Bir melanom hasta-türetilen xenograft model

Özet

Hasta-türevi xenograft (PDX) modelleri daha sağlam özetlemek Melanom moleküler ve biyolojik özellikleri ve geleneksel plastik doku kültürü tabanlı asder karşılaştırıldığında tedavi tepkisi daha öngörü vardır. Burada, yeni PDX modellerinin kurulması ve mevcut PDX modellerinin karakterizasyonu/denemeleri için standart çalışma protokollerimizi tarif ediyoruz.

Özet

Kanıtlar birikir, moleküler ve biyolojik özelliklerin, insan hastalarında geleneksel iki boyutlu doku kültürü damarlarında yetiştirilen Melanom hücrelerinde farklılık gösterdiğini göstermektedir. Bunun nedeni, fizyolojik koşulların yokluğunda, ince olarak büyümek olabilir melanom hücrelerinin klonal nüfus darboğaz seçimi kaynaklanmaktadır. Ayrıca, iki boyutlu doku kültürlerinde tedaviye yanıtlar genel olarak Melanom hastalarında tedaviye yanıtlar yansıtmak değil, klinik çalışmaların çoğunluğu ile etkili olduğu gösterilen terapötik kombinasyonları etkinliğini göstermek için başarısız Vitro. Farelerin içine melanom hücrelerinin ksenograftlanması iki boyutlu doku kültüründen yok fizyolojik in vivo bağlam sağlar rağmen, Engraftman için kullanılan Melanom hücreleri zaten altında büyüyebilir hücreler için darboğaz seçimi geçirmiş hücre hattı kurulduğunda iki boyutlu koşullar. Darboğazın bir sonucu olarak ortaya çıkan geri dönüşümsüz değişiklikler, büyüme ve istila özelliklerinde yapılan değişiklikleri ve belirli alt nüfus kaybını içerir. Bu nedenle, daha iyi insan durumu özetlemek modelleri daha iyi etkili metastatik melanoma hastalarının genel hayatta kalma artırmak terapötik stratejileri tahmin edebilir. Hasta tarafından türetilen xenograft (PDX) tekniği, tümör hücrelerinin insan hastasından bir fare alıcısına doğrudan implantasyonunu içerir. Bu şekilde, tümör hücreleri sürekli olarak fizyolojik stresler altında büyümüştür ve tümör insan hastasındayken mevcut olan moleküler ve biyolojik özellikleri koruyan iki boyutlu darboğaz asla geçmemişti. Metastaz organ sitelerden elde edilen önemli, PDX modelleri (yani, beyin) benzer metastatik kapasite göstermek, PDX modelleri terapi naif hastalar ve terapi elde direnci olan hastalarda elde ederken (yani, BRAF/MEK inhibitörü tedavisi) ekran tedaviye benzer duyarlılık.

Giriş

Preklinik modeller, hastalık karakterizasyonu, normal hücrelere karşı kansere özgü eyleme dönüştürülebilir güvenlik açıkları keşfi ve istismar eden etkili tedavilerin geliştirilmesi gibi translasyonel kanser araştırmalarının tüm yönleri için önemlidir. Bu güvenlik açıkları hastaların genel sağkalım artırmak için. Melanom alanında, on binlerce hücre hattı modeli, uyuşturucu taraması için ağır bir şekilde kullanılmıştır, > 4000 ile grup tek başına (WMXXX serisi) katkıda bulunmuştur. Bu hücre hattı modelleri, çeşitli çeşit kutanöz Melanom (örneğin, acral, uveal ve yüzeysel yayılma) ve çeşitli genotiplerle (yani, BRAF^V600-mutant ve Nöroblastom RAS viral onkojen homolog olan Melanom hastalarından türetilmiştir [ NRAS ^Q61R-mutant]), klinikte bulunan hastalığın spektrumunu kapsayan^1,2.

Melanom alanında en başarılı, hedeflenen terapi stratejisi 1 ' den ortaya çıkmıştır) hastaların% 50 ' inde BRAF mutasyonları tanımlayan genomik karakterizasyonu melanomlar³ ve 2) preklinik soruşturma melanom hücre hattı modelleri yararlanarak⁴. BRAF/mek inhibitörü kombinasyonu gıda ve İlaç İdaresi (FDA)-2014 yılında melanomlar liman BRAF^V600E/K mutasyonlar aktive ve >% 75 yanıt oranı⁵sahiptir hastaların tedavisi için onaylanmıştır. Bu ilk etkinliğine rağmen, çok yönlü içsel ve elde edilen direnç mekanizmaları ve intratümöral heterojenite nedeniyle neredeyse her durumda direnç hızla ortaya çıkar. Ne yazık ki, hücre hattı modelleri, araştırmacılar deneysel olarak belirlemek için girişimi zaman plastik gemiler, hangi maskeler onların klinik tahmin potansiyeli iki boyutlu kültürde yetiştirilen temsili biyolojik heterojenliği özetlemek yok belirli bir form veya Melanom genotürü olan hastalarda etkili olabilecek tedaviler⁶. Nasıl en iyi model hasta intratümöral heterojenliği anlamak müfettişlerin daha iyi terapi-dayanıklı altnüfus öldürebilir tedavi yöntemleri geliştirmek için izin verecektir mevcut standart bakım terapileri başarısızlık sürücü.

Hücre hattı modellerinin sınırlı tahmin değeri için Paramount nasıl başlangıçta kurulmuştur. İki boyutlu, plastik doku kültürü gemileri, proliferatif ve invaziv potansiyel değişiklikler de dahil olmak üzere, bir hastanın tümörün tek hücreli süspansiyonu yetiştirilen tümör klonal manzara içinde geri dönüşümsüz değişiklikler ortaya, spesifik eliminasyon alt nüfus ve genetik bilginin değiştirilmesi⁷. Bu melanom hücre hattı modellerinin fareler içine xenografts preklinik çalışmalar için en sık kullanılan in vivo platform temsil; Ancak, bu strateji de klinik olarak gözlenen karmaşık tümör heterojenitesi yoksul Recapitulation muzdarip. Bu eksikliği aşmak için, PDX modeli de dahil olmak üzere, melanom daha sofistike preklinik modelleri birleştiren büyüyen bir ilgi olmuştur. PDX modelleri, hastaların sitotoksisik ajanlara tepkisi ve aynı hastada⁸' den elde edilen PDX modelinin tepkisi arasında uyum gösteren akciğer kanseri hastalarında seminal çalışmalar ile > 30 yıldır kullanılmıştır. Son zamanlarda, hem sektörde hem de Akademik merkezlerde preklinik araştırmalar için seçim aracı olarak PDX modellerini kullanmak için bir sürücü olmuştur. PDX modelleri, insan hastalarında tümör heterojenitesi onların üstün Recapitulation nedeniyle, daha klinik hücre hattı ksenogreft daha terapi optimizasyonu çabaları kullanmak için ilgilidir⁹. Melanoma, gelişmiş hastalığın terapötik yönetimi künt büyük engelleri vardır¹⁰. Klinik olarak ilgili PDX modelleri klinikte direnç modeli için kullanılan ve tedaviye dayanıklı tümörlerin tedavisinde klinik olarak mevcut ajanlar ile terapötik stratejileri tanımlamak^11,12. Kısaca, PDX modelleri oluşturmak için burada sunulan protokol birincil veya metastatik melanomalar (biyopsi veya cerrahi tarafından toplanan) NOD/SCID/ıL2-reseptör null (NSG) fareler içine taze doku subkutan implantasyon gerektirir. Metodolojik yaklaşımlarda farklı varyasyonlar farklı gruplar tarafından kullanılır; Ancak, temel bir çekirdek¹³var.

Protokol

Aşağıdaki hayvan protokolleri, Wistar Enstitüsü 'nün insancıl Etik Komitesi ve hayvan bakım yönergelerine ilişkin yönergelere uyur.

1. Melanoma tümörü doku koleksiyonu

1. Aşağıdaki cerrahi veya biyopsi yöntemlerinden biri ile Melanom hastalarından tümör dokusunu (0 olarak adlandırılan geçiş) toplayın.
   1. Cerrahi eksizyon dokusu için, taşıma depolama medyasında (RPMı 1640 + 0,1% fungizone + 0,2% gentaminisin) 4 °C veya buzda en az 1 g doku (reect metasürler ve primer lezyonlar) koruyun.
   2. Cerrahi biyopsi dokusu için, 4 °C ' de veya buzda taşıma depolama medyasında 1 g 'den az doku (genellikle deri altı [s.c.] metastazı ve lenf nodu [LN] metasürlerin Punch biyopsisi) sürdürün.
   3. Çekirdek biyopsi dokusu için, yaklaşık 10 mm x 1 mm (genellikle karaciğer biyopsileri) dokusunun bir silindiri (çekirdek) 4 °C ' de veya buzda 5 mL 'lik taşıma depolama ortamı içeren 15 mL 'Lik bir tüpe yıkayın.
   4. İnce iğne aspirat (FNAs) dokusu için, 4 °C ' de veya buzda bir iğne ve şırıngadaki hastaya doğrudan alınan çok az miktarda doku (1 mm 'den az) tutun.
2. Doku taşıma depolama medyasında 4 °C veya buz üzerinde aynı gün veya cerrahi eksizyon veya biyopsi sonrası gecede nakliye ile teslim. Teslim 1-2 h içinde doku süreci.

2. fare implantasyonu için tümör dokusu işleme

1. Cerrahi eksizyon veya cerrahi biyopsi dokusu işleme
   1. Dokusunu steril bir petri tabağına aktarın ve tümör dokusunu çevreleyen normal dokudan mümkün olduğunca ayırın.
   2. Kalan tümörden mümkün olduğunca nekrotik dokusu (genellikle tümör içinde yer alan soluk beyazlı doku olarak tanımlanır) çıkarın.
   3. İlk tümör yığınlarını cerrahi fare implantasyonu için yaklaşık eşit parçalara (~ 3 mm x 3 mm) alt bölümlere ayırmak için bir neşter kullanın (Şekil 2).
   4. İsteğe bağlı olarak, yeterli tümör dokusu mevcut ise, aşağı akım deneyleri için doku Snap-dondurma (RNA sıralama [rnaseq], tüm ekzom sıralama [Wes], vb.).
   5. İki neşter bıçakları ile çapraz bıçak tekniği kullanarak tümör dokusunu kıyma bir tümör Bulamaç olun. Şimdi cerrahi fare implantasyonu için hazır bir bulamaç oluşturmak için mümkün olduğunca ince tümör parçaları Mince.
   6. Alternatif olarak, tümör dokusu mekanik ayrışma için çok zor ise, jel benzeri bulamaç ve implantasyon ve/veya enjeksiyon için tek hücreli süspansiyon oluşturmak için bir sindirim ayrışma prosedürü kullanın.
      1. Bulamaç oluşturmak için mümkün olduğunca ince tümör parçaları Mince.
      2. Soğuk Hank dengeli tuz çözeltisi ile bir 50 mL tüp Bulamaç koyun (HBSS)^-/- (CA^{+ +} ve mg^{+ +}olmadan); sonra, 4 °C ' de 4 dak için 220 x g 'de santrifüjün ve Pelet.
      3. 1 g tümör dokusu başına 10 ml ısıtılmış taze Özet medya (200 u/ml kolajenaz IV + 5 mm CAcl₂ + 50 u/ml DNase içinde HBSS^-/-) içinde Bulamaç resuspend.
      4. Tüpü 20 dakika boyunca 37 °C su banyosuna yerleştirin ve tek kullanımlık pipet ile her 5 dakikada bir karıştırın.
      5. 50 mL HBSS 'ye kadar yıkayın^-/-; sonra 4 °C ' de 4 dakika için 220 x g 'de Santrifüjü.
      6. 5 mL prewarmed TEG ekleyin (0,025% tripsin + 40 μg/mL etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N, 1 g tümör dokusu başına N, N ', n'-tetraasetic asit [EGTA] + 10 μg/mL Polivinil alkol [PVA]), hafifçe resuspend/Shake, ve karıştırma olmadan 2 dakika için 37 °C ' de tüp yerleştirin.
      7. En az 1 eşit hacimli soğuk boyama ortamı ekleyin (1% sığır serum albümin [BSA] + 10 mM 4-(2-hidroksiil) -1-piperazineethanesulfonik asit [HEPES] + 1x penisilin-Streptomycin L15 medyada) tripsin ve Santrifüjü 220 x g 'de 4 dk. 4 ° ' de gidermek için C.
      8. Numuneyi 1 gr tümör dokusu başına 10 mL boyama medyası içinde resuspend ve fare enjeksiyonu için tek hücreli bir süspansiyon almak için 40 μm hücre süzgeci ile filtreleyin (Şekil 2).
      9. Hücre süzgeci üstünde kalan Bulamaç da cerrahi fare implantasyonu için toplanabilir.
2. C cevher biyopsisi doku işleme
   1. 5 cm Petri tabak içine doku taşıma tüpü çekirdek silindir dokusu dökün.
   2. Aşırı sıvı çıkarın, Petri tabak kenarına artığını doku, ince tümör dokusu kıyma, eklemek ~ 100 – 150 μL HBSS^-/- tümör dokusunun üstüne, ve hızlı bir şekilde HBSS/tümör doku süspansiyonu 1 ml şırınga içine çizin.
   3. 1 mL şırıngaya 23 G iğne takın, HBSS/tümör dokusu süspansiyonunu iğne üzerinden 1,5 mL spin tüpüne geçirin.
   4. Tümör süspansiyonu şırınga içine iğne ile sorunsuz geçebilir kadar hala üzerinde enjektör içine yeniden çizin.
   5. Sonunda tümör süspansiyonunu şırıngaya geri çekin ve 23 G iğnesini ayırın.
   6. Bir 27 G iğne takın ve suni hücre içi matriks (~ 100 – 150 μL) eşit hacim çizin (bkz. malzeme tablosu) şırınga içine.
   7. 1,5 mL spin tüpüne, tümör/HBSS^-/- süspansiyon ile hafifçe, kabarcık oluşumundan kaçınılması ile yapay ekstrellüler matris eşit hacim ekleyin.
   8. Şırıngaya son bir kez geri çizin ve çekirdek biyopsisi tümör dokusu şimdi fare enjeksiyonu için hazırdır.
3. FNA dokusu işleme
   1. Buz üzerinde FNA örnekleri (iğne sıkışmış) içeren şırıngayı yerleştirin.
   2. İğne (FNA dokusu içeren) şırıngadan ayırın ve şırıngadan pistonu çıkarın, şırıngayı ~ 150 – 200 μL HBSS^-/- üzerine ekleyin.
   3. Pistonu şırıngaya ve iğneye (FNA dokusu içeren) yeniden takın ve HBSS^-/- iğne üzerinden 1,5 ml 'lik bir döndürme tüpüne itin. Bu adım, iğnesinden FNA tümörü kaldırır.
   4. Adım 2.3.3 ile HBSS^-/-/Fna süspansiyonu iki kez aynı Şırıngayı kullanarak, enjektörün tümör dokusunun alınmasını maksimize etmek için yineleyin.
   5. HBSS/FNA süspansiyonu içeren 1,5 mL dönme tüpüne eşit hacim (~ 100 – 150 μL) yapay ekstrasellüler matris ekleyin.
   6. Kadar yavaşça yapay ekstrürüler Matrix/HBSS^-/-/Fna süspansiyonu 23 G iğne içine yeniden ve iki kez tekrarlayan çizmek karıştırın.
   7. Tüm suni hücre içi matris/HBSS^-/-/Fna hacmini geri şırıngaya çizin, 23 g iğnesini 27 g iğne ile değiştirin ve Fna örneği artık fare enjeksiyonu için hazırdır.

3. farelerde tümör implantasyonu ve enjeksiyon

1. Cerrahi eksizyon veya cerrahi biyopsi dokusunun implantasyonu
   Not: tüm cerrahi araçların otoklavlama veya önceden sterilize edilmiş tek kullanımlık enstrümanlar kullanımı ile steril olduğundan emin olun.
   1. NSG 6-8 hafta erkek veya kadın fareler alt arka gelen saç tıraş yaklaşık 1,5 cm x 3 cm alanı saç ile bırakarak. Isoflurane kullanarak fareler anestezize ve hassas bir tepki testi olarak ayak hafifçe sıkarak onaylayın. Kuruluğu önlemek için gözlerinde veteriner merhem kullanın.
   2. Anestezi makinesinin burun koni bir ısı pad üzerinde bireysel fareler yerleştirin, chlorhexidine ile tıraş alanı fırçalayın. Sonra% 70 etanol ile ikiye katla ve buharmaya izin ver.
   3. Cerrahi implantasyon için bireysel höyükleri içine bir petri tabak içine parçaları hazırlamak veya bölme tümör Bulamaç (3 fare içine implante edilmesi halinde üç eşit höyükleri içine yani).
   4. Neşter Blade kullanarak, fare arkasındaki ortasında yaklaşık 5 mm uzunluğunda bir kesi yapmak, bir çift forseps almak ve operatörün ters kesi tarafında Cilt yukarı kaldırın.
   5. Diğer taraftan makası alın ve hafifçe küçük makas kesikleri ile fasiyal membranı keserek kas tabakasından cilt ayırmak, böylece tümör dokusu için bir "cep" oluşturma.
   6. Bir tümör yığını ya da bir tek bireysel Höyük bir tümör Bulamaç dokusu ile neşter bıçak ve yavaşça oluşturulan cebine doku yerleştirin.
   7. Cep içinde tümör dokusu Höyüğü üzerinde 100 μL yapay ekstrasellüler matris yönetin.
   8. İki çift forseps kullanarak, yara kenarlarının birbirine yaklaşması ve bir veya iki yara klibi uygulayarak yarayı kapatmak için her iki ucunda kesi çekin.
   9. Subkutan enjekte 1-5 cerrahi sonrası fareler içinde bir analjezik olarak mg/kg Meloksikam.
   10. Burun koni dışarı fare almak ve geri orijinal kafesi içine yerleştirin, uyanırken fareyi gözlemlemek. Tamamen kurtarılana kadar bir kafese dönmeyin.
   11. Yaklaşık 7 gün sonra yara kliplerini çıkarın. 7 gün sonra iyileşme tamamlanırsa, ek bir veya iki gün boyunca yara klibini içeri bırakın.
       Not: cerrahi eksizyon veya cerrahi biyopsi dokusu işlemeden tek bir hücre süspansiyonu kullanıyorsanız, fare enjeksiyonu için yapay hücre içi matris (1:1 oranında) ile karıştırılır.
2. FNA veya çekirdek biyopsi dokusu enjeksiyonu
   1. Bir NSG fareyi çelik ızgara rafa yerleştirin, fareyi sıkıca kuyruğuna tutun ve yavaşça fareyi geri çekin. Ön bacakları sıkıca ızgarayı kavrayacaktır. Alternatif olarak, bir fareyi baskın olmayan elle dizginlemek ve kanat alanının görünür olmasını sağlar.
   2. Alkol hazırlık SWABS ile kanatta cilt dezenfekte, yavaşça ve sürekli fare cilt altında şırınga içeriğini enjekte.
   3. İğneyi çekin ve fareyi geri kafesine yerleştirin.

4. tümör büyümesini izleyin

1. Palpe tümör kontrol etmek için haftalık bir kez monitör fareler.
2. Tümörler ölçülebilir boyutta olduğunda (yaklaşık 50 mm³), tümör boyutlarını kaydetmek için bir Kaliper kullanın. Tümör hacimlerini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın: (genişlik x Genişlik x uzunluk)/2.
3. Tümör hacmi yaklaşık 1,5 cm³ (yaklaşık 4 – 10 hafta) ulaştığında hasat tümörü. Tümör şimdi fare geçişi 1 (MP1) denir.

5. bankacılık dokusu, reimplantasyon ve deney/karakterizasyon için hasat tümörü

1. Bir CO₂ odasında ötenize fare, ölüm onaylamak için hayati işaretler kontrol ve daha sonra Bio-kabine 30 s için cilt sterilize etmek Için bir virkon çözüm fare alt.
2. Tümör bitişik cilt kaldırmak ve yatay bir kesim yapmak için eğri makas ve cerrahi forseps kullanın.
3. Tümörün her iki tarafında ve tümörü ortaya çıkarmak için deriyi seferber etmek için künt bir ayırma tekniği kullanın.
4. Tümör fasya ayırmak için makas veya bir neşter Blade kullanın.
5. Tümörü yeniden seçin ve tümörü steril bir petri tabağına aktarın, tümörü küçük parçalara ayırın ve tümörden nekrotik dokusu çıkarın.
6. Gelecekteki implantasyon için banka tümörü dokusu.
   1. 2-3 küçük tümör parçalarını ~ 10 mm x 10 mm 'den küçük alın ve onları ~ 1 mm x 1 mm 'den küçük parçalara ayırın.
   2. Tüm kıyılmış dokusu 2 mL kriyojenik şişeye aktarın, 1 mL donma ortamı ekleyin (% 10 DMSO + 90% FBS).
   3. İyi karıştırın ve kuru buz üzerinde ön soğutmalı isopropanol tabanlı hücre donma kabı içine kriyojenik şişeleri yerleştirin.
   4. Depo kabı-80 °C ' de dondurucu ve sonra kriyojenik şişeleri sıvı nitrojen (LN₂) depolamaya aktarın.
7. Aşağı akım (RNASeq, WES, vb) için Snap-Freeze doku.
   1. Tümör doku parçalarını (~ 3 mm x 3 mm) kriyojenik şişeye yerleştirin ve kriyojenik şişesini LN₂ ' ye hemen yerleştirin. Depo şişeleri-80 ° c dondurucu.

6. PDX terapi denemeleri

Not: Bu terapi deneme için PDX taşıyan fareler gerekli sayıda oluşturmak için yeterli tümör dokusu büyümek için iki genişleme aşamaları alacaktır.

1. LN₂' den BANKED PDX dokusu içeren bir kriyoşişe alın ve tümör dokusunu içeren donma ortamı erimeye başlayana kadar kriyoşişesini 37 °c ' lik bir su banyosuna yerleştirin.
2. Ön ısıtılmış HBSS içine kriyoşişin içeriğini boşaltın^-/- bir 50 ml tüp içinde, ve yıkama dokusu.
3. 1.200 rpm 'de 5 dakika santrifüjleme ile Pellet dokusu.
4. Bir Pasteur pipet ile vakum aspirasyonu ile tümör örneğinden HBSS^-/- çıkarın.
5. 50 mL tüpünden PDX dokusunu 5 cm veya 10 cm Petri tabağı içine kaydırın ve ıslak buzun üzerine yerleştirin.
6. PDX tümör genişleme ilk turu için 5 NSG fareler içine kriyojenik şişeden banked doku implant için yukarıdaki implantasyon protokolünü izleyin.
7. Tümör doku işleme için yukarıdaki protokol ile tek bir hücre süspansiyon almak için tümörler ~ 600 – 800 mm³, Harvest 1-2 tümör ulaştığında: mekanik ayrışma, kolajenaz sindirim ayrışma prosedürü.
8. Pellet hücreleri ve pelletini 6 ml HBSS^-/-/yapay ekstrellüler matris (1:1 oranı), subkutan enjekte ~ 50 NSG fareler, ile 100 μL hücre karışımı fare başına PDX tümör genişleme ikinci tur için.
9. Ölçme tümör boyutu kaliperler ile biweekly.
10. Bir tümör boyutu için bekleyin ~ 100 mm³ içinde 3-5 hafta, gruplar halinde fareler rastgele ve tedaviye başlayın.
11. Tümör büyüklüğü maksimum ııam-onaylı hacmine ulaştığında, tedaviyi durdurun.
12. Ek dondurulmuş tümör parçaları, parafin blokları için tümör parçaları toplamak için yukarıdaki hasat tümörü protokolünü izleyin.

Sonuçlar

Melanom PDX modelleri için tümör dokusu farklı kaynaklardan çeşitli gelebilir ve aynı zamanda bireysel modellerin büyüme dinamikleri ve PDX doku istenilen kullanımı başına işlenebilir. PDX modeli oluştururken öncelik, gelecekteki kullanım ve DNA karakterizasyonu için banka için yeterli malzemeye sahip olmaktır (Şekil 1).

Yeterli malzeme banked sonra, tümör dokusu resmi bir tedavi çalışması gerçekleştirmek için yeterli tümör büyüme...

Tartışmalar

Burada primer ve metastatik tümörlerden, çekirdek biyopsilerin ve FNAs 'larından elde edilen hasta dokusuyla PDX Melanom modelleri üretilirken tanımlanmıştır. NSG fareler içine doğrudan engreted zaman, tümörlerin benzer morfolojik mevcut, genomik, ve biyolojik özellikleri hastada gözlenen. Sadece küçük bir miktar doku müfettişlere kullanılabilir olduğunda, genellikle FNAs ile ortaya çıktığında, PDX tekniği DNA, RNA ve protein karakterizasyonu için tümör dokusunun genişlemesine ve klinik ö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Cat # 15140163
1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++)	MED	Cat # MT21-023-CV
2.5% Trypsin	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # T4549-100ML	10 mL aliquots stored at –20oC
BSA	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # A9418-500G
Chlorhexidine	Fisher Scientific	Cat# 50-118-0313
Collagenase IV (2,000 u/mL)	Worthington	Cat #4189	make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1
DMSO	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # C6295-50ML
DNase	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # D4527
EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid)	Merck	Cat # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 15290-018
Gentamicin	FISHER SCIENTIFIC	Cat # BW17518Z
Isoflurane	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	Cat # 050031
Leibovitz's L15 media	Invitrogen	Cat # 21083027
Matrigel	Corning	Cat # 354230	Artificial extracellular matrix
Meloxicam	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein	Cat # 025115	1-5mg/kg, as painkiller
NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice	The Wistar Institute, animal facility		breeding
PVA (polyvinyl alcohol)	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine	Fisher Scientific	Cat# MT10041CM
Scalpel	Feather	Cat # 2976-22
Virkon	GALLARD-SCHLESINGER IND	Cat # 222-01-06
Wound clips	MikRon	Cat #427631