흑색종 환자 유래 이종이식 모델

요약

환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 흑색종 분자 및 생물학적 특징을 보다 강력하게 회귀하고 기존의 플라스틱 조직 배양 계 세포 에 비해 치료 반응의 더 예측이다. 여기서는 새로운 PDX 모델 의 확립과 기존 PDX 모델의 특성화/실험에 대한 표준 운영 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

축적 된 증거는 분자 및 생물학적 특성이 인간 환자에서 생체 내에서 대 전통적인 2 차원 조직 배양 혈관에서 성장 흑색종 세포에서 다르다는 것을 시사한다. 이것은 생리적인 조건의 부재에 있는 시험관에서 강력하게 증가할 수 있는 흑색종 세포의 클론 인구의 병목 현상 선택 때문입니다. 또한, 2차원 조직 배양에서의 치료에 대한 반응은 전체적으로 흑색종 환자의 치료에 대한 반응을 충실하게 반영하지 못하며, 대부분의 임상 시험에서 치료 조합의 효능을 보여주지 못하는 것으로 나타났다. 체 외. 마우스로 흑색종 세포의 이종이식은 2차원 조직 배양 실험에서 결석한 생체내 문맥을 제공하지만, 생착에 사용되는 흑색종 세포는 이미 밑에 성장할 수 있는 세포를 위한 병목 현상 선택을 겪었습니다 세포주가 확립되었을 때 2차원 조건. 병목 현상의 결과로 발생하는 돌이킬 수없는 변경은 성장 및 침략 특성의 변화뿐만 아니라 특정 하위 집단의 손실을 포함합니다. 따라서 생체 내에서 인간의 상태를 더 잘 재현하는 모델은 전이성 흑색종을 가진 환자의 전반적인 생존을 효과적으로 증가시키는 치료 전략을 더 잘 예측할 수 있다. 환자 유래 이종이식(PDX) 기술은 인간 환자로부터 마우스 수용자로 종양 세포를 직접 이식하는 것을 수반한다. 이러한 방식으로, 종양 세포는 생체 내에서 생리적 스트레스 하에서 일관되게 성장하며, 종양이 인간 환자에 있을 때 존재하는 분자 및 생물학적 특성을 보존하는 2차원 병목 현상을 겪지 않습니다. 주목할만한, 전이의 장기 사이트에서 파생 된 PDX 모델 (즉, 뇌) 유사한 전이 용량을 표시, 치료 순진한 환자와 치료에 후천성 저항 환자에서 파생 된 PDX 모델 동안 (즉, BRAF / MEK 억제제 치료) 디스플레이 치료에 유사한 감도.

서문

전임상 모델은 질병 특성화, 암과 정상 세포에 고유한 실행 가능한 취약성 발견, 악용하는 효과적인 치료법 의 개발을 포함한 번역암 연구의 모든 측면에 매우 중요합니다. 환자의 전반적인 생존을 증가시키기 위해 이러한 취약점. 흑색종 필드에서, 수만개의 세포주 모형은 약 검열을 위해 무겁게 이용되었습니다, 와 함께 >4,000 혼자 우리 단에 의해 기여했습니다 (WMXXX 시리즈). 이러한 세포주 모델은 다양한 형태의 종족 흑색종(즉, 아크랄, 포벨 및 피상적 확산) 및 다양한 유전자형(즉, BRAF^V600-돌연변이 체종 및 신경아세포종 RAS 바이러스 성 종양유전자)을 가진 흑색종 환자로부터 유래되었다. NRA ^Q61R-돌연변이]), 이는 클리닉^1,2에존재하는 질병의 스펙트럼에 걸쳐.

명백하게, 흑색종 필드에 있는 가장 성공적인, 표적으로 한 치료 전략은 1) 흑색종의 ~50%에서 BRAF 돌연변이를 확인하는 환자의 종양의 게놈 특성에서 나타났습니다³ 그리고 2) 전임상 조사에서 흑색종 세포주 모델을활용 4. BRAF/MEK 억제제 조합은 2014년 미국 식품의약국(FDA)에서 BRAF ^V600E/K 돌연변이를 활성화시키는 흑색종 항적 환자의 치료를 위해 승인되었으며>75% 응답률^5를자랑한다. 이 초기 효험에도 불구하고, 저항은 다방면의 본질적이고 취득한 저항 기계장치 및 종양 내 이질성 때문에 거의 모든 경우에 급속하게 생깁니다. 불행히도, 세포주 모델은 플라스틱 용기에서 2차원 배양으로 재배될 때 대표적인 생물학적 이질성을 되풀이하지 않으며, 이는 조사자가 실험적으로 결정하려고 할 때 임상적으로 예측 잠재력을 가리는 것입니다. 흑색종의 특정 양식 또는 유전자형을 가진 환자에서 효과적일 지도 모르다 치료^6. 환자를 가장 잘 모델링하는 방법을 이해하면 조사자가 현재 의 치료 표준 치료에 실패를 유도하는 치료 저항하는 하위 집단을 죽일 수 있는 치료 양식이 더 잘 개발될 수 있습니다.

세포주 모델의 제한된 예측 값에 가장 중요한 것은 세포주 모델이 처음 확립되는 방식입니다. 환자의 종양의 단세포 현탁액이 증식 및 침습적 잠재력의 변화를 포함하여 2 차원, 플라스틱 조직 배양 혈관에서 성장할 때 돌이킬 수없는 변화는 종양 클론 풍경에서 발생하며, 특정의 제거 유전 정보의 변경^7. 이러한 흑색종 세포주 모델의 마우스로의 이종이식은 전임상 연구를 위해 생체내에서 가장 빈번히 사용되는 것을 나타낸다; 그러나, 이 전략은 또한 임상적으로 관찰된 복잡한 종양 이질성의 가난한 재발로부터 고통받고 있다. 이 결점극복하기 위하여는, PDX 모형을 포함하여 흑색종의 더 정교한 전임상 모형을 통합에 있는 증가관심사가 증가하고 있습니다. PDX 모델은 30년 동안 활용되어 왔으며, 폐암 환자에서 세포독성 제제에 대한 환자의 반응과 동일한 환자로부터 유래된 PDX 모델의 반응사이의 일치를 입증하는 정액 연구와 함께 8. 최근에는 PDX 모델을 업계와 학술 센터 모두에서 전임상 조사를 위한 도구로 활용하려는 드라이브가 있었습니다. PDX 모델은 인간 환자에서 종양 이질성의 우수한 재항복 때문에, 세포주 이종이식9보다 치료 최적화 노력에 보다 임상적으로관련이 있다. 흑색종에서는, 향상된 질병^10의치료 관리를 무디게 하는 거대한 장애물이 있습니다. 임상적으로 관련있는 PDX 모델은 임상 내성을 모델링하고 치료 내성 종양을 치료하기 위해 임상적으로 이용 가능한 제제와 치료 전략을 식별하는 데 사용되어 왔다^11,12. 간단히, PDX 모델을 생성하기 위해 여기에 제시된 프로토콜은 NOD/scid/IL2 수용체 널(NSG) 마우스로 1차 또는 전이성 흑색종(생검 또는 수술에 의해 수집)으로부터 신선한 조직의 피하 이식을 요구한다. 방법론적 접근법의 다른 변형은 다른 그룹에서 사용됩니다. 그러나 기본 핵심은¹³.

프로토콜

다음 동물 프로토콜은 Wistar 연구소의 인도적 윤리 위원회 및 동물 관리 지침의 지침을 따릅니다.

1. 흑색종 종양 조직 수집

1. 다음 수술 방법 중 하나에 의해 흑색종 환자로부터 종양 조직(계발 된 통로 0)을 수집합니다.
   1. 외과 적 절제 조직의 경우, 4 °C 또는 얼음에서 수송 저장 매체 (RPMI 1640 + 0.1 % 진균 존 + 0.2 % 젠타미신)에서 최소 1 g의 조직 (절제 전이 및 1 차 병변)을 유지하십시오.
   2. 외과 생검 조직의 경우, 4 °C 또는 얼음에서 수송 저장 매체에서 1g 미만의 조직 (종종 피하 [s.c.] 전이 및 림프절 [LN] 전이의 생검을 펀치)로 유지하십시오.
   3. 핵심 생검 조직의 경우, 약 10 mm x 1mm (종종 간 생검)의 실린더 (코어)를 4 °C 또는 얼음에서 5 mL의 수송 저장 매체를 포함하는 15 mL 튜브로 씻어 냅니다.
   4. 미세 바늘 흡인 (FNA) 조직의 경우, 4 °C 또는 얼음에 바늘과 주사기에서 환자에게서 직접 가져온 매우 적은 양의 조직 (크기 1mm 미만)을 유지하십시오.
2. 4°C또는 같은 날 얼음에 또는 수술 절제 또는 생검 후 야간 배송으로 운반 저장 매체에 조직을 전달합니다. 전달의 1-2 시간 이내에 조직을 처리하십시오.

2. 마우스 이식용 종양 조직 처리

1. 외과 절제 또는 외과 생검 조직 처리
   1. 멸균 페트리 접시에 조직을 전송하고 가능한 한 주변 정상 조직에서 종양 조직을 분리.
   2. 가능한 한 나머지 종양에서 괴사 조직 (일반적으로 종양 내 중앙에 위치한 창백한 희끄무레한 조직으로 확인됨)을 제거하십시오.
   3. 메스를 사용하여 초기 종양 덩어리를 수술용 마우스 이식용(~3mm x 3mm)과 거의 동일한 조각으로 세분화합니다(그림 2).
   4. 선택적으로, 충분한 종양 조직을 사용할 수 있는 경우, 하류 분석(RNA 시퀀싱[RNASeq], 전체 엑솜 시퀀싱[WES]등)에 대한 조직을 스냅 동결한다.
   5. 두 개의 메스 블레이드와 크로스 블레이드 기술을 사용하여 종양 조직을 다진하여 종양 슬러리를 만듭니다. 종양 덩어리를 가능한 한 미세하게 잘라 슬러리를 형성하여 수술 용 마우스 이식준비가되었습니다.
   6. 또는 종양 조직이 기계적 해리를 위해 너무 단단한 경우에, 이식 해리 절차를 사용하여 젤 같이 슬러리와 이식 및/또는 주입을 위한 단세포 현탁액을 형성합니다.
      1. 슬러리를 형성하기 위해 가능한 한 미세하게 종양 덩어리를 다진다.
      2. 차가운 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)^-/- (Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺없이)와 50 mL 튜브에 슬러리를 넣어; 이어서, 원심분리기 및 펠릿을 220 x g에서 4°C에서 4분 동안.
      3. 10 mL의 따뜻한 신선한 다이제스트 미디어 (200 U / mL 콜라게나제 IV + 5 mM CaCl₂ + HBSS에서 50 U / mL DNase^)의10 mL에서 슬러리를 다시 일시 중단하십시오.
      4. 튜브를 37°C 수조에 20분 동안 놓고 일회용 파이펫으로 5분마다 힘차게 섞습니다.
      5. 최대 50 mL의 HBSS로 세척하십시오^./-; 그런 다음, 4 °C에서 4 분 동안 220 x g에서 원심 분리기를.
      6. 종양 조직 1g당 5 mL의 미리 따뜻화된 TEG(0.025% 트립신 + 40 μg/mL 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N', N',N',N',N',N',N',N',N',N',N'-tetraacetic 산 [EGTA] + 10 μg/mL 폴리비닐 알코올 [PVA])를 추가, 부드럽게 다시 일시 중단 / 흔들어, 혼합하지 않고 2 분 동안 37 °C에서 튜브를 배치합니다.
      7. 40°C에서 트립신과 센츄리에서 트립신과 센트리푸리에 대해 40°F의 페니실린-스트렙토미신을 담금질하기 위해 적어도 1개의 동일한 볼륨의 콜드 스테인링 미디어(1% 소 혈청 알부민 [BSA] + 10 mM 4--1-1-피페라진에설포닉산 [HEPES] + 1x 페니실린-스트렙토미신을 4°F에서 담금하기 위해 C.
      8. 종양 조직 1g당 염색 매체의 10 mL에서 샘플을 재중단하고 마우스 주입을 위한 단일 세포 현탁액을 얻기위해 40 μm 세포 스트레이너를 통해 필터링합니다(그림 2).
      9. 세포 스트레이너 의 상부에 남아있는 슬러리는 또한 외과 마우스 이식을 위해 수집될 수 있다.
2. C (것)에 광석 생검 조직 처리
   1. 5cm 페트리 접시에 조직 수송 튜브에 코어 실린더 조직을 부어.
   2. 여분의 액체를 제거하고, 페트리 접시의 가장자리에 조직을 긁어 내고, 종양 조직을 잘게 다진 다음 종양 조직 위에 HBSS^-/-의 ~100-150 μL을 추가하고, HBSS /종양 조직 현탁액을 1 mL 주사기에 신속하게 그립니다.
   3. 1 mL 주사기에 23G 바늘을 부착하고 바늘을 통해 HBSS / 종양 조직 현탁액을 1.5 mL 스핀 튜브로 전달하십시오.
   4. 바늘을 통해 원활 하 게 통과 할 수 있을 때까지 바늘을 계속 주사기에 종양 현탁액을 다시 그립니다.
   5. 마지막으로 종양 현탁액을 주사기로 다시 끌어와서 23G 바늘을 분리합니다.
   6. 27 G 바늘을 부착하고 인공 세포 외 매트릭스의 동일한 부피 (~100-150 μL)를 주사기에 그립니다 (재료 표참조).
   7. 종양/HBSS^-/- 현탁액으로 1.5 mL 스핀 튜브에 인공 세포 외 매트릭스의 동일한 볼륨을 천천히 추가하여 거품 형성을 조심스럽게 피하십시오.
   8. 마지막으로 주사기로 다시 그려핵심생검 종양 조직은 이제 마우스 주입을 위한 준비가 되었습니다.
3. FNA 조직 처리
   1. FNA 샘플을 함유한 주사기를 얼음 위에 놓습니다(바늘에 갇혀 있음).
   2. 주사기에서 바늘 (FNA 조직을 함유)을 분리하고 주사기에서 플런저를 제거하고 HBSS의 ~ 150-200 μL을 주사기의 상단에 추가합니다.
   3. 주사기와 바늘 (FNA 조직 포함)에 플런저를 다시 삽입하고 바늘을 통해 HBSS를 밀어 1.5 mL 스핀 튜브로 밀어 넣습니다. 이 단계는 바늘에서 FNA 종양을 제거합니다.
   4. 2.3.3 단계를 동일한 주사기를사용하여 HBSS-/--/FNA 현탁액을 두 번 반복하여 바늘로부터 종양 조직의 회수를 최대화한다.
   5. HBSS/FNA 현탁액을 함유한 1.5mL 스핀 튜브에 인공 세포외 매트릭스의 동일한 부피(~100-150 μL)를 추가합니다.
   6. 인공 세포 외 매트릭스 /HBSS^-/-/FNA 현탁액을 23 G 바늘에 다시 그리고 두 번 반복하여 적절하게 혼합하십시오.
   7. 전체 인공 세포 외 매트릭스 /HBSS^-/-/FNA 볼륨을 주사기로 다시 그리고 23G 바늘을 27G 바늘로 교체하고 FNA 샘플을 마우스 주입을 위해 준비했습니다.

3. 마우스에 종양 이식 및 주입

1. 외과 절제 또는 외과 생검 조직의 이식
   참고: 모든 수술 기구는 오토클레이브 또는 사전 멸균 된 일회용 기기의 사용에 의해 멸균되어 있는지 확인하십시오.
   1. NSG 6-8 주 남성 또는 암컷 마우스의 하부 에서 머리를 면도 약 1.5 cm x 3 cm 영역없이 머리. 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시키고, 반응성 테스트로 발을 부드럽게 압박하여 확인한다. 건조를 방지하기 위해 눈의 수의사 연고를 사용하십시오.
   2. 마취 기계의 코 콘에 열 패드에 개별 마우스를 놓고, 클로르헨시딘으로 면도 부위를 문질러. 그런 다음 70 % 에탄올을 사용하고 증발할 수 있습니다.
   3. 페트리 접시에 종양 슬러리를 준비하거나 수술 이식을 위해 개별 마운드로 나누어 놓습니다 (즉, 3 개의 마우스에 이식될 경우 3 개의 동일한 마운드로).
   4. 메스 블레이드를 사용하여 마우스 뒷면 중앙에 약 5mm 길이의 절개를 하고 한 쌍의 포셉을 가져 와서 작업자의 반대쪽 절개 측면에 있는 피부를 들어 올립니다.
   5. 다른 손으로 가위를 가지고 부드럽게 작은 가위 컷으로 근막 막을 절단하여 근육 층에서 피부를 분리하여 종양 조직에 대한 "주머니"를 만듭니다.
   6. 메스 블레이드로 하나의 종양 덩어리 또는 종양 슬러리 조직의 하나의 개별 마운드를 선택하고 부드럽게 생성 된 주머니에 조직을 배치합니다.
   7. 주머니에 종양 조직 마운드에 인공 세포 외 매트릭스의 100 μL을 관리.
   8. 두 쌍의 집게를 사용하여 양쪽 끝에 절개를 당겨 상처 가장자리가 서로 가깝게 되도록하고 하나 또는 두 개의 상처 클립을 적용하여 상처를 닫습니다.
   9. 피하 주사 1-5 mg/kg 멜 록시캄 수술 후 쥐에 진통제로.
   10. 코 콘에서 마우스를 꺼내 원래 케이지에 다시 배치, 깨어있는 동안 마우스를 관찰. 완전히 회복될 때까지 케이지로 돌아가지 마십시오.
   11. 약 7일 후에 상처 클립을 제거합니다. 치유가 7 일 후에 완료되지 않으면 상처 클립을 추가로 1 ~ 2 일 동안 그대로 둡니다.
       참고 : 외과 적 절제 또는 수술 생검 조직 처리에서 단일 세포 현탁액을 사용하는 경우, 그것은 마우스 주입을위한 인공 세포 외 매트릭스 (1 :1 비율)와 혼합됩니다.
2. FNA 또는 핵심 생검 조직의 주입
   1. NSG 마우스를 강철 그리드 랙에 놓고 마우스를 꼬리로 단단히 잡고 마우스를 부드럽게 뒤로 당깁니다. 앞다리로 격자를 단단히 잡습니다. 또는, 비 지배적 인 손에 마우스를 억제하고 측면 영역이 표시할 수 있습니다.
   2. 알코올 준비 면봉으로 측면의 피부를 소독하고 마우스 피부 아래에 주사기의 내용체를 천천히 꾸준히 주입하십시오.
   3. 바늘을 당겨 서 다시 케이지에 마우스를 놓습니다.

4. 종양 성장을 모니터링

1. 쥐를 매주 한 번 모니터링하여 만져볼 수 있는 종양을 확인합니다.
2. 일단 종양이 측정 가능한 크기 (대략 50mm 3)에, 종양 치수를 기록하기 위하여 캘리퍼스를 이용하십시오. 다음 수식을 사용하여 종양 체적을 계산합니다: (너비 x 너비 x 길이) / 2.
3. 종양 부피가 약 1.5 cm³ (약 4-10 주)에 도달하면 종양을 수확하십시오. 종양은 지금 마우스 통로 1 (MP1)에게 불립니다.

5. 은행 조직, 재착착 및 실험 /특성화를위한 종양 수확

1. _CO2 챔버에서 마우스를 안락사시키고, 생체 신호를 확인하여 사망을 확인한 다음, 버콘 용액에 마우스를 담그고 바이오 캐비닛에서 30s의 피부를 살균합니다.
2. 구부러진 가위와 수술용 집게를 사용하여 종양 에 인접한 피부를 들어 올리고 수평 절단을 합니다.
3. 무딘 분리 기술을 사용하여 종양의 양면과 종양 의 피부를 동원하여 종양을 노출시다.
4. 가위 또는 메스 블레이드를 사용하여 종양을 근막에서 분리하십시오.
5. 종양을 절제하고 종양을 멸균 된 페트리 접시로 옮기고 종양을 작은 조각으로 자르고 종양에서 괴사 조직을 제거하십시오.
6. 향후 이식을 위한 은행 종양 조직.
   1. ~ ~ 10mm x 10mm보다 작은 2-3 개의 작은 종양 조각을 가져 와서 ~ 1mm x 1mm보다 작은 조각으로 잘라냅니다.
   2. 모든 다진 조직을 2 mL 극저온 바이알로 옮기고 1 mL의 동결 매체를 추가하십시오 (10 % DMSO + 90 % FBS).
   3. 잘 섞어서 극저온 바이알을 드라이 아이스 위에 미리 냉각된 이소프로판올 계 세포 동결 용기에 넣습니다.
   4. 용기를 하룻밤 동안 -80°C 냉동고에 보관한 다음 극저온 바이알을 액체 질소(LN₂₎보관에 옮김을 옮니다.
7. 하류 어세이 (RNASeq, WES 등)에 대한 스냅 동결 조직.
   1. 종양 조직 조각(~3 mm x 3 mm)을 극저온 바이알에 넣고 즉시 LN_2에 극저온 바이알을 넣습니다. 바이알을 -80°C 냉동고에 보관하십시오.

6. PDX 치료 시험

참고: 치료 시험을 위해 필요한 수의 PDX 베어링 마우스를 생성하기에 충분한 종양 조직을 성장시키기 위해서는 2개의 확장 단계가 필요합니다.

1. LN 2로부터 뱅크드 PDX 조직을 함유하는저온 제거조직을 집어 들고, 종양 조직을 함유하는 동결매체가 막 녹기 시작할 때까지 37°C 수조에 저온을 놓는다.
2. 50 mL 튜브에 미리 데운 HBSS^-/- 저온의 내용물비, 및 세척 조직.
3. 펠렛 조직을 1,200 rpm에서 5 분 동안 원심 분리하여.
4. 파스퇴르 파이펫으로 진공 흡인에 의해 종양 샘플에서 HBSS^-/-를 제거합니다.
5. 50 mL 튜브에서 PDX 조직을 5cm 또는 10cm 페트리 접시에 넣고 젖은 얼음 위에 놓습니다.
6. 위의 이식 프로토콜을 따라 극저온 바이알로부터 뱅크된 조직을 5NSG 마우스로 이식하여 PDX 종양 확장의 첫 번째 라운드를 수행하였다.
7. 일단 종양이 ~600-800mm 3에 도달하면, 수확 1-2 종양은 종양 조직 처리를위한 위의 프로토콜로 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다 : 기계적 해리, 콜라게나아제 소화 해리 절차.
8. 펠릿 세포는 6 mL의^{HBSS-/-----인공}세포외 매트릭스(1:1 비율)에서 재중단하고, 피하 주사 ~50 NSG 마우스, PDX 종양 확장의 두 번째 라운드를 위해 마우스당 100 μL의 세포 혼합물을 가진.
9. 격주 캘리퍼스로 종양 크기를 측정합니다.
10. 3-5주에 ~100 mm 3의 종양 크기를 기다린 후 마우스를 그룹으로 무작위화하고 치료를 시작합니다.
11. 종양 크기가 최대 IACUC 승인 부피에 도달하면 치료를 중단하십시오.
12. 상기 수확 종양 프로토콜을 따라 파라핀 블록에 대한 스냅 냉동 종양 조각, 종양 조각을 수집한다.

결과

흑색종 PDX 모형을 위한 종양 조직은 다양한 다른 근원에서 올 수 있고 또한 개별적인 모형의 성장 역학 및 PDX 조직의 원하는 사용 당 가공될 수 있습니다. PDX 모델을 확립할 때 우선순위는 향후 사용을 위해 은행에 충분한 물질을가지고 있고 특성화를 위한 DNA를 가지는 것이다(그림 1).

일단 충분한 물질이 뱅크화되면, 종양 조직은 공식적인 치료 연구를 ?...

토론

본원에서 원발성 및 전이성 종양, 핵심 생검 및 FNA로부터 유래된 환자 조직을 가진 흑색종의 PDX 모델을 생성하는 것을 기술했다. NSG 마우스로 직접 이식될 때, 종양은 환자에서 관찰된 것과 유사한 형태학적, 게놈 및 생물학적 특성을 제시한다. 소수의 조직만 조사자가 사용할 수 있는 경우, 종종 FNA에서 발생하는 것처럼 PDX 기술은 DNA, RNA 및 단백질 특성화를 위한 종양 조직의 확장뿐만 아니라 전?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Cat # 15140163
1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++)	MED	Cat # MT21-023-CV
2.5% Trypsin	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # T4549-100ML	10 mL aliquots stored at –20oC
BSA	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # A9418-500G
Chlorhexidine	Fisher Scientific	Cat# 50-118-0313
Collagenase IV (2,000 u/mL)	Worthington	Cat #4189	make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1
DMSO	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # C6295-50ML
DNase	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # D4527
EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid)	Merck	Cat # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 15290-018
Gentamicin	FISHER SCIENTIFIC	Cat # BW17518Z
Isoflurane	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	Cat # 050031
Leibovitz's L15 media	Invitrogen	Cat # 21083027
Matrigel	Corning	Cat # 354230	Artificial extracellular matrix
Meloxicam	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein	Cat # 025115	1-5mg/kg, as painkiller
NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice	The Wistar Institute, animal facility		breeding
PVA (polyvinyl alcohol)	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine	Fisher Scientific	Cat# MT10041CM
Scalpel	Feather	Cat # 2976-22
Virkon	GALLARD-SCHLESINGER IND	Cat # 222-01-06
Wound clips	MikRon	Cat #427631