Kanser Araştırmalarında Terapötik ve Tanısal Antikor Biyodağılımının Değerlendirilmesi için In Vivo Immunofluoresence Lokalizasyonu

Özet

In vivo immünfloresans lokalizasyonu (IVIL) yöntemi, in vivo tümör hedeflemesi ve ekzo immünboyama kombinasyonu nu kullanarak canlı organizmalarda onkolojik amaçlarla antikor ve antikor konjugatörlerinin in vivo biyodağılımını incelemek için kullanılabilir. Yöntemler.

Özet

Monoklonal antikorlar (mAbs) kanser teşhisi, tanısı ve tedavisinde önemli araçlardır. Onlar tümörigenez proteinlerin rolünü çözmek için kullanılır, tümör tespiti ve karakterizasyonu sağlayan kanser biyobelirteçleri yönlendirilebilir, ve mAbs veya antikor-ilaç conjugates olarak kanser tedavisi için kullanılabilir bağışıklık etkileyici hücreleri etkinleştirmek için, inhibe etmek sinyal yolları, ya da doğrudan belirli antijen taşıyan hücreleri öldürmek. Yeni ve son derece spesifik mGe'lerin geliştirilmesi ve üretimindeki klinik gelişmelere rağmen, tanı ve tedavi uygulamaları tümör mikroortamının karmaşıklığı ve heterojenliği ile bozulabilir. Bu nedenle, etkili antikor bazlı tedaviler ve tanıların geliştirilmesi için, antikor bazlı konjuge'nin canlı tümör mikroortamı ile biyodağılımı ve etkileşiminin değerlendirilmesi çok önemlidir. Burada In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) in vivo fizyolojik ve patolojik koşullarda antikor bazlı terapötik ve tanı etkileşimlerini incelemek için yeni bir yaklaşım olarak tanımlıyoruz. Bu teknikte, terapötik veya tanısal antijene özgü antikor intravenöz olarak invivo ve lokalize ex vivo izole tümörlerde ikincil antikor ile enjekte edilir. Bu nedenle IVIL, antikor bazlı ilaçların ve hedefleme ajanlarının in vivo biyodağılımını yansıtmaktadır. İki IVIL uygulaması meme kanserinin moleküler görüntülemesi için antikor bazlı kontrast ajanların biyodağılımı ve erişilebilirliğini değerlendirirken tanımlanmıştır. Bu protokol, gelecekteki kullanıcıların IVIL yöntemini kendi antikor tabanlı araştırma uygulamaları için uyarlamalarına olanak sağlayacaktır.

Giriş

Monoklonal antikorlar (mAb) b hücreleri tarafından salgılanan ve bağışıklık sisteminde biyolojik işlevini belirlemek ve inhibe etmek için birincil bir fonksiyona sahip immünglobulin süper familyasının büyük glikoproteinleridir (yaklaşık 150 kDa) yıkım, bakteriyel veya viral patojenler, ve kanser hücrelerinde anormal protein ekspresyonu tanıyabilir¹. Antikorlar femtomolar konsantrasyonları onları biyotıp²son derece umut verici araçlar yapma kendi özel epitopsiçin son derece yüksek bir yakınlık olabilir. Milstein ve Köhler tarafından hibridoma teknolojisinin gelişmesiile (1984 yılında Nobel Ödülü) ile mAbs üretimi mümkün oldu³. Daha sonra, insan mAbs faj ekran teknolojisi veya transgenik fare suşları kullanılarak oluşturulan ve yeni araştırma araçları ve terapötik⁴,⁵olarak kullanım devrim .

Kanser dünya çapında bir sağlık sorunu ve önleme, algılama ve^tedavi6 için yeni yaklaşımlar için ihtiyaç yaratarak ölüm önemli bir nedenidir. Bugüne kadar, mAbs tümörigenez genlerin rolü ve proteinlerin extrication izin verdi ve kanser biyobelirteçleri karşı yönlendirildiğinde, hasta tabakalaşma için tümör tespiti ve karakterizasyonu sağlayabilir. Kanser tedavisi için, bispesifik mAbs, antikor-ilaç konjugeler, ve küçük antikor parçaları terapötik olarak geliştirilmektedir, ve terapötik^etkinliğiniartırmak için hedeflenen ilaç teslim imiş 7 . Buna ek olarak, antikorlar floresan güdümlü cerrahi, fotoakustik (PA) görüntüleme, ultrason (ABD) moleküler görüntüleme ve klinik olarak kullanılan pozitron emisyonu gibi moleküler görüntüleme yöntemleri için kontrast ajanların biyomarker hedeflemeiçin hizmet tomografi (PET) veya tek foton emisyon bilgisayarlı tomografi (SPECT)⁸. Son olarak, antikorlar da hedeflenen tedaviler için hastaların tabakalaşma ve yanıt izleme sağlayan teranostik ajanlar olarak kullanılabilir⁹. Bu nedenle, yeni mAbs kanser tespiti, tanı ve tedavisinde kritik bir rol oynamaya başlıyor.

Yeni ve son derece spesifik mGe'lerin geliştirilmesi ve üretimindeki kritik gelişmelere rağmen, tanı ve tedavi uygulamaları tümör ortamının karmaşıklığı nedeniyle etkisiz hale getirilebilir. Antikor etkileşimleri epitop türüne bağlıdır,yani,doğrusal veya konformasyonel¹⁰olup olmadığını. Antijenlerin tanınmasına ek olarak, antikorlar damar duvarları gibi doğal engelleri aşmak gerekir, bazal membranlar, ve tümör stroma antijen ifade hedef hücrelere ulaşmak için. Antikorlar doku ile sadece değişken parça antijen bağlama (Fab) etki alanı yoluyla değil, aynı zamanda sabit kristal in parçası (Fc) ile etkileşime hangi daha da off-site etkileşimleri yol açar¹¹. Tümör vaskülarizasyonunda tümör toplu ve heterojenlik ve lenfatik sistemde tümör belirteçlerinin heterojen ekspresyonu ile de hedefleme karmaşıktır^12,13. Buna ek olarak, tümör mikroçevre tümör hücrelerini destekleyen kanser ilişkili fibroblastlar oluşur, anti-tümör bağışıklık reaksiyonları bastırmak tümör bağışıklık hücreleri, ve oksijen ve besin naklini destekleyen tümör endotel, tüm antikor bazlı terapötik lerin veya tanıların penetrasyonunu, dağılımını ve kullanılabilirliğini engelleyen. Genel olarak, bu hususlar terapötik veya tanısal etkinliği sınırlayabilir, tedavi yanıtını azaltabilir ve tümör direncine neden olabilir.

Bu nedenle, etkili antikor tabanlı tedaviler ve tanı ların geliştirilmesi için, tümör mikroortamında antikor bazlı konjuge biyodağılımı ve etkileşiminin değerlendirilmesi çok önemlidir. Şu anda klinik öncesi çalışmalarda tümör araştırma modellerinde belirteç ekspresyonu, tümör^kesitlerininimmünoresans (IF) boyaması ile ex vivo olarak analiz edilir. Standart IF boyama, hayvandan izole edilmiş ekstrem tümör doku dilimlerinde sekonder floresan etiketli antikorlar ile vurgulanan primer marker spesifik antikorlarla yapılır. Bu teknik, doku fiksasyonu sırasında belirteç statik konumunu vurgular ve antikor tabanlı terapötik veya tanı fizyolojik koşullarda dağıtmak veya etkileşim nasıl içgörü sağlamaz. PET, SPECT, ABD ve PA tarafından moleküler görüntüleme yaşayan preklinik modellerde antikor konjuge kontrast madde dağılımı hakkında bilgi sağlayabilir^8,15. Bu görüntüleme yöntemleri non-invaziv olduğundan, boylamsal çalışmalar yapılabilir ve zamana duyarlı veriler grup başına en az sayıda hayvan ile toplanabilir. Ancak, bu non-invaziv moleküler görüntüleme yaklaşımları yeterince duyarlı değildir ve hücresel düzeyde antikor dağılımının lokalizasyonu için yeterli çözünürlüğe sahip değildir. Ayrıca, birincil antikor fiziksel ve biyolojik özellikleri büyük ölçüde bir kontrast madde¹⁶konjugasyonu ile değiştirilebilir.

İn vivo fizyolojik ve patolojik durumları göz önünde bulundurarak antikor bazlı terapötik ve tanıların tümör ortamında nasıl etkileştiğini göz önünde bulundurmak ve yüksek çözünürlüklü hücresel ve hatta hücre altı dağılım elde etmek için konjuge olmayan antikor profilleri, antijene özgü antikorin intravenöz olarak intravenöz olarak intravenöz olarak enjekte edildiği Vivo İmmünofloresan Lokalizasyonunda (IVIL) kabul edilen bir IF yaklaşımı öneriyoruz. Antikor bazlı terapötik veya tanısal, birincil antikor olarak hareket, fonksiyonel kan damarlarında dolaşır ve son derece doğru, yaşayan tümör ortamında hedef protein bağlanır. İn vivo etiketli tümörlerin primer antikorile izole edilmesinden sonra, birikmiş ve korunmuş antikor konjugatörlerinin lokalize edilmesi nde ikincil bir antikor kullanılır. Bu yaklaşım, floresan olarak etiketlenmiş antikorenjekte eden if histoloji yaklaşımına daha önce tanımlanmış bir yaklaşıma benzer¹⁷. Burada ise, konjuge olmayan antikorların kullanımı antikor modifikasyonu ile indüklenen biyodağıtım özelliklerinde potansiyel bir değişiklik önler. Ayrıca floresan sekonder antikorların ex vivo uygulaması doku toplama ve işleme sırasında olası bir floresan sinyali kaybını önler ve floresan sinyal yoğunluğunun arttırılmasını sağlar. Etiketleme yaklaşımımız antikor bazlı ilaçların ve hedefli ajanların canlı biyodağılımını yansıtır ve yeni tanı ve tedavi edici ajanların gelişimi için önemli bilgiler sağlayabilir.

Burada, meme kanseri saptanması için moleküler görüntüleme yaklaşımları için antikor bazlı kontrast ajanların biyodağılımı nı ve erişilebilirliğini araştıran önceki çalışmalarda uygulandığı gibi IVIL yönteminin iki uygulamasını açıklıyoruz. İlk olarak, bir antikor-yakın kızılötesi boya konjuge biyodağılımı (anti-B7-H3 antikor yakın kızılötesi floresan boya bağlı, indosiyane yeşili, B7-H3-ICG) ve izotip kontrol ajanı (Iso-ICG) floresan ve fotoakustik moleküler moleküler için görüntüleme¹⁸araştırılır. Bu uygulamanın yöntemi protokolde açıklanmıştır. Daha sonra, netrin-1 bir konformasyonel duyarlı antikor biyodağıtım sonuçları, genellikle geleneksel IF görüntüleme ile tespit edilemez, ultrason moleküler görüntüleme ile kullanılan, sayısallaştırılmış ve temsili sonuçlarda sunulan¹⁹. Bu protokol makalesinin sonunda, okuyucular kendi antikor tabanlı araştırma uygulamaları için IVIL yöntemini benimseyerek rahat hissetmelidir.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler Stanford Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Bakımı Kurumsal İdari Paneli (APLAC) tarafından onaylanmıştır.

1. Meme kanseri gelişiminin transgenik fare modeli

1. Devam etmeden önce palpasyon veya kaliper ölçümü ile uygun tümör büyümesi için istenilen kanser modelinden fareleri gözlemleyin.
   NOT: Burada meme kanseri gelişiminin transgenik mürin modeli (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT) kullanılmıştır. Bu hayvanlar spontan her meme bezi nde yaş 6 ve 12 hafta arasında invaziv meme karsinomları geliştirmek²⁰. Normal meme bezleri transgen-negatif, yaşa uygun çöplerin kontrolü olarak kullanılmıştır.

2. Spesifik ve nonspesifik antikor ajanlarının intravenöz enjeksiyonu

1. Üreticitalimatlarına göre koruyucu ve depolama tamponlarını kaldırmak için bir tuzsuzlama sütununda (örneğin, PD-10) tavşan anti-fare B7-H3 ve tavşan IgG izotip kontrolü antikorlarını arındırın.
   NOT: Protein-A agarose boncuk bazlı protokol²¹ile bazı antikorların daha fazla saflaştırmagerekebilir.
2. Her antikor 33 μg Aliquot dozajları bireysel mikrosantrifüj tüplerde eşleşin.
   NOT: Uygulanan ajanın dozajı uygulamaya bağlı olarak değişebilir ve antikor konjuge sinin rutin olarak kullanıldığı dozlarla eşleşir. Hayvan güvenliği için hacim 100 μL'den fazlaise antikor solüsyonlarının konsantrasyonu gereklidir.
3. Doku toplamadan önce istenilen zaman noktasında, burada 96 saat, 2 L/dk oksijen akan% 2 izofluran ile tümör taşıyan hayvan anestezi ve 37 ° C ısıtmalı aşamada yer. İşlemden önce doğru anestezi seviyesine ulaşıldığından emin olmak için bir parmak tutamını yapın.
4. Antikor çözeltilerinin kuyruk damar ısülolasyonuna hazırlanmak için, alkol mendili ile üç kez silerek hayvanın kuyruğunu dezenfekte edin. Yaklaşık 30 s. Tüm hayvan ısıtma kaçının bir ısı yastığı ile ısıtarak kuyruk damarları dilate. Isı yastığını çıkardıktan sonra kuyruğunu bir kez daha alkol lemi ile silin.
5. 27G kuyruk damar kateterini kullanarak kelebek iğnesini iki yan kuyruk damarına takın ve bir parça cerrahi bantla sahneye yerleştirilen iğneyle kuyruğu dikkatlice düzeltin.
   NOT: Katetere görünür kan geri akışı kuyruk damarı içinde iğnenin uygun yerini gösterir.
6. Kateteri 25 μL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın, ardından antikor solüsyonunu insülin şırıngalarını kullanarak katetere enjekte edin. Kateteri bir kez daha 25 μL steril PBS ile yıkayın.
7. İğneyi kuyruktan çıkarın ve kanamayı durdurmak için basınç uygulayın.
8. Anestezikapatın ve herhangi bir sıkıntı belirtisi için tamamen uyanık olana kadar hayvan gözlemleyin.

3. Hedef tümör dokularının toplanması ve hazırlanması

1. İstenilen zaman noktasında, insancıl kabul edilebilir kurumsal prosedüre göre hayvan ötenazi, burada, bir oda deplasman akış hızı ile sıkıştırılmış gaz tankı% 100 CO₂ kademeli teneffüs ile 10-30% hacim / dk.
   NOT: IVIL tekniğinin bazı uygulamaları serbestçe dolaşan antikor kaldırmak için PBS ile kardiyak perfüzyon ile ötanazi gerektirir^19,22.
2. Solunum ve kardiyak hareketin durması, parmak ucutu yanıtının olmaması ve mukozanın ağarması, cerrahi makas ve forceps kullanılarak tümör dokularının alınması yoluyla insancıl ötenazinin doğrulanmasından sonra aşağıdaki gibi:
   1. Fareyi supine pozisyonunda yerleştirin ve kuyruğuna en yakın meme bezleri kümesi arasındaki derinin sadece dış tabakasını tutarak (5^th)forceps ile, cerrahi makas bir çift ile küçük bir kesi yapmak.
   2. Kapalı makas kesim içine tanıtmak ve yavaş yavaş dikkatle altta yatan karın duvarı zarı bozulmadan cildi ayırmak için ucu açın.
   3. Karın kadar dikey bir kesi yapmak, iç membran deri ayırmaya devam. 3^ve 4^meme bezleri arasında, cildin geri çekilmesi ve meme bezlerinin görselleştirilmesi sağlamak için karın boyunca yatay bir kesim yapmak.
      NOT: Meme tümörleri ve bezleri deri altında yüzeysel olarak bulunur.
   4. Her tümör veya normal bezi forceps ile kavrayarak, dikkatle cerrahi makas kullanarak bağlı cilt kesip.
3. Excised dokuları doku tek kullanımlık baz kalıpları içine yerleştirin, önceden etiketlenmiş ve optimum kesme sıcaklığı ile doldurulmuş (OCT) gömme ortamı ve kuru buz üzerine yerleştirerek hızlı bir şekilde kalıpları dondurun. Hedef dışı teslimatı incelemek için, diğer doku ları veya ilgi çekici organları(örn. karaciğerveya akciğerler) çıkarın.
   NOT: Bu noktada protokolü duraklatmak için dondurulmuş doku bloklarını -80 °C'de hazır olana kadar saklayın.
4. Bir kriyostat kullanarak, 10 μm kalınlığında bölüm dondurulmuş doku blokları ve önceden etiketlenmiş yapışma cam slaytlar üzerine bitişik bölümleri yerleştirin.
   NOT: Bu noktada protokolü duraklatmak için slaytları devam etmeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.

4. Ex vivo boyama protokolü

NOT: Floresan mikroskopi görüntüleri arasındaki nicel karşılaştırma için tüm slaytlar aynı anda aynı hazırlanmış çözümlerle lekelenir.

1. Dondurulmuş doku slaytlarını oda sıcaklığında PBS ile 5 dk boyunca durulayın ve OCT'yi çıkarın.
2. Boyama sırasında ihtiyaç duyulan çözeltilerin hacmini azaltmak için doku kesitlerini hidrofobik bariyer kalemle ayırın.
   NOT: Kalemin doku örneklerini aşması için dikkatli olun, çünkü bu doku slayttan çıkarılabilir veya etkilenen doku kısmında uygun şekilde boyanmasını önleyebilir. Doku bölümlerinin herhangi bir noktada susuz kalmasını niçin izin vermeyin.
3. 5 dakika için% 4 paraformaldehit çözeltisi ile doku bölümleri düzeltin.
4. 5 dakika PBS slaytlar durular.
5. PBS'de %0.5 Triton-X 100 ile 15 dk boyunca doku kesitlerini permeabilize edin.
6. 5 dakika PBS slaytlar durular.
7. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS (bloklama çözeltisi) olan %3 w/v sığır serumalbumini (BSA) ve %5 v/v keçi serumu ile dokuları bloke edin.
   NOT: Bloke solüsyonu serumunu ikincil antikor konak hayvanıile eşleştirin.
8. 5 dakika PBS slaytlar durular.
9. İstenildiği gibi kayıt tutan primer antikorlar, muhtemelen ortak bir nükleer (örneğin, DAPI), vasküler (örneğin, CD31) veya sitoplazmik belirteç (örneğin, aktin) olan inkübat bölümleri. Burada, fare anti-mouse CD31 (vasküler marker) bir slayt tepsisi üzerinde dehidratasyon korunan 4 ° bir gecede engelleme çözeltisi üreticinin talimatlarına göre kullanılmıştır.
   NOT: Ek primer antikor veya antikor eşleci eklemeyin. Enjekte edilen ve dokularda birikmesine izin verilen konjuge primer antikor olarak hareket.
10. PBS'deki slaytları 5 dk üç kez durulayın ve PBS'yi her seferinde değiştirin.
11. Birincil antikorları etiketlemek için ikincil antikorlarla inküböz slaytlar. Bu uygulama için, AlexaFluor-546 konjuge keçi anti-tavşan antikor (1:200 seyreltme, üreticinin talimatlarına göre optimize) ve CD31 AlexaFluor-488 keçi anti-sıçan ikincil antikor (1:200) kullanarak anti-B7-H3 antikor görselleştirmek seyreltme, üreticinin talimatlarına göre optimize) bloklama çözeltisi, bir slayt tepsisi üzerinde ışık ve dehidratasyon korunan, oda sıcaklığında 1 saat için.
    NOT: İkincil antikorlar aynı konak hayvana ait olmakla birlikte, ikincil antikorların yakınlığıyla ilgili birincil antikorların konak türüne eşleşir. Slaytlar bu noktadan itibaren ışıktan korunur.
12. PBS'deki slaytları 5 dk üç kez durulayın ve PBS'yi her seferinde değiştirin.
13. Doku diliminin ortasına montaj ortamının bir damlasını uygulayın ve hava kabarcıklarının tuzaklanmasından kaçınarak dikkatlice bir kapak kaymayerleştirin.
14. Açık oje ile coverslip kenarları mühür ve kurumasını bekleyin.
    NOT: Protokolü bu noktada bir haftaya kadar duraklatmak için slaytları -20 °C'de hazır olana kadar saklayın.

5. Konfokal mikroskopi görüntüleme ve kantitatif görüntü analizi

NOT: Konfokal mikroskobun hazırlanması ve görüntüleme parametreleri kullanılan konfokal sisteme bağlıdır. Burada kullanılan mikroskop ticari olarak satın alındı (örneğin, Zeiss LSM 510 Meta sistemi) ve ilgili satın alma yazılımı kullanıldı (örneğin, Zen 2009). Ancak, bu adımların çoğu herhangi bir konfokal mikroskop için geçerli olacak ve temel konfokal mikroskopi bilgi varsayalım.

1. Sistem açıklanıp ısındıktan sonra, istenilen hedefi seçin; burada 20x (sayısal diyafram = 0.8) nesnel kullanılmıştır.
2. En parlak sinyal için optimizasyonu ayarlamak için pozitif bir kontrol kaydırağı yükleyin, coverslip aşağı. Kırmızı kanalda görüntüleme, Canlı görüntüleme modunda örnek sistemi odak.
3. Kullanılan her lazer kanalı için, lazer yoğunluğunu, ana kazancı ve iğne deliği boyutunu aşağıdaki gibi optimize edin:
   1. Görüntüleme için Sürekli moduna geçin.
   2. Bak Tablosu (LUT) histogramını izlerken Lazer Yoğunluğu (lazer gücünü kontrol eden) ve Gain (Master) (fotoçarpan tüpü için voltajı kontrol eden) slayt çubuklarını optimize edin. Bu iki ayarı, histogramın dinamik aralığı pikselleri doyurmadan dolana kadar ayarlayın.
      NOT: Lazer yoğunluğu çok yüksekse fotobeyaztma yapılacaktır. Kazanç (Master) çok yüksekse, görüntü gürültülü olur. İdeal olarak, Gain (Master) aralığının ortasında olacaktır.
   3. İğne deliğini, en yüksek çözünürlüğü ve en ince z dilimini veren 1 havadar üniteye (AU) ayarlayın.
   4. Gerçek siyah arka plan için LUT histogramındaki gürültü tabanını en aza indirmek için Dijital Ofset çubuğunu kaydırın.
      NOT: Mikroskopi ayarları her lazer kanalı ve amaç için optimize edildikten sonra, slaytlar arasında nicel karşılaştırma sağlamak için, görüntüleme oturumu boyunca ve tüm slaytların görüntülenmesi için sabit tutun.
4. Edinme Modu sekmesi altında, Ortalama altında,istenilen Sayı ve Bit Derinliği'niseçin. En uygun piksel boyutunu ayarlamak için En Uygun düğmeyi tıklatın.
5. Yüksek kaliteli bir görüntü toplamak için Snap edinme düğmesini kullanın. Burada tümörün içinden rastgele görüş alanları seçilmiştir, ancak farklı uygulamalar için diğer ilgi alanları (damarlar, tümör marjları, penetrasyon derinliği, vb.)
6. Görüntü dosyalarını çevrimdışı işleme ve niceleme için confocal yazılımı (burada,.lsm) tarafından kullanılan biçimde kaydedin.
   NOT: Tüm slaytlar aynı oturumsırasında görüntülenmezse, ayarları kaydedin ve sonraki ziyaretlerde yeniden yükleyin, ancak fotobeyaztma nedeniyle aynı slaytı yeniden görüntülemek önerilmez.
7. Nicel floresan yoğunluk ölçümlerini gerçekleştirin. Açık Fiji (Fiji Sadece ImageJ yazılımı)^19,23 ve yükleme .lsm görüntü dosyası durum çubuğuüzerine sürükleyerek.
8. Renk kanalı verilerini bölün. Resim > Yığınlar > Kanalları Böl.
9. Floresan görüntülerini gerektiği gibi önceden işleme, yani arka plan sinyalini(İşlem > Arka Planı Çıkar)çıkarın veya bir filtreleme yöntemi yle gürültüyü azaltın.
10. Sinyal yoğunluğuna bir eşik ayarlayarak referans proteine (vasküler, nükleer, hücresel leke) karşılık gelen renk kanalını segmentleyin (Resim > Ayarla > Eşik).
    NOT: Manuel eşik görüntü analizine öznellik getirir, bu nedenle otomatik bir eşik algoritması kullanmak veya görüntü histogramlarına başvurmak görüntü analizi sonuçlarını daha az önyargılı hale getirir.
11. İkili maske oluşturmak için bu eşiği kullanın(İşlem > İkili > Maskeye Dönüştürün).
12. Maskenin içindeki ROI'ları ölçün ve etiketleyin (Analiz Et > Parçacıkları Analiz Et > Yöneticiye Ekle > Tamam'ı denetle).
13. İlgi nin antikoruna karşılık gelen renk kanalına ROI uygulayın (Kanal görüntüsünü tıklatın, Analiz > Araçlar > YG Yöneticisi > Ölçü). Bu, maske ROI'larını antikor görüntüsüne uygular ve Sonuçlar penceresindeki etiket bölümleri için görüntü ölçümleri sağlar. Sonuç pencereyi kaydet (Dosya > Kaydet).
14. Burada açıklandığı gibi ortalama floresan yoğunluğu gibi faiz istenilen istatistik, hesaplayın²⁴.
15. Slayt kümesi içindeki her görüntüyle aynı şekilde tüm işleme adımlarını gerçekleştirin. Büyük görüntü toplu iş için bunu otomatik olarak yapmak için bir makro oluşturun²³.
16. Görüntü görüntüleme için yalnızca nicel ölçümlerden sonra, tüm slaytlarda minimum, maksimum, parlaklık ve kontrastı ayarlayarak biyodağıtım desenlerinin görselleştirilmesini optimize etmek için nitel görüntü ayarlamaları uygulayın (Resim > Ayarla > Parlaklık/Kontrast).
17. Sunularda ve yayınlarda kullanılmak üzere görüntü türünü(Resim > Yazın > RGB Rengi)dönüştürün ve .tiff (Dosya > Kaydet > Tiff...) gibi kayıpsız görüntü türünde dosyaları kaydedin.

Sonuçlar

IVIL yöntemi burada, b7-H3-ICG ve Iso-ICG'nin in vivo biyodağılımı nı ve doku etkileşimini incelemek için, canlı bir hayvana intravenöz enjeksiyondan sonra, 96 saat boyunca hedef doku ile etkileşime girebilmelerine izin vererek ve dokular hasat, ex vivo immünboyama sırasında birincil antikorlar olarak hareket etmek. IVIL yöntemi ayrıca B7-H3 marker için dokuların standart ex vivo IF boyama ile karşılaştırıldı. Normal murine meme bezleri B7-H3 belirteci ifade etmez,...

Tartışmalar

Bu yöntem birkaç kritik adıma sahiptir ve başarılı bir uygulama sağlamak için olası değişiklikler gerektirir. İlk olarak, antikor/antikor konjuge intravenöz enjeksiyonun dozajı ve zamanlaması özel uygulamaya uygun olmalıdır. Genellikle, dozlar antikor konjuge genellikle nasıl kullanılacağı ile tutarlı kullanılmalıdır, yani, terapötik antikor veya antikor tabanlı kontrast ajan eşleşen dozlarda. Ayrıca, hedef dokuların toplanmasının zamanlaması dikkatle düşünülmelidir. Antikorlar ve a...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Model
FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J	The Jackson Laboratory	002374	Females, 4-6 weeks of age
Animal Handling Supplies
27G Catheter	VisualSonics	Please call to order	Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit
Alcohol Wipes	Fisher Scientific	22-246073
Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply)	Cardinal Health	2913
Heat Lamp	Morganville Scientific	HL0100
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	29404
Ophthalmic Ointment	Fisher Scientific	NC0490117
Surgical Tape	3M	1530-1
Tissue Collection
Disposable Base Molds	Fisher Scientific	22-363-556
Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium	Fisher Scientific	23-730-571
Surgical London Forceps	Fine Science Tools	11080-02
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Antibodies
AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG	Life Technologies	A-11006
AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A-11010
AlexaFluor-594 goat anti-human IgG	Life Technologies	A11014
Human IgG Isotype Control	Novus Biologicals	NBP1-97043
Humanized anti-netrin-1 antibody	Netris Pharma		contact@netrispharma.com
Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3)	Abcam	ab134161	EPNCIR122 Clone
Rat anti-Mouse CD31	BD Biosciences	550274	MEC 13.3 Clone
Reagents
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153-50G
Clear Nail Polish			Any local drug store
Indocyanine Green - NHS	Intrace Medical	ICG-NHS ester
Mounting Medium	ThermoFisher Scientific	TA-006-FM
Normal Goat Serum	Fisher Scientific	ICN19135680
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	14190250
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
Supplies
Adhesion Glass Slides	VWR	48311-703
Desalting Columns	Fisher Scientific	45-000-148
Glass Cover Slips	Fisher Scientific	12-544G
Hydrophobic Barrier Pen	Ted Pella	22311
Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-402-25
Slide Staining Tray	VWR	87000-136
Software
FIJI	LOCI, UW-Madison.	Version 4.0	https://fiji.sc/