В Vivo Иммунофлуоресценция Локализация для оценки терапевтического и диагностического антитела биораспределения в онкологических исследований

Резюме

Метод локализации иммунофлуоресценции in vivo (IVIL) может быть использован для изучения биораспределения антител и антител в vivo для онкологических целей в живых организмах, используя сочетание таргетинга опухоли in vivo и иммунодефицита ex vivo Методы.

Аннотация

Моноклональные антитела (mAbs) являются важными инструментами в выявлении, диагностике и лечении рака. Они используются для распутывания роли белков в опухолевом игенезе, могут быть направлены на раковые биомаркеры, позволяющие выявлять и характеризовать его, и могут быть использованы для терапии рака в качестве mAbs или антител-наркотики, чтобы активировать клетки иммунного эффектора, ингибировать сигнальные пути, или непосредственно убить клетки, несущие конкретный антиген. Несмотря на клинические достижения в разработке и производстве новых и высокоспецифических mAbs, диагностическое и терапевтическое применение может быть нарушено сложностью и неоднородностью микроокружения опухоли. Таким образом, для развития эффективных антител на основе терапии и диагностики, имеет решающее значение для оценки биораспределения и взаимодействия антител на основе конъюгировать с живой микросреды опухоли. Здесь мы описываем In Vivo Иммунофлуоресценция Локализация (IVIL) как новый подход к изучению взаимодействия антител на основе терапии и диагностики в in vivo физиологических и патологических условиях. В этом методе, терапевтические или диагностические антиген-специфические антитела внутривенно вводят в vivo и локализованы ex vivo со вторичным антителом в изолированных опухолях. IVIL, таким образом, отражает in vivo биораспределение антител на основе наркотиков и целевых агентов. Описаны два применения IVIL, оценивающих биораспределение и доступность контрастных агентов на основе антител для молекулярной визуализации рака молочной железы. Этот протокол позволит будущим пользователям адаптировать метод IVIL для своих собственных исследовательских приложений на основе антител.

Введение

Моноклональные антитела (mAb) являются крупными гликопротеином (приблизительно 150 кДа) суперсемейства иммуноглобулина, которые выделяются В-клетками и имеют первичную функцию в иммунной системе для выявления и либо ингибирования биологической функции, либо знака для разрушение, бактериальных или вирусных патогенов, и может распознать ненормальное выражение белка на раковых клетках¹. Антитела могут иметь чрезвычайно высокое сродство к их специфическим эпитопов вплоть до фемтомолярных концентраций, что делает их весьма перспективными инструментами в биомедицине^2. С развитием технологии гибридомы Мильштейном и Кёлером (награжден Нобелевской премией в 1984 году), производство mAbs стало возможным³. Позже, человеческие mAbs были созданы с использованием технологии фагового дисплея или трансгенных штаммов мыши и революционизировали их использование в качестве новых исследовательских инструментов и терапевтических средств^4,5.

Рак является проблемой здравоохранения во всем мире и основной причиной смерти, создающих необходимость новых подходов к профилактике, выявлению и терапии⁶. На сегодняшний день mAbs позволили вывести из роли генов и их белков в tumorigenesis и, когда направлены против рака биомаркеров, может позволить обнаружение опухоли и характеристики для стратификации пациента. Для терапии рака, биспецифические mAbs, антитела-наркотики конъюгирует, и меньше фрагменты антител разрабатываются в качестве терапии, и для целевой доставки наркотиков для повышения терапевтической эффективности⁷. Кроме того, антитела служат для биомаркера ориентации контрастных агентов для молекулярных методов визуализации, таких как флуоресцентная хирургия, фотоакустическая (PA) визуализация, ультразвуковая (US) молекулярная визуализация, и клинически используемые позитронное излучение томография (ПЭТ) или однофотонные эмиссионные компьютерная томография (SPECT)⁸. Наконец, антитела также могут быть использованы в качестве тераностических агентов, позволяющих стратификации пациентов и мониторинга ответов для целевых методов лечения⁹. Таким образом, новые mAbs начинают играть важную роль в выявлении рака, диагностике и лечении.

Несмотря на критические достижения в разработке и производстве новых и высокоспецифических mAbs, диагностическое и терапевтическое применение может оказаться неэффективным из-за сложности опухолевой среды. Взаимодействия антител зависят от типа эпитопа,т.е. ли это линейное или конформационное^10. В дополнение к признанию антигенов, антитела должны преодолеть естественные барьеры, такие как стенки сосудов, базальные мембраны, и строма опухоли для достижения целевых клеток, выражающих антиген. Антитела взаимодействуют с тканью не только через переменный фрагмент антигена связывания (Fab) домена, но и через постоянный кристаллический фрагмент (Fc), который далее приводит к вне участка взаимодействия¹¹. Ориентация также осложняется неоднородным выражением опухолевых маркеров по всей опухолевой массе и неоднородности в опухолевой васкуляризации и лимфатической системы^12,13. Кроме того, микроокружение опухоли состоит из связанных с раком фибробластов, которые поддерживают опухолевые клетки, опухолевые иммунные клетки, которые подавляют противоопухолевые иммунные реакции, и опухолевый эндотелий, который поддерживает транспортировку кислорода и питательных веществ, все которые мешают проникновению, распространению и доступности антител на основе терапии или диагностики. В целом, эти соображения могут ограничить терапевтическую или диагностическую эффективность, уменьшить реакцию на лечение, и может привести к устойчивости к опухоли.

Поэтому для развития эффективных антител на основе терапии и диагностики, имеет решающее значение для оценки биораспределения и взаимодействия антител на основе конъюгировать в микроокружении опухоли. В настоящее время в доклинических исследованиях экспрессия маркеров в моделях исследования опухолей анализируется ex vivo по иммунофлуоресценции (ИФ) окрашивания опухолевых секций^14. Стандартное окрашивание ЕСЛИ выполняется с первичными маркерными антителами, которые затем подчеркиваются вторичными флуоресцентно помеченными антителами на ломтиках опухолевой ткани ex vivo, которые были выделены от животного. Этот метод подчеркивает статическое расположение маркера во время фиксации тканей и не дает представления о том, как антитела на основе терапии или диагностики могут распространять или взаимодействовать в физиологических условиях. Молекулярная визуализация по ПЭТ, SPECT, США, и PA может предоставить информацию о антитела химки-конъюгированный контрастный агент распределения в живых доклинических моделей^8,15. Поскольку эти методы визуализации являются неинвазивными, продольные исследования могут быть выполнены и чувствительные к времени данные могут быть собраны с минимальным количеством животных в группе. Однако эти неинвазивные подходы к молекулярной визуализации недостаточно чувствительны и не имеют достаточного разрешения для локализации распределения антител на клеточном уровне. Кроме того, физические и биологические характеристики первичного антитела могут быть резко изменены путем спряжения контрастного агента^16.

Для того, чтобы принять in vivo физиологических и патологических условий во внимание, как антитела на основе терапии и диагностики взаимодействуют в опухолевой среде и получить высокое разрешение клеточной и даже суб-клеточной распределения профили неконъюгированных антител, мы предлагаем if подход, считается В Иво иммунофлуоресценции Локализация (IVIL), в котором антиген-специфические антитела внутривенно вводятся в vivo. Антитела на основе терапевтических или диагностических, действуя в качестве основного антитела, циркулирует в функциональных кровеносных сосудов и связывается с его целевой белок в высокоточной, живой среде опухоли. После изоляции опухолей с первичными антителами, вторичное антитело используется для локализации накопленных и сохраненных конъюгатов антител. Этот подход аналогичен ранее описанного подхода IF гистологии инъекционных флуоресцентно помеченных антител¹⁷. Хотя здесь, использование неконъюгированных антител позволяет избежать потенциального изменения в характеристиках биораспределения, вызванных модификацией антител. Кроме того, применение ex vivo флуоресцентных вторичных антител позволяет избежать возможной потери сигнала флуоресценции во время сбора и обработки тканей и обеспечивает усиление интенсивности флуоресценции. Наш подход к маркировке отражает биораспределение в vivo антител на основе лекарств и целевых агентов и может обеспечить важную информацию для разработки новых диагностических и терапевтических агентов.

Здесь мы описываем два применения метода IVIL, применяемых в предыдущих исследованиях, исследующих биораспределение и доступность контрастных агентов на основе антител для молекулярной визуализации подходов к обнаружению рака молочной железы. Во-первых, биораспределение антител ближнего инфракрасного красителя конъюгированных (анти-B7-H3 антитела связаны с ближней инфракрасной флуоресценции красителя, индоцианин зеленый, B7-H3-ICG) и изотип ный агент управления (Iso-ICG) для флуоресценции и фотоакустических молекулярных изображение исследуется¹⁸. Метод этого приложения описан в протоколе. Далее, результаты биораспределения конформистски чувствительных антител к нетрин-1, как правило, не обнаруживаемые с помощью традиционных IF изображений, используемых с ультразвуковой молекулярной визуализации, количественно и представлены в репрезентативных результатах¹⁹. В конце этого протокола документ, читатели должны чувствовать себя комфортно принятия метода IVIL для своих собственных антител на основе научно-исследовательских приложений.

протокол

Все описанные здесь методы были одобрены Институциональной административной группой по лабораторному уходу за животными (APLAC) Стэнфордского университета.

1. Трансгенная модель мыши развития рака молочной железы

1. Наблюдайте мышей от пожеланной модели рака для соотвествующего роста тумора через palpation или измерение caliper перед продолжать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь была использована трансгенная модель морина развития рака молочной железы (FVB/N-Tg (MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT). Эти животные спонтанно развиваютинь инвазивных карциномы молочной железы между 6 и 12 недель в каждой молочной железы²⁰. Нормальные молочные железы были использованы в качестве контроля от трансген-отрицательных, возрастных littermates.

2. Внутривенная инъекция специфических и неспецифических антител

1. Очистите кролика анти-мышь B7-H3 и кроликig изотип антител управления на опреснительной колонке (например, PD-10) для удаления консервантов и буферов хранения в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые антитела, возможно, потребуется дальнейшее очищение с Protein-A агарозные бусы на основе протокола²¹.
2. Аликвот дозировки 33 мкг каждого антитела конъюгироваться в отдельных микроцентрифуговых труб.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дозировка вводимого агента может варьироваться в зависимости от применения и соответствует дозам, в которых обычно используется конъюгированные антитела. Концентрация растворов антител необходима, если объем составляет более 100 л для безопасности животных.
3. В нужную точку времени перед сбором тканей, здесь 96 ч, анестезирует опухоль подшипника животного с 2% изофлуран течет в кислороде на 2 л / мин, и место на 37 градусов по Цельсию стадии. Сделайте щепотку ног, чтобы убедиться, что надлежащий уровень анестезии был достигнут до процедуры.
4. Чтобы подготовиться к прививочению хвостовой вены растворами антител, дезинфицировать хвост животного, трижды вытирая спиртом салфетку. Разпьйте хвостовые вены, прогрев тепловой площадкой примерно на 30 с. Избегайте нагрева всего животного. Протрите хвост еще раз с алкоголем протрите после удаления тепловой площадки.
5. Используя 27G хвост вены катетер, вставьте бабочку иглы в одном из двух боковых вен хвоста и тщательно исправить хвост с вставленной иглой на сцену с куском хирургической ленты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Видимый приток крови в катетер указывает на правильное расположение иглы в хвостовой вены.
6. Промыть катетер с 25 л стерильного фосфата буферного солей (PBS), а затем ввести раствор антитела в катетер с помощью инсулиновых шприцев. Промыть катетер еще раз с 25 Зл стерильных PBS.
7. Снимите иглу с хвоста и нанесите давление, чтобы остановить кровотечение.
8. Выключите анестезию и наблюдайте за животным до полного пробуждения при любых признаках бедствия.

3. Сбор и подготовка опухолевых тканей мишени

1. В желаемый момент времени гуманно эвтаназии животное в соответствии с приемлемой институциональной процедурой, здесь, путем постепенного вдыхания 100% CO₂ из сжатого бензобака с камерным смещением потока 10-30% объема / мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые применения метода IVIL требуют эвтаназии сердечной перфузии с PBS, чтобы удалить свободно циркулирующих антител^19,22.
2. После подтверждения гуманной эвтаназии через прекращение дыхательного и сердечного движения, отсутствие ответа на щепотку ног и седение слизистых оболочек, акцизные опухолевые ткани с помощью хирургических ножниц и щипцы следующим образом:
   1. Положите мышь в положение на спине и захватывая только внешний слой кожи между набором молочных желез ближе всего к хвосту^(5-й) с щипками, сделать небольшой разрез с парой хирургических ножниц.
   2. Введите закрытые ножницы в разрез и медленно откройте кончик, чтобы тщательно отделить кожу от основной мембраны брюшной стенки, сохраняя ее нетронутой.
   3. Сделайте вертикальный разрез вверх по животу, продолжая отделять кожу от внутренней мембраны. Между^3-й и^4-й молочных желез, сделать горизонтальный разрез через живот, чтобы опрокидывая кожу и визуализации молочных желез.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опухоли молочной железы и железы расположены поверхностно под кожей.
   4. Схватив каждую опухоль или нормальную железу щипками, тщательно обрезайте прикрепленную кожу хирургическими ножницами.
3. Поместите вырезанные ткани в ткани одноразовые базовые формы, предварительно помеченные и заполненные оптимальной температурой резки (OCT) встраивая среду и быстро заморозите формы путем размещения на сухом льду. Для изучения внецелевой доставки, акциз других тканей илиорганов, представляющих интерес (например, печени или легких).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приостановить протокол в этой точке, храните замороженные блоки ткани при -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока не будет готово к продолжению.
4. Используя криостат, раздел замороженных тканей блоков на 10 мкм толщина и место смежных разделов на предварительно помечены стекол стельки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приостановить протокол в этой точке, храните слайды при -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока не будет готово к продолжению.

4. Протокол окрашивания Ex vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественного сравнения флуоресцентных микроскопических изображений все слайды окрашены в то же время с теми же подготовленными решениями.

1. Промыть замороженные ткани слайды с комнатной температурой PBS в течение 5 минут, чтобы удалить OCT.
2. Размазать участки тканей гидрофобным барьерным пером, чтобы уменьшить объем растворов, необходимых во время окрашивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не позволить перо для запуска над образцами ткани, как это может либо удалить ткани из слайда или предотвратить надлежащее окрашивание на пораженной части ткани. Не допускайте обезвоживания секций тканей в любой момент.
3. Зафиксировать участки ткани с 4% раствором параформальдегида в течение 5 мин.
4. Промыть слайды в PBS в течение 5 мин.
5. Пермяки ткани разделов с 0,5% Тритон-X 100 в PBS в течение 15 минут.
6. Промыть слайды в PBS в течение 5 мин.
7. Блок тканей с 3% w/v бычьей сыворотки альбумина (BSA) и 5% v/v козьей сыворотки, как в PBS (блокирующий раствор) для 1 ч при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Матч блокирующего раствора сыворотки к вторичному антител хозяина животных.
8. Промыть слайды в PBS в течение 5 мин.
9. Инкубировать секции с учета первичных антител по желанию, возможно, общие ядерные (например, DAPI), сосудистые (например, CD31), или цитоплазмический маркер (например, актин). Здесь, крыса анти-мышь CD31 (сосудистый маркер) на 1:100 разбавления был использован в соответствии с инструкциями производителя в блокирующем растворе ночь на 4 кВ защищены от обезвоживания на слайд лоток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте дополнительные первичные антитела или антитела конъюгировать. Конъюгет, который был введен и позволил накапливаться в тканях in vivo выступать в качестве основного антитела.
10. Промыть слайды в PBS в течение 5 минут три раза, изменяя PBS каждый раз.
11. Инкубировать слайды со вторичными антителами для обозначения первичных антител. Для этого приложения, визуализировать анти-B7-H3 антитела с помощью AlexaFluor-546 конъюгированных козы анти-кролик антитела (1:200 разбавления, оптимизированные в соответствии с инструкциями производителя) и CD31 с AlexaFluor-488 коза анти-крысы вторичного антитела (1:200 разбавления, оптимизированного в соответствии с инструкциями производителя) в блокирующем растворе, защищенном от света и обезвоживания на слайд-подносе, на 1 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичные антитела от такого же животного хозяина но сопрягают сродство вторичных антител к виду хозяина соответственно главным образом антитела. Слайды защищены от света с этой точки и далее.
12. Промыть слайды в PBS в течение 5 минут три раза, изменяя PBS каждый раз.
13. Нанесите одну каплю монтажной среды в центр нарезанного нарезанного ткани и аккуратно поместите крышку, избегая захвата пузырьков воздуха.
14. Запечатайте края крышки прозрачным лаком для ногтей и дайте высохнуть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приостановить протокол на срок до недели в этой точке, храните слайды при -20 градусов по Цельсию до тех пор, пока не будет готово к продолжению.

5. Конфокальная микроскопическая визуализация и количественный анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка конфокального микроскопа и параметров изображения будет зависеть от используемой конфокальной системы. Микроскоп, используемый здесь, был приобретен на коммерческой цене (например, система «Зейсс ЛСМ 510 Мета»), а связанное с ним программное обеспечение для приобретения использовалось (например, дзэн 2009). Тем не менее, многие из этих шагов будут применяться к любой конфокальный микроскоп и взять на себя основные знания конфокальной микроскопии.

1. После того, как система была включена и разогрета, выберите нужную цель; здесь была использована цель 20x (числовая диафрагма 0.8).
2. Загрузите положительный слайд управления, coverslip вниз, чтобы обеспечить настройку оптимизации для самого яркого сигнала. Изображения в красном канале, сосредоточить систему на образец в режиме Live изображений.
3. Для каждого используемого лазерного канала оптимизируйте интенсивность лазера, мастер-прибыль и размер пинхола следующим образом:
   1. Переключитесь в непрерывный режим для визуализации.
   2. Оптимизируйте интенсивность лазера (который управляет силой лазера) и уравновешивает (мастер) (который управляет напряжением для трубки photomultiplier) решетки скольжения пока контролирующ гистограмму взгляда вверх (LUT). Отрегулируйте эти две настройки до тех пор, пока динамический диапазон гистограммы не будет заполнен без насыщения пикселей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если интенсивность лазера слишком высока photobleaching будет происходить. Если Gain (Master) слишком высок, изображение станет шумным. В идеале, Gain (Master) будет в середине своего диапазона.
   3. Установите пинхол на 1 воздушный блок (AU), который дает самое высокое разрешение и самый тонкий z-ломтик.
   4. Сдвиньте цифровой offset бар, чтобы свести к минимуму шум пол на lut гистограммы для истинного черного фона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как настройки микроскопии оптимизированы для каждого лазерного канала и цели, держать их постоянными на протяжении всего сеанса изображения и для визуализации всех слайдов, чтобы обеспечить количественное сравнение между слайдами.
4. Под вкладкой Режим приобретения, под Усреднение, выберите желаемое число и bit Глубина. Нажмите кнопку «Оптимальный», чтобы установить оптимальный размер пикселей.
5. Используйте кнопку приобретения Snap для сбора высококачественного изображения. Здесь, случайные поля зрения были выбраны изнутри опухоли, но и другие области, представляющие интерес могут применяться для различных приложений (сосуды, опухоли поля, глубина проникновения и т.д.)
6. Сохранить файлы изображений в формате, используемом конфокальным программным обеспечением (здесь, ".lsm") для автономной обработки и количественной оценки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если не все слайды изображены во время одного сеанса, сохраните настройки и перезагрузите их при последующих посещениях, хотя повторное изображение одного и того же слайда не рекомендуется из-за фотоотбеления.
7. Выполните количественные измерения интенсивности флуоресценции. Открыть Фиджи (Фиджи Просто ImageJ программного обеспечения)^19,23 и загрузить файл изображения .lsm, перетащив на состояние бар.
8. Разделите данные цветного канала. Перейти к изображению
9. Предварительно обработать флуоресценции изображения по мере необходимости, т.е. вычесть фоновый сигнал (Процесс »gt; Вычесть фон)или уменьшить шум с помощью метода фильтрации.
10. Сегмент цветной канал, соответствующий справочному белку (сосудистый, ядерный, клеточный пятно), установив порог на интенсивность сигнала(Изображение
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ручное пороговое значение вводит субъективность в анализ изображений, поэтому использование автоматизированного алгоритма порогового значения или ссылки на гистограммы изображений делает результаты анализа изображений менее предвзятыми.
11. Используйте этот порог, чтобы создать двоичную маску (Процесс
12. Измерение и этикетка ROIs в маске (Анализ
13. Применить ROIs к цвету канала, соответствующего антител интерес (Нажмите изображение канала, Анализ Это позволит применить ROIs маски к изображению антител и обеспечить измерения изображения для разделов меток в окне результатов. Сохранить результаты окна (Файл
14. Рассчитайте желаемую статистику интереса, например, средняя интенсивность флуоресценции, описанную здесь²⁴.
15. Выполните все этапы обработки, идентичные каждому изображению в наборе слайдов. Создайте макрос, чтобы автоматически сделать это для больших пакетов^{изображений 23.}
16. Для отображения изображения только после количественных измерений, применять качественные корректировки изображения для оптимизации визуализации моделей биораспределения путем корректировки минимального, максимума, яркости и контраста с теми же уровнями на всех слайдах (Изображение Яркость /Контрастность).
17. Преобразуйте тип изображения (Изображение , Typesgt; RGB Цвет) и сохранить файлы в безпотеревом типе изображения, таких как .tiff (Файл

Результаты

Метод IVIL был использован здесь для изучения биораспределения in vivo и взаимодействия тканей B7-H3-ICG и Iso-ICG, позволяя агентам после внутривенной инъекции в живое животное взаимодействовать с целевой тканью в течение 96 ч, а затем, как только ткани собраны, чтобы выступать в к...

Обсуждение

Этот метод имеет несколько важных шагов и требует потенциальных изменений для обеспечения успешной реализации. Во-первых, дозировка и сроки антитела / антитела конъюгированных внутривенных инъекций должны быть адаптированы к конкретному применению. Как правило, дозы должны быть испо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Model
FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J	The Jackson Laboratory	002374	Females, 4-6 weeks of age
Animal Handling Supplies
27G Catheter	VisualSonics	Please call to order	Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit
Alcohol Wipes	Fisher Scientific	22-246073
Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply)	Cardinal Health	2913
Heat Lamp	Morganville Scientific	HL0100
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	29404
Ophthalmic Ointment	Fisher Scientific	NC0490117
Surgical Tape	3M	1530-1
Tissue Collection
Disposable Base Molds	Fisher Scientific	22-363-556
Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium	Fisher Scientific	23-730-571
Surgical London Forceps	Fine Science Tools	11080-02
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Antibodies
AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG	Life Technologies	A-11006
AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A-11010
AlexaFluor-594 goat anti-human IgG	Life Technologies	A11014
Human IgG Isotype Control	Novus Biologicals	NBP1-97043
Humanized anti-netrin-1 antibody	Netris Pharma		contact@netrispharma.com
Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3)	Abcam	ab134161	EPNCIR122 Clone
Rat anti-Mouse CD31	BD Biosciences	550274	MEC 13.3 Clone
Reagents
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153-50G
Clear Nail Polish			Any local drug store
Indocyanine Green - NHS	Intrace Medical	ICG-NHS ester
Mounting Medium	ThermoFisher Scientific	TA-006-FM
Normal Goat Serum	Fisher Scientific	ICN19135680
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	14190250
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
Supplies
Adhesion Glass Slides	VWR	48311-703
Desalting Columns	Fisher Scientific	45-000-148
Glass Cover Slips	Fisher Scientific	12-544G
Hydrophobic Barrier Pen	Ted Pella	22311
Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-402-25
Slide Staining Tray	VWR	87000-136
Software
FIJI	LOCI, UW-Madison.	Version 4.0	https://fiji.sc/