Меланома пациента-производные Ксенотрансплантат Модель

Резюме

Пациент полученных ксенотрансплантат (PDX) модели более надежно резюмировать меланомы молекулярных и биологических особенностей и более прогностические терапии ответ по сравнению с традиционными пластиковых тканей культуры на основе анализов. Здесь мы описываем наш стандартный операционный протокол для создания новых моделей PDX и характеристики/экспериментирования существующих моделей PDX.

Аннотация

Накопленные данные свидетельствуют о том, что молекулярные и биологические свойства отличаются в клетках меланомы, выращенных в традиционных двухмерных сосудах культуры тканей по сравнению с in vivo у пациентов с людьми. Это связано с узким местом выбора клональных популяций клеток меланомы, которые могут сильно расти в пробирке при отсутствии физиологических условий. Кроме того, ответы на терапию в двухмерных культурах тканей в целом не точно отражают реакцию на терапию у пациентов с меланомой, при этом большинство клинических испытаний не показывают эффективность терапевтических комбинаций, которые доказали свою эффективность в Пробирке. Хотя ксенотрансплантация клеток меланомы на мышей обеспечивает физиологический контекст виво отсутствует в двухмерных анализов культуры тканей, меланомы клеток, используемых для прививки уже претерпели узкое место выбор для клеток, которые могли бы расти под двумерные условия, когда была установлена клеточная линия. Необратимые изменения, которые происходят в результате узкого места включают изменения в росте и вторжение свойства, а также потери конкретных субпопуляций. Таким образом, модели, которые лучше резюмировать состояние человека in vivo может лучше предсказать терапевтические стратегии, которые эффективно увеличить общую выживаемость пациентов с метастатической меланомы. Методки ксенотранспланта (PDX) пациента включает в себя прямую имплантацию опухолевых клеток от пациента к получателю мыши. Таким образом, опухолевые клетки постоянно выращиваются под физиологическими нагрузками in vivo и никогда не проходят двухмерное узкое место, которое сохраняет молекулярные и биологические свойства, присутствующие при обнаружении опухоли у пациента. Примечательно, что модели PDX, полученные из органов сайтов метастазов (т.е. мозга) отображают аналогичную метастатическую способность, в то время как модели PDX, полученные из терапии наивных пациентов и пациентов с приобретенной устойчивостью к терапии (т.е. бигибаторной терапии BRAF/MEK) отображаются аналогичная чувствительность к терапии.

Введение

Доклинические модели имеют решающее значение для всех аспектов трансляционных исследований рака, включая характеристику болезней, открытие действенных уязвимостей, присущих только раку, по сравнению с нормальными клетками, и развитие эффективных методов лечения, которые эксплуатируют эти уязвимости для повышения общей выживаемости пациентов. В области меланомы, десятки тысяч моделей клеточной линии были в значительной степени использованы для скрининга наркотиков, с йgt;4,000 способствовали только нашей группы (WMXXX серии). Эти модели клеточной линии были получены от пациентов с меланомой с различными формами кожной меланомы (т.е. акрала, увеального и поверхностного распространения) и различных генотипов (т.е. BRAF^V600-мутант и нейробластома РАН вирусный онкоген однородный НРАС ^«61R-мутант»), которые охватывают спектр заболеваний, присутствующих в клинике^1,2.

Однозначно, наиболее успешная, целевая стратегия терапии в области меланомы возникла из 1) геномной характеристики опухолей пациентов, определяющих мутации BRAF в 50% меланомы³ и от 2) доклинического исследования использование меланомы клеточной линии модели⁴. Комбинация ингибитора BRAF/MEK была утверждена Пищевых продуктов и медикаментов (FDA) в 2014 году для лечения пациентов, чья меланома гавани активации BRAF^{V600E / K} мутаций и может похвастаться йgt;75% ответ⁵. Несмотря на эту начальную эффективность, сопротивление быстро возникает почти в каждом случае из-за многогранных внутренних и приобретенных механизмов сопротивления и внутриопухолевой неоднородности. К сожалению, модели клеточных линий не резюмируют репрезентативной биологической неоднородности, когда выращивается в двумерной культуре в пластиковых сосудах, что маскирует их клинически прогностический потенциал, когда исследователи пытаются экспериментально определить терапии, которые могут быть эффективными у пациентов с определенной формой или генотипом меланомы⁶. Понимание того, как лучше моделировать внутриопухолевую неоднородность пациента позволит следователям лучше разработать терапевтические методы, которые могут убить устойчивых к терапии субпопуляций, которые приводят к неспособности к текущим стандартам лечения.

Первостепенное значение ограниченного прогностического значения моделей клеточной линии — это то, как они изначально устанавливаются. Необратимые изменения происходят в клональном ландшафте опухоли, когда одноклеточная суспензия опухоли пациента выращивается на двухмерных, сосудах культуры пластиковой ткани, включая изменения в пролиферативном и инвазивном потенциале, устранение специфических субпопуляций, и изменение генетической информации⁷. Xenografts в мышей этих моделей линии клетки меланомы представляют наиболее часто используемые в vivo платформа для preclinical изучений; однако, эта стратегия также страдает от плохой перепросмотра сложной неоднородности опухоли наблюдается клинически. Чтобы преодолеть этот недостаток, наблюдается растущий интерес к включению более сложных доклинических моделей меланомы, включая модель PDX. Модели PDX были использованы для йgt;30 лет, с семенных исследований в больных раком легких, демонстрирующих соответствие между ответом пациентов на цитотоксические агенты и ответ модели PDX, полученных от того же пациента⁸. В последнее время наблюдается стремление использовать модели PDX в качестве инструмента выбора для доклинических исследований как в промышленности, так и в академических центрах. Модели PDX, из-за их превосходной перепросмотра неоднородности опухоли у пациентов, более клинически уместны для использования вусилиях оптимизации терапии чем xenografts линии клетки 9. В меланоме, Есть огромные препятствия, которые тупой терапевтического управления передовых заболеваний¹⁰. Клинически значимые модели PDX были использованы для моделирования клинической резистентности и определения терапевтических стратегий с клинически доступными агентами для лечения устойчивых к терапии опухолей^11,12. Кратко, протокол представленный здесь для того чтобы произвести модели PDX требует subcutaneous имплантации свежей ткани от главным образом или метастатических меланом (собранных биопсией или хирургией) в NOD/scid/IL2-рецептор null (NSG) мышей. Различные различия в методологическом подходе используются различными группами; однако, фундаментальное ядро существует¹³.

протокол

Следующие протоколы животных следуют руководящим принципам комитета по гуманной этике Института Вистара и руководящим принципам по уходу за животными.

1. Сбор опухолевых тканей меланомы

1. Соберите опухолевую ткань (термин "переход 0") у пациентов с меланомой одним из следующих методов операции или биопсии.
   1. Для хирургической ткани иссечения, поддерживать не менее 1 г ткани (резекта метастазы и первичные поражения) в транспорте хранения средств (RPMI 1640 0,1% грибковзон 0,2% гентамицин) при 4 градусах Цельсия или на льду.
   2. Для хирургической биопсии ткани, поддерживать менее 1 г ткани (часто удар биопсии подкожных метастазов и лимфатических узлов (LN) в транспорте хранения средств хранения при 4 градусах Цельсия или на льду.
   3. Для основной ткани биопсии промыть цилиндр (ядро) ткани примерно 10 мм х 1 мм (часто, биопсия печени) в трубку 15 мл, содержащую 5 мл транспортных носителей хранения при 4 c или на льду.
   4. Для тонкой иглы аспират (FNAs) ткани, держать очень небольшое количество ткани (менее 1 мм в размере), принятых непосредственно от пациента в иглы и шприца при 4 кв или на льду.
2. Доставка ткани в транспорте хранения средств на 4 кв или на льду в тот же день или с ночной доставкой после хирургического иссечения или биопсии. Обработка ткани в течение 1-2 ч от доставки.

2. Обработка опухолевых тканей для имплантации мыши

1. Хирургическое иссечение или хирургическая обработка биопсии
   1. Перенесите ткань в стерильную чашку Петри и отделите опухолевую ткань от окружающих нормальных тканей как можно больше.
   2. Удалить некротической ткани (как правило, определены как бледно-ватные ткани, расположенные в центре опухоли) из оставшейся опухоли как можно больше.
   3. Используйте скальпель, чтобы разделить первоначальный кусок опухоли примерно на равные части (3 мм х 3 мм) для хирургической имплантации мыши(рисунок 2).
   4. Дополнительно, если достаточно опухолевой ткани доступна, оснастки заморозить ткани для вниз по течению анализы (РНК секвенирования "RNASeq", весь exome секвенирования "WES" и т.д.).
   5. Сделать опухолевую суспензию, сбивая опухолевую ткань с помощью техники перекрестного лезвия с двумя скальпелями. Фарш опухоли куски как можно лучше сформировать суспензию, которая теперь готова для хирургической имплантации мыши.
   6. Кроме того, если опухолевая ткань слишком сложна для механической диссоциации, используйте процедуру диссоциации пищеварения, чтобы сформировать гель-подобную суспензию и одноклеточную подвеску для имплантации и/или инъекции.
      1. Фарш опухоли куски как можно штрафом, чтобы сформировать суспензию.
      2. Положите суспензию в трубку 50 мл с сбалансированным солевой раствором (HBSS) (HBSS)^-/- (без Каи и Мг); затем, центрифуга и гранулы на 220 х г в течение 4 мин при 4 градусах Цельсия.
      3. Приостанавливайте суспензию в 10 мл разогретого свежего дайджеста (200 U/mL коллагеназiv IV 5 мМ CaCl₂ 50 U/mL DNase в HBSS^-/)) на 1 г опухолевой ткани.
      4. Поместите трубку в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут и энергично перемешайте каждые 5 минут с одноразовой пипеткой.
      5. Вымойте до 50 мл HBSS^-/-; затем, центрифуга на 220 х г в течение 4 мин при 4 c.
      6. Добавьте 5 мл претепловой TEG (0,025% трипсин и 40 мкг/мЛ этилен гликоль-бис (з-аминоэтил эфир)-N,N,N',N',N',N'-тетраацетической кислоты (EGTA) аккуратно отрежь /встряхните, и поместите трубку на 37 градусов по Цельсию в течение 2 минут без смешивания.
      7. Добавить по крайней мере 1 равный объем холодных окрашивания средств (1% бычьего сыворотки альбумина »BSA» 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетанесульфоновая кислота «HEPES» 1x пениколлин-стрептомицин в L15 media) чтобы утолить трипсин и центрифуги на 20. C.
      8. Resuspend образец в 10 мл окрашивающих средств на 1 г опухолевой ткани и фильтровать его через 40 мкм ячейки ситечко, чтобы получить одноклеточную подвеску для инъекций мыши (Рисунок 2).
      9. Суспензия, оставшаяся на верхней части клеточного ситеча, также может быть собрана для хирургической имплантации мыши.
2. C обработка рудной биопсии тканей
   1. Налейте основной ткани цилиндра в ткани-транспортная трубка в 5 см Чашка Петри.
   2. Удалить лишнюю жидкость, соскребать ткани к краю чашки Петри, мелко фарш опухолевой ткани, добавить 100-150 л HBSS^-/- на верхней части ткани опухоли, и быстро обратить HBSS / опухоли ткани подвески в 1 мл шприц.
   3. Прикрепите 23 G иглу к шприцу 1 мл, передайте hBSS/tumor tissue suspension через иглу в 1,5 мл спиновой трубки.
   4. Перерисовывайте суспензию опухоли в шприц с иглой, пока она не пройдет гладко через иглу.
   5. Наконец обратить опухоли подвески обратно в шприц и отсоединить 23 G иглы.
   6. Прикрепите иглу 27 G и нарисуйте в шприц одинаковый объем (100–150 л) искусственной внеклеточной матрицы (см. таблицуматериалов).
   7. Добавьте равный объем искусственной внеклеточной матрицы медленно в 1,5 мл спиновой трубки с опухолью/HBSS^-/- подвеской, тщательно избегая образования пузырьков.
   8. Нарисуйте последний раз обратно в шприц и основной ткани опухоли биопсии теперь готов к инъекции мыши.
3. Обработка тканей FNA
   1. Поместите шприц, содержащий образцы FNA (застряв в игле) на льду.
   2. Отделите иглу (содержащую ткань FNA) от шприца и удалите поршень из шприца, добавьте 150-200 л HBSS^-/- к верхней части шприца.
   3. Повторно вставьте поршень в шприц и иглу (содержащую ткань FNA), и вытолкнуть HBSS^-/- через иглу в 1,5 мл спиновой трубки. Этот шаг удаляет опухоль FNA из иглы.
   4. Повторите шаг 2.3.3 с HBSS^-/-/FNA подвески дважды с помощью одного и того же шприца, чтобы максимизировать извлечение опухолевой ткани из иглы.
   5. Добавьте равный объем (100–150 л) искусственной внеклеточной матрицы к спиновой трубке объемом 1,5 мл, содержащей подвеску HBSS/FNA.
   6. Адекватно смешивать, медленно составление искусственной внеклеточной матрицы / HBSS^-/-/FNA подвески обратно в 23 G иглы и повторять дважды.
   7. Нарисуйте всю искусственную внеклеточную матрицу/HBSS^-/-/FNA объем обратно в шприц, замените 23 G иглу с иглой 27 G, и образец FNA теперь готов для инъекций мыши.

3. Имплантация опухолей и инъекция у мышей

1. Имплантация хирургического иссечения или хирургической биопсии
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все хирургические инструменты стерильны путем автоклавирования или использования предварительно стерилизованных одноразовых инструментов.
   1. Бритье волос из нижней части nsG 6-8 недель мышей мужского или женского пола оставляя примерно 1,5 см х 3 см области без волос. Анестезить мышей с помощью изофлюран, и подтвердить, мягко сжимая ногу в качестве теста отзывчивости. Используйте ветеринарную мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость.
   2. Поместите отдельных мышей на тепловую площадку в носовой конус анестезии машины, скраб бритая область с хлоргексидином. Затем облить 70% этанола и дать испариться.
   3. Подготовка куски или разделить опухолевую суспензию в чашке Петри на отдельные насыпи для хирургической имплантации (т.е. на три равные насыпи, если быть имплантированным в 3 мышей).
   4. Используя скальпельное лезвие, сделайте разрез длиной около 5 мм по центру задней части мыши, возьмите одну пару щипц и поднимите кожу на стороне разреза, противоположного оператору.
   5. Возьмите ножницы в другую руку и отделить кожу от мышечного слоя, мягко резки фасциальной мембраны с небольшими ножницами сокращений, тем самым создавая "карман" для опухолевой ткани.
   6. Возьмите один кусок опухоли или один отдельный насыпь ткани суспензии скальпеля и аккуратно место ткани в созданный карман.
   7. Администрирование 100 зл искусственной внеклеточной матрицы на насыпи опухолевой ткани в кармане.
   8. Используя две пары щипцы, подтяните разрез на обоих концах так, чтобы края раны сблизились, и закройте рану, применяя одну или две зажимы.
   9. Подкожный вводят 1-5 мг/кг мелоксикама в качестве анальгетика у мышей после операции.
   10. Возьмите мышь из конуса носа и поместите его обратно в свою первоначальную клетку, наблюдать за мышью во время пробуждения. Не возвращайтесь в клетку, пока полностью не выздоровеет.
   11. Удалите раны клипы примерно через 7 дней. Если заживление не завершено через 7 дней, оставьте рану клипа в течение дополнительных одного или двух дней.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании одной клеточной подвески от хирургического иссечения или хирургической обработки биопсии ткани, он будет смешиваться с искусственной внеклеточной матрицы (в соотношении 1:1) для инъекций мышей.
2. Инъекция ФНА или основной биопсии ткани
   1. Поместите мышь NSG на стальную стойку сетки, держите мышь крепко за хвост и осторожно потяните мышь назад. Он будет хватать сетку с его передними ногами твердо. Кроме того, сдержать мышь в недоминирующей стороны и пусть фланг области видны.
   2. Дезинфицировать кожу фланга спиртными подготовительными тампонами, медленно и неуклонно впрыскивать содержимое шприца под кожу мыши.
   3. Вытяните иглу и поместите мышь обратно в клетку.

4. Мониторинг роста опухоли

1. Мониторинг мышей один раз в неделю, чтобы проверить на ощутимые опухоли.
2. После того, как опухоли находятся на измеримых размеров (примерно 50 мм³), используйте caliper для записи размеров опухоли. Используйте следующую формулу для расчета объемов опухоли: (ширина x ширина x длина) / 2.
3. Урожай опухоли, как только объем опухоли достигает около 1,5 см³ (примерно 4-10 недель). Опухоль теперь называется мышью проход 1 (MP1).

5. Опухоль урожая для банковской ткани, реимплантации и эксперимента/характеристики

1. Эвтаназия мышь в камере CO 2, проверить жизненно важные признаки, чтобы подтвердить смерть, а затем погрузить мышь в раствор Virkon стерилизовать кожу в течение 30 с в био-кабинет.
2. Используйте изогнутые ножницы и хирургические щипцы, чтобы поднять кожу рядом с опухолью и сделать горизонтальный разрез.
3. Используйте тупой метод разделения, чтобы мобилизовать кожу с обеих сторон опухоли и над опухолью, подвергая опухоли.
4. Используйте ножницы или скальпель нопасти, чтобы отделить опухоль от фасции.
5. Пересектировать опухоль и перенести опухоль в стерильную чашку Петри, разрезать опухоль на мелкие кусочки и удалить некротические ткани из опухоли.
6. Банковская опухолевая ткань для будущей имплантации.
   1. Возьмите 2-3 небольших опухолевых кусочка меньше, чем 10 мм х 10 мм, и фарш их на кусочки меньше, чем 1 мм х 1 мм.
   2. Перенесите всю рубленую ткань в криогенный флакон 2 мл, добавьте 1 мл замораживающих носителей (10% DMSO и 90% FBS).
   3. Хорошо перемешайте и поместите криогенные флаконы в предварительно охлажденный изопропанол на основе клеточного замораживания контейнера на сухом льду.
   4. Храните контейнер в морозильной камере -80 градусов на ночь, а затем перенесите криогенные флаконы в жидкое азот (LN₂) на хранение.
7. Привязка-замораживание ткани для ниже по течению анализы (RNASeq, WES и т.д.).
   1. Поместите кусочки опухолевой ткани (3 мм х 3 мм) в криогенный флакон и немедленно поместите криогенный флакон в LN_2. Храните флаконы в морозильной камере -80 градусов.

6. PDX терапии испытаний

ПРИМЕЧАНИЕ: Это займет две фазы расширения расти достаточно опухолевых тканей для создания необходимого количества PDX подшипников мышей для терапии суда.

1. Возьмите криовые содержащие накренился PDX ткани из LN₂, и место кривиной в 37 градусов по Цельсию водяной бане до замораживания средств, содержащих опухолевой ткани только начинает таять.
2. Опорожните содержимое криового в предварительно разогретый HBSS^-/- в трубке 50 мл, и мыть ткани.
3. Ткань пеллеты центрифугированием в течение 5 мин при 1200 об/мин.
4. Удалить HBSS^-/- из образца опухоли путем вакуумного аспирации с трубой Pasteur.
5. Сдвиньте ткань PDX из трубки 50 мл в тарелку Петри на 5 см или 10 см и поместите на мокрый лед.
6. Следуйте вышеупомянутому протоколу имплантации, чтобы имплантировать накренченную ткань из криогенного флакона в 5 мышей NSG для первого раунда расширения опухоли PDX.
7. Как только опухоли достигают 600-800 мм^3,урожай 1-2 опухоли, чтобы получить одну клеточную подвеску с вышеуказанным протоколом для обработки опухолевых тканей: механическая диссоциация, процедура диссоциации коллагеназа.
8. Клетки пеллет и resuspend в 6 мл HBSS^-/-/искусственной внеклеточной матрицы (1:1 соотношение), подкожный инъекционные мыши N50 NSG, с 100 л клеточной смеси на мышь для второго раунда расширения опухоли PDX.
9. Измеряйте размер опухоли с помощью калиперов раз в две недели.
10. Подождите, пока опухоль размером 100 мм³ в 3-5 недель, рандомизации мышей в группы, и начать лечение.
11. Когда размер опухоли достигает максимального объема, одобренного IACUC, прекратите лечение.
12. Следуйте выше протокол опухоли урожая, чтобы собрать оснастки замороженных опухолей, опухоли частей для парафин блоков.

Результаты

Опухолевые ткани для меланомы PDX модели могут поступать из различных источников, а также могут быть обработаны в динамике роста отдельных моделей и желаемого использования ткани PDX. Приоритет при создании модели PDX заключается в том, чтобы иметь достаточно материала для банка для будущ?...

Обсуждение

Мы описали генерацию МОДЕЛЕй pdX меланомы с тканью пациента, полученной из первичных и метастатических опухолей, основных биопсий и FNAs. При непосредственном привитом в NSG мышей, опухоли представляют аналогичные морфологические, геномные и биологические свойства для тех, наблюдается у п?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Cat # 15140163
1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++)	MED	Cat # MT21-023-CV
2.5% Trypsin	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # T4549-100ML	10 mL aliquots stored at –20oC
BSA	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # A9418-500G
Chlorhexidine	Fisher Scientific	Cat# 50-118-0313
Collagenase IV (2,000 u/mL)	Worthington	Cat #4189	make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1
DMSO	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # C6295-50ML
DNase	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # D4527
EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid)	Merck	Cat # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 15290-018
Gentamicin	FISHER SCIENTIFIC	Cat # BW17518Z
Isoflurane	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	Cat # 050031
Leibovitz's L15 media	Invitrogen	Cat # 21083027
Matrigel	Corning	Cat # 354230	Artificial extracellular matrix
Meloxicam	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein	Cat # 025115	1-5mg/kg, as painkiller
NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice	The Wistar Institute, animal facility		breeding
PVA (polyvinyl alcohol)	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine	Fisher Scientific	Cat# MT10041CM
Scalpel	Feather	Cat # 2976-22
Virkon	GALLARD-SCHLESINGER IND	Cat # 222-01-06
Wound clips	MikRon	Cat #427631