi aprovado como um padrão nacional (GB/T36789-2018) de China.

Introdução

A raiva é uma doença zoonótica mundial causada por vírus dentro do gênero lyssavirus¹. Os lissavírus (família Rhabdoviridae) são vírus de RNA de cadeia única negativa com um genoma de aproximadamente 12 KB que codifica cinco proteínas: N, fosfoproteína (P), proteína matricial (M), glicoproteína (G) e a grande proteína ou polimerase (L). Baseado em seqüências do nucleotide do gene de N, distância genética, e testes padrões antigénicos, os lyssavirus foram divididos em 16 espécies, compreendendo o vírus de raiva Classical (RABV) e os vírus raiva-relacionados (RRV): vírus do bastão de Lagos (LBV), vírus de Duvenhage (DUVV ), Mokola Virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), Australian bat lyssavirus (ABLV), Aravan Virus (ARAV), Ikoma Virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Mónica bat lyssavirus (GBLV), Irkut Virus (IRKV), Khujand Virus (KHUV), West Caucasian bat Virus (WCBV), Shimoni bat Virus (SHIBV), e Lleida bat lyssavirus (LLEBV)². Recentemente, foram identificados dois lissavírus adicionais: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) isolado do morcego de um Brandt (Myotis brandtii) na finlândia em 2017 e³ de Taiwan e lyssavirus morcego (twblv) isolados de um pipistrelle japonês ( Pipistrellus abramus) em Taiwan, China em 2016 – 2017⁴.

Todos os mamíferos são suscetíveis à raiva; Entretanto, nenhuma lesão patognomônico bruta ou sinais clínicos específicos permitem sua identificação, e o diagnóstico só pode ser feito no laboratório⁵. O método mais utilizado para o diagnóstico da raiva é a gordura, considerada padrão-ouro tanto pela OMS quanto pela OIE^5,6. Não obstante, o FAT pode produzir resultados não confiáveis em amostras degradadas/autolyzed do tecido de cérebro. Adicionalmente, não pode ser usado para ensaiar espécimes fluidos biológicos tais como o líquido cerebrospinal (CSF), a saliva, e a urina, desse modo na maior parte impedindo seu emprego no diagnóstico anterior à morte⁷. Os testes diagnósticos convencionais alternativos, tais como o teste da infecção da cultura do tecido da raiva (RTCIT) e o teste da inoculação do rato (MIT), exigem diversos dias⁶, uma desvantagem principal quando um diagnóstico rápido é essencial.

Os vários testes diagnósticos moleculars (por exemplo, a deteção do RNA viral pelo RT-PCR, o PCR-enzima-lig o ensaio da imunoabsorção [PCR-ELISA], a hibridação in situ, e o PCR tempo real) são usados como técnicas rápidas e sensíveis para o diagnóstico da raiva⁸. A RT-PCR é agora recomendada pela OIE para o diagnóstico rotineiro da raiva, e uma PCR heminested (HN) é descrita no manual de testes de diagnóstico e vacinas para animais terrestres da OIE para detectar todos os lissavírus⁵. Aqui nós descrevemos um RT-PCR aninhado do Pan-lyssavirus, que permita a deteção específica e sensível de todas as 18 espécies do lyssavirus comparáveis ou excedendo aquela obtida pelo FAT. O princípio do método é um RT do RNA alvo (região conservada do gene do lyssavirus N) no cDNA, seguido pela amplificação do cDNA por duas voltas do PCR. O cDNA sofre o PCR de primeira rodada com primers externos para amplificar um fragmento de 845 BP; Então, o segundo-redondo PCR usa o primeiro-redondo produto do PCR como um molde para amplificar um fragmento da BP 371 com primeiras demão internas. As duas rodadas de PCR aumentam significativamente a sensibilidade do ensaio.

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Protocolo

O uso de camundongos neste protocolo foi aprovado pelo Comitê Administrativo de bem-estar animal do Instituto de medicina veterinária militar, a Academia de ciências médicas militares, China (laboratório de cuidados com animais e autorização do Comitê de uso, permitir número JSY-DW-2010-02). Foram seguidas todas as diretrizes institucionais e nacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. extração de RNA

1. Extraia o RNA da raiva-tecido de cérebro suspeitado, biópsias da pele, saliva, ou CSF ou da cultura de pilha rabv-contaminada, usando métodos da extração do isothiocyanate-fenol-clorofórmio-baseado do guanidínio ou jogos comercialmente disponíveis da extração do RNA viral. Utilize imediatamente o RNA preparado ou guarde-o a-80 ° c até ser necessário.

2. transcrição reversa do RNA viral

1. Retire os reagentes de RT indicados na tabela 1 do congelador, mantenha-os no gelo e descongele-os antes de o utilizar.
2. Prepare 12 μL de mistura de reação de RT em um tubo de 0,2 mL de PCR com os reagentes listados na tabela 1. Permitir a pipetagem variações, preparando um volume de Master Mix pelo menos um tamanho de reação maior do que o necessário.
3. Adicionar 8 μL de amostra, RNA de controle positivo ou controle negativo para a mistura de reação de RT dentro de uma estação de trabalho de PCR em uma sala de modelo. O controle positivo de RT é o RNA extraído da cultura celular infectada com a cepa fixa de RABV CVS-11 (Challenge Virus Standard-11) e armazenada a-80 ° c. O controle negativo contém RNase-Free ddH₂O.
4. Misture o conteúdo dos tubos RT por vortexing; em seguida, centrifugue brevemente.
5. Coloque os tubos de reacção num termociclador. Configurar o programa de síntese do cDNA com as seguintes condições: 42 ° c para 90 min, 95 ° c por 5 min e 4 ° c em espera. Defina o volume de reacção para 20 μL. Inicie a execução de RT.

3. primeiro-round PCR

1. Mantenha os reagentes de PCR listados na tabela 2 no gelo em uma sala limpa até o uso; Então, descongelar e vórtice-los.
2. Prepare a mistura PCR de primeira rodada em um tubo de 0,2 mL de PCR com os reagentes listados na tabela 2.
3. Adicione uma amostra de 2 μL do cDNA ou do plasmídeo na mistura First-round do PCR dentro de uma estação de trabalho do PCR em um quarto do molde. O controle positivo do PCR é o cDNA CVS-11 preparado como mencionado na etapa 2,3 para o método acima do RT. O controle negativo de PCR é ddH₂o.
4. Transfira os tubos selados para um termociclador e ciclo de PCR usando os parâmetros listados na tabela 3.

4. PCR da segunda rodada

1. Prepare a mistura de PCR da segunda rodada em um tubo de 0,2 mL de PCR usando os reagentes listados na tabela 4.
2. Adicionar 2 μL de produto de PCR de primeira rodada na mistura de PCR de segunda rodada. Além disso, inclua ddH₂o como um controle negativo da segunda rodada de PCR.
3. Realize a ciclagem térmica do PCR usando os mesmos parâmetros que dados na etapa 3,4.

5. análise dos produtos de PCR por eletroforese em géis de agarose

1. Prepare um gel de agarose de 1,5% adicionando 1,5 g de agarose a 100 mL de Tris-Acetato-EDTA (TAE) e dissolvendo-o completamente aquecendo-o em um forno de microondas.
2. Adicionar brometo de etídio (EB) (em uma concentração final de 0, 1%) ou outra substituição comercial de EB. Despeje o gel no molde e deixe-o solidificar à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min.
3. Prepare as amostras de carga misturando 5 μL de cada produto de PCR com 1 μL de tampão de carga de 6x.
4. Carregar as amostras e marcador de DNA adequado separadamente para os poços e executar o gel por aproximadamente 30-45 min em 120 V até que a linha de corante é de aproximadamente 75%-80% para baixo o gel.
5. Desligue o poder, desconecte os elétrodos da fonte de energia, e então, remova com cuidado o gel da caixa do gel.
6. Use um gel UV que documenta o dispositivo para visualizar e fotografar os fragmentos do ADN.

6. caracterização de Nested RT-PCR

1. 6,1. especificidade e sensibilidade para a detecção de 18 plasmís de lissavírus
   1. Encomendar 18 plasmís comerciais contendo o gene N completo de cada lyssavirus (16 espécies de ICTV e duas espécies novas) para a PCR.
   2. Calcule o número de cópia do plasmídeo usando o número de Avogadro (N_a) e a seguinte fórmula.
      [(g/μL de DNA plasmídeo)/(comprimento plasmídeo em BP x 660)] x 6, 22 x 10²³ = número de moléculas/μl
   3. Prepare soluções de estoque (2,24 x 10⁹ moléculas/μL) de todos os 18 plasmís em DDH₂O.
   4. Realize 9 10 diluições seriais de todos os 18 plasmídeos em ddH₂o. Diluir 10 μL de cada estoque de plasmídeo com 90 μL de DDH₂o. Vortex e centrifugador brevemente.
   5. Realize a amplificação de PCR conforme descrito nas seções 3-5.
   6. Analise a especificidade e a sensibilidade do PCR aninhado detectando uma série de plasmís do lyssavirus.
2. Determinação do d medição l imit
   1. Ajuste o título da linhagem de células CVS-11 da estirpe do vírus da raiva para 10^5,5 tcid₅₀/ml (titer de vírus determinado de acordo com o manual do OIE)⁵.
   2. Realize 5 10 diluições seriais de CVS-11 (a solução conservada em estoque é 10^5,5 tcid₅₀/ml) como descrito na etapa 6.1.4.
   3. Realize a extração do RNA e os procedimentos aninhados da amplificação de RT-PCR de todas as diluições virais como descritas nas seções 1-5.
3. Compar ison de a RT-PCR aninhado com o "Gold Standard" Fat
   1. Teste todas as amostras clínicas por RT-PCR aninhada e, em seguida, confirme os resultados com o gene FAT⁵ e N sequenciamento⁹.
   2. Use dados normalizados para uma análise estatística com o SAS 9,1. Use o teste de Kappa e o teste de qui-quadrado de McNemar para uma comparação estatística dos testes de diagnóstico (comando SAS: proc freq; tabela/concordo). Calcule os intervalos de confiança assumindo a distribuição abinomial.
4. Avaliação da eficácia no teste de amostras degradadas
   1. Expor duas amostras clínicas confirmadas do tecido de cérebro dos cães raioides em 37 ° c.
   2. Teste as duas amostras em cada dia de exposição em 37 ° c por RT-PCR aninhado, o FAT, e o MIT⁵.

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Resultados

Os resultados do RT-PCR aninhado para detectar 18 espécies de lyssavirus são mostrados na Figura 1. Todos os controles positivos de PCR mostraram o esperado 845 BP no primeiro e 371 BP nas amplificações de segunda rodada sem banda no controle negativo. Todos os 18 lyssavirus produziram as 845 e/ou as faixas de 371 BP esperadas, indicando que o RT-PCR aninhado detectou todos os 18 lyssavirus. Dezesseis plasmídeos de lyssavirus tiveram a amplificação eficiente em duas voltas do PCR, mas...

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Discussão

Atualmente, RABV é um Major lyssavirus responsável por quase toda a raiva humana e animal na China, bem como em outros países. Além, uma variação de IRKV foi identificada primeiramente de um bastão deleucogaster de Murina na província de Jilin em China do nordeste em 2012¹⁰, e foi relatado para causar a morte de um cão na província de Liaoning em 2017¹¹. Mais recentemente, um Lyssavirus novo, TWBLV, foi identificado igualmente de um bastão japon...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 × TAE	Various	Various
6 × loading buffer	TakaRa	9156
Agarose	US Everbright® Inc	A-2015-100g
ddH2O	Various	Various
DL 2,000 Marker	Takara	3427A
dNTPs (10 mM)	TakaRa	4019
dNTPs (2.5 mM)	TakaRa	4030
Electrophoresis System	Tanon	EPS300
Ex-Taq (5 U/μL)	TakaRa	RR001
Gel Imaging System	UVITEC	Fire Reader
Microcentifuge tubes	Various	Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL)	TakaRa	2641A
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermoscientific	ND1000
Oligo (dT)15	TakaRa	3805
PCR Machine	BIO-RAD	T100
PCR Tubes	Various	Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase	NEW ENGLAND BioLabs	M0530S
Pipettors	Various	Various
Random Primer	TakaRa	3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL)	TakaRa	2313A
RNase-free ddH2O	TakaRa	9102
Taq Buffer (10×)	TakaRa	9152A
Tips	Various	Various
Vortex mixer	Various	Various