Localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo per la valutazione della biodistribuzione terapeutica e diagnostica degli anticorpi nella ricerca sul cancro

Riepilogo

Il metodo di localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo (IVIL) può essere utilizzato per esaminare la biodistribuzione in vivo di anticorpi e jujuganti anticorpi per scopi oncologici negli organismi viventi utilizzando una combinazione di targeting per tumori in vivo ed immunostaining ex vivo Metodi.

Abstract

Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono strumenti importanti per il rilevamento, la diagnosi e il trattamento del cancro. Essi sono utilizzati per svelare il ruolo delle proteine nella tumorigenesi, possono essere diretti a biomarcatori tumorali che consentono il rilevamento e la caratterizzazione del tumore, e possono essere utilizzati per la terapia del cancro come mAbs o coniugati anticorpale-farmaco per attivare le cellule eftuali immunitarie, per inibire le cellule eftori immunitarie, per inibire le cellule eftuali immunitarie, per inibire le cellule efiloriche immunitarie, per inibire le cellule echeologiche immunitarie, per inibire le cellule ebrasive immunitarie vie di segnalazione, o uccidere direttamente le cellule che trasportano l'antigene specifico. Nonostante i progressi clinici nello sviluppo e nella produzione di nuovi e altamente specifici mAb, le applicazioni diagnostiche e terapeutiche possono essere compromesse dalla complessità e dall'eterogeneità del microambiente tumorale. Pertanto, per lo sviluppo di terapie e diagnostica efficienti basate su anticorpi, è fondamentale valutare la biodistribuzione e l'interazione del coniugato basato sugli anticorpi con il microambiente tumorale vivente. Qui, descriviamo in Vivo immunofluorescenza localizzazione (IVIL) come un nuovo approccio per studiare le interazioni di terapie e diagnostica basate su anticorpi nelle condizioni fisiologiche e patologiche in vivo. In questa tecnica, un anticorpo terapeutico o diagnostico specifico dell'antigene viene iniettato per via endovenosa in vivo e localizzato ex vivo con un anticorpo secondario in tumori isolati. IVIL, quindi, riflette la biodistribuzione in vivo di farmaci anticorpi e agenti di targeting. Due applicazioni IVIL sono descritte valutando la biodistribuzione e l'accessibilità degli agenti di contrasto basati su anticorpi per l'imaging molecolare del cancro al seno. Questo protocollo permetterà agli utenti futuri di adattare il metodo IVIL per le proprie applicazioni di ricerca basate su anticorpi.

Introduzione

Gli anticorpi monoclonali (mAb) sono grandi legocoproteine (circa 150 kDa) della superfamiglia immunoglobulina che sono secreti dalle cellule B e hanno una funzione primaria nel sistema immunitario per identificare e inibire la funzione biologica di, o segnare per distruzione, patogeni batterici o virali, e può riconoscere l'espressione anomala delle proteine sulle cellule tumorali¹. Gli anticorpi possono avere un'affinità estremamente elevata con i loro epitopi specifici fino alle concentrazioni di femtomolare, rendendoli strumenti molto promettenti in biomedicina². Con lo sviluppo della tecnologia dell'ibrido da parte di Milstein e del Kohler (premiato con il Premio Nobel nel 1984), la produzione di mAbs divenne possibile^{3 .} Più tardi, mAbs umani sono stati generati utilizzando la tecnologia di visualizzazione fago o ceppi di topi transgenici e ha rivoluzionato il loro uso come nuovi strumenti di ricerca e terapie^4,5.

Il cancro è un problema di salute mondiale e una delle principali cause di morte, creando la necessità di nuovi approcci per la prevenzione, la scoperta e la terapia⁶. Ad oggi, gli mAb hanno permesso l'estricazione del ruolo dei geni e delle loro proteine nella tumorigenesi e quando sono diretti contro i biomarcatori del cancro, possono consentire la rilevazione e la caratterizzazione del tumore per la stratificazione del paziente. Per la terapia del cancro, vengono sviluppati i coniugati bispecifici, i coniugati anticorpo-farmaco e i frammenti di anticorpi più piccoli come terapie, e per la somministrazione mirata di farmaci per migliorare l'efficacia terapeutica⁷. Inoltre, gli anticorpi servono per il biomarcatore mirato di agenti di contrasto per le modalità di imaging molecolare come la chirurgia a fluorescenza, l'imaging fotoacustico (PA), l'imaging molecolare degli ultrasuoni (US) e l'emissione di positroni clinicamente utilizzati tomografia (PET) o tomografia computerizzata a emissione di singoli fotoni (SPECT)⁸. Infine, gli anticorpi possono essere utilizzati anche come agenti tenetici che consentono la stratificazione dei pazienti e il monitoraggio della risposta per le terapie mirate⁹. Pertanto, nuovi mAbs stanno cominciando a svolgere un ruolo fondamentale nella diagnosi, diagnosi, e trattamento del cancro.

Nonostante i progressi critici nello sviluppo e nella produzione di mAb nuovi e altamente specifici, le applicazioni diagnostiche e terapeutiche possono essere rese inefficaci a causa della complessità dell'ambiente tumorale. Le interazioni anticorpali dipendono dal tipo di epitopo, cioè,se è lineare o conformazionale¹⁰. Oltre al riconoscimento degli antigeni, gli anticorpi devono superare le barriere naturali come le pareti del vaso, le membrane basali e lo stroma tumorale per raggiungere le cellule bersaglio che esprimono l'antigene. Gli anticorpi interagiscono con il tessuto non solo attraverso il dominio di legame dell'antigene a frammento variabile (Fab), ma anche attraverso il costante frammento cristallino (Fc) che porta ulteriormente alle interazioni fuori sede¹¹. Il targeting è complicato anche dall'espressione eterogenea dei marcatori tumorali in tutta la massa tumorale e l'eterogeneità nella vascolarizzazione tumorale e dal sistema linfatico^12,13. Inoltre, il microambiente tumorale è composto da fibroblasti associati al cancro che supportano le cellule tumorali, le cellule immunitarie tumorali che sopprimono le reazioni immunitarie anti-tumorali e l'endotelio tumorale che supporta il trasporto di ossigeno e sostanze nutritive, tutti che interferiscono con la penetrazione, la distribuzione e la disponibilità di terapie o diagnostica basate su anticorpi. Nel complesso, queste considerazioni possono limitare l'efficacia terapeutica o diagnostica, ridurre la risposta al trattamento, e può provocare resistenza al tumore.

Pertanto, per lo sviluppo di terapie e diagnostica efficienti basate su anticorpi, è fondamentale valutare la biodistribuzione e l'interazione del coniugato basato sugli anticorpi all'interno del microambiente tumorale. Attualmente, negli studi preclinici, l'espressione dei marcatori nei modelli di ricerca sul tumore viene analizzata ex vivo per colorazione immunofluorescenza (IF) delle sezioni tumorali¹⁴. La colorazione SE standard viene eseguita con anticorpi specifici del marcatore primario che vengono poi evidenziati da anticorpi secondari fluorescenti etichettati su fette di tessuto tumorale ex vivo che sono stati isolati dall'animale. Questa tecnica evidenzia la posizione statica del marcatore al momento della fissazione dei tessuti e non fornisce informazioni su come le terapie o la diagnostica basati su anticorpi potrebbero distribuire o interagire in condizioni fisiologiche. L'imaging molecolare di PET, SPECT, US e PA può fornire informazioni sulla distribuzione dell'agente di contrasto coniugato con anticorpi nei modelli preclinici viventi^8,15. Poiché queste modalità di imaging non sono invasive, è possibile eseguire studi longitudinali e raccogliere dati sensibili al tempo con un numero minimo di animali per gruppo. Tuttavia, questi approcci di imaging molecolare non invasivo non sono abbastanza sensibili e non hanno una risoluzione sufficiente per la localizzazione della distribuzione degli anticorpi a livello cellulare. Inoltre, le caratteristiche fisiche e biologiche dell'anticorpo primario possono essere drasticamente modificate dalla coniugazione di un agente di contrasto¹⁶.

Al fine di prendere in considerazione le condizioni fisiologiche e patologiche in vivo di come le terapie e la diagnostica basate su anticorpi interagiscono all'interno dell'ambiente tumorale e per ottenere una distribuzione cellulare e persino subcellulare ad alta risoluzione profili di anticorpi non coniugati, proponiamo un approccio IF, ritenuto In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL), in cui l'anticorpo specifico dell'antigene viene iniettato per via endovenosa in vivo. La terapia o diagnostica basata su anticorpi, agendo come anticorpo primario, circola nei vasi sanguigni funzionali e si lega alla proteina bersaglio nell'ambiente tumorale vivo e altamente accurato. Dopo l'isolamento dei tumori in vivo con l'anticorpo primario, viene utilizzato un anticorpo secondario per localizzare i coniugati degli anticorpi accumulati e conservati. Questo approccio è simile a un approccio di istologia IF descritto in precedenza iniettando anticorpi fluorescenti¹⁷. Anche se qui, l'uso di anticorpi non coniugati evita un potenziale cambiamento nelle caratteristiche di biodistribuzione indotte dalla modifica dell'anticorpo. Inoltre, l'applicazione ex vivo dell'anticorpo secondario fluorescente evita una possibile perdita di segnale di fluorescenza durante la raccolta e l'elaborazione dei tessuti e fornisce amplificazione dell'intensità del segnale di fluorescenza. Il nostro approccio di etichettatura riflette la biodistribuzione in vivo di farmaci basati su anticorpi e agenti mirati e può fornire importanti informazioni per lo sviluppo di nuovi agenti diagnostici e terapeutici.

In questo articolo, descriviamo due applicazioni del metodo IVIL applicate in studi precedenti che studiano la biodistribuzione e l'accessibilità degli agenti di contrasto basati su anticorpi per gli approcci di imaging molecolare per il rilevamento del cancro al seno. In primo luogo, la biodistribuzione di un controcorpo a raggi infrarossi vicino a un anticorpo (anticorpo anti-B7-H3 legato al colorante a fluorescenza infrarossa vicino, al verde indocianina, B7-H3-ICG) e all'agente di controllo isotipo (Iso-ICG) per la fluorescenza e la fotoacustica molecolare l'imaging è esplorato¹⁸. Il metodo di questa applicazione è descritto nel protocollo. Successivamente, i risultati della biodistribuzione di un anticorpo conformazionalmente sensibile al netrin-1, in genere non rilevabili con l'imaging TRADIZIONALE IF, utilizzato con imaging molecolare ad ultrasuoni, vengono quantificati e presentati nei risultati rappresentativi¹⁹. Al termine di questo documento di protocollo, i lettori dovrebbero sentirsi a proprio agio nell'adottare il metodo IVIL per le proprie applicazioni di ricerca basate su anticorpi.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Institutional Administrative Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) della Stanford University.

1. Modello murino transgenico dello sviluppo del cancro al seno

1. Osservare i topi dal modello di cancro desiderato per la crescita tumorale appropriata tramite la palpazione o la misurazione della pinza prima di procedere.
   NOTA: Qui è stato utilizzato il modello murino transgenico dello sviluppo del cancro al seno (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT). Questi animali sviluppano spontaneamente carcinomi mammari invasivi tra 6 e 12 settimane di età in ogni ghiandola mammaria²⁰. Le normali ghiandole mammarie sono state usate come controlli dai compagni di cucciolata transgenici-negativi e abbinati all'età.

2. Iniezione endovenosa di agenti anticorpi specifici e non specifici

1. Purificare gli anticorpi di controllo dell'isotipo antitomouse B7-H3 e coniglio IgG su una colonna di depurazione (ad esempio, PD-10) per rimuovere conservanti e buffer di stoccaggio seguendo le istruzioni del produttore.
   NOTA: Alcuni anticorpi potrebbero aver bisogno di un'ulteriore purificazione con il protocollo²¹basato su perline di agarose proteiche-agarose.
2. Dosaggi di aliquota di 33 g di ogni anticorpo coniugati in singoli tubi di microcentrifuga.
   NOTA: Il dosaggio dell'agente somministrato può variare a seconda dell'applicazione e corrisponde ai dosaggi in cui viene utilizzato regolarmente il coniugato anticorpo. La concentrazione delle soluzioni anticorpali è necessaria se il volume è superiore a 100 -L per la sicurezza degli animali.
3. Nel punto di tempo desiderato prima della raccolta dei tessuti, qui 96 h, anestesizzare l'animale che porta il tumore con 2% isoflurane che scorre in ossigeno a 2 L/min, e posto su uno stadio riscaldato 37 gradi centigradi. Fare un pizzico di dita dei dei impitori per assicurarsi che il livello corretto di anestesia è stato raggiunto prima della procedura.
4. Per preparare l'inoculazione della vena della coda delle soluzioni anticorpali, disinfettare la coda dell'animale asciugandosi tre volte con una salvietta alcolica. Dilatare le vene della coda riscaldandosi con un pad termico per circa 30 s. Evitare di riscaldare l'intero animale. Pulire nuovamente la coda con una pulizia dell'alcool dopo aver rimosso il pad termico.
5. Utilizzando un catetere della vena della coda 27G, inserire l'ago della farfalla in una delle due vene laterali della coda e fissare con attenzione la coda con l'ago inserito allo stage con un pezzo di nastro chirurgico.
   NOTA: il riflusso visibile del sangue nel catetere indica la corretta posizione dell'ago all'interno della vena posteriore.
6. Sciacquare il catetere con 25 o più luna di salina tampinatato sterile di fosfato (PBS), quindi iniettare la soluzione anticorpale nel catetere utilizzando siringhe di insulina. Sciacquare ancora una volta il catetere con 25 gradi di PBS sterile.
7. Rimuovere l'ago dalla coda e applicare la pressione per fermare qualsiasi sanguinamento.
8. Spegnere l'anestesia e osservare l'animale fino a quando completamente sveglio per eventuali segni di angoscia.

3. Raccolta e preparazione dei tessuti tumorali bersaglio

1. Nel momento desiderato, eutanasia umanamente l'animale secondo la procedura istituzionale accettabile, qui, per graduale inalazione di 100% CO₂ da un serbatoio di gas compresso con una portata di spostamento camera del 10-30% volume / min.
   NOTA: Alcune applicazioni della tecnica IVIL richiedono eutanasia per perfusione cardiaca con PBS per rimuovere liberamente circolante anticorpo^19,22.
2. Dopo la conferma dell'eutanasia umana attraverso la cessazione del movimento respiratorio e cardiaco, la mancanza di risposta ai pizzicamenti dei dita dei formici e l'ingrigimento delle membrane mucose, le accise dei tessuti tumorali che utilizzano forbici chirurgiche e pinze come segue:
   1. Posare il topo in posizione supina e afferrando solo lo strato esterno della pelle tra l'insieme di ghiandole mammarie più vicine alla coda (5^th) con pinze, fare una piccola incisione con un paio di forbici chirurgiche.
   2. Introdurre le forbici chiuse nel taglio e aprire lentamente la punta per separare con attenzione la pelle dalla membrana della parete addominale sottostante mantenendola intatta.
   3. Fare un'incisione verticale sull'addome, continuando a separare la pelle dalla membrana interna. Tra le ghiandole mammarie 3^rd e 4^th, fare un taglio orizzontale attraverso l'addome per consentire la retrazione della pelle e la visualizzazione delle ghiandole mammarie.
      NOTA: Tumori mammari e ghiandole si trovano superficialmente sotto la pelle.
   4. Afferrando ogni tumore o ghiandola normale con pinze, tagliare con cura la pelle attaccata utilizzando forbici chirurgiche.
3. Posizionare i tessuti eccitati in stampi di base monouso dei tessuti, preetichettati e riempiti con una temperatura di taglio ottimale (OCT) incorporando il mezzo e congelare rapidamente gli stampi posizionandosi sul ghiaccio secco. Al fine di studiare la somministrazione off-target, accise altri tessuti o organi di interesse(adesempio, il fegato o i polmoni).
   NOTA: Per sospendere il protocollo a questo punto, conservare i blocchi di tessuto congelato a -80 gradi fino a quando non è pronto per procedere.
4. Utilizzando un criostato, la sezione blocchi di tessuto congelato a 10 m di spessore e posizionare sezioni adiacenti su vetrini di vetro di adesione preetichettati.
   NOTA: Per sospendere il protocollo a questo punto, conservare le diapositive a -80 gradi centigradi fino a quando non si è pronti per procedere.

4. Protocollo di colorazione ex vivo

NOTA: Per il confronto quantitativo tra immagini di microscopia a fluorescenza, tutte le diapositive sono macchiate contemporaneamente con le stesse soluzioni preparate.

1. Sciacquare i vetrini con tissuma con temperatura ambiente PBS per 5 min per rimuovere lo OCT.
2. Delimitare le sezioni del tessuto con una penna a barriera idrofobica per ridurre il volume delle soluzioni necessarie durante la colorazione.
   NOTA: Fare attenzione a non lasciare che la penna venga eseguita sui campioni di tessuto in quanto può rimuovere il tessuto dal vetrino o impedire una corretta colorazione sulla porzione di tessuto interessata. Non permettere alle sezioni del tessuto di disidratarsi in qualsiasi punto.
3. Fissare le sezioni di tessuto con soluzione di paraformaldeide del 4% per 5 min.
4. Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min.
5. Permeabilizzare le sezioni di tessuto con 0.5% Triton-X 100 in PBS per 15 min.
6. Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min.
7. Bloccare i tessuti con 3% w/v bovine serum albumin (BSA) e 5% v/v siero di capra, entrambi in PBS (soluzione di blocco) per 1 h a temperatura ambiente.
   NOTA: Abbinare il siero della soluzione di blocco all'animale ospite dell'anticorpo secondario.
8. Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min.
9. Incubare sezioni con anticorpi primari di registrazione come desiderato, possibilmente un nucleare comune (ad esempio, DAPI), vascolare (ad esempio, CD31), o marcatore citoplasmico (ad esempio, actina). Qui, il ratto anti-topo CD31 (marcatore vascolare) a una diluizione 1:100 è stato utilizzato secondo le istruzioni del produttore nella soluzione di blocco durante la notte a 4 gradi centigradi protetta dalla disidratazione su un vassoio di scorrimento.
   NOTA: Non aggiungere ulteriori anticorpi primari o coniugati di anticorpi. Il coniugato che è stato iniettato e permesso di accumularsi nei tessuti in vivo agiscono come anticorpo primario.
10. Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min tre volte, cambiando ogni volta il PBS.
11. Incubare i vetrini con anticorpi secondari per etichettare gli anticorpi primari. Per questa applicazione, visualizzare anticorpo anti-B7-H3 utilizzando AlexaFluor-546 vaccino anti-coniglio capra coniugato (1:200 diluizione, ottimizzato secondo le istruzioni del produttore) e CD31 con AlexaFluor-488 anti-ratto anti-ratto anti-ratto anticorpo (1:200 diluizione, ottimizzata secondo le istruzioni del produttore) nella soluzione di blocco, protetta dalla luce e dalla disidratazione su un vassoio di scorrimento, per 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: gli anticorpi secondari provengono dallo stesso animale ospite, ma corrispondono all'affinità degli anticorpi secondari con le specie ospiti del rispettivo anticorpo primario. I vetrini sono protetti dalla luce da questo punto in poi.
12. Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min tre volte, cambiando ogni volta il PBS.
13. Applicare una goccia del supporto di montaggio al centro della fetta di tessuto e posizionare con attenzione un coverslip evitando l'intrappolamento di bolle d'aria.
14. Sigillare i bordi della coverslip con smalto trasparente e lasciare asciugare.
    NOTA: Per sospendere il protocollo fino a una settimana a questo punto, conservare le diapositive a -20 gradi centigradi fino a quando non si è pronti per procedere.

5. Imaging di microscopia confocale e analisi quantitativa delle immagini

NOTA: la preparazione del microscopio confocale e dei parametri di imaging dipenderà dal sistema confocale utilizzato. Il microscopio utilizzato qui è stato acquistato commercialmente (ad esempio, il sistema Meta LSM 510) e il software di acquisizione associato è stato utilizzato (ad esempio, zen 2009). Tuttavia, molti di questi passaggi si applicheranno a qualsiasi microscopio confocale e assumeranno conoscenze di microscopia confocale di base.

1. Dopo che il sistema è stato acceso e riscaldato, selezionare l'obiettivo desiderato; qui è stato utilizzato un obiettivo 20x (apertura numerica - 0,8).
2. Caricare una diapositiva di controllo positiva, coverslip verso il basso, per consentire l'impostazione dell'ottimizzazione per il segnale più luminoso. Imaging nel canale rosso, focalizzare il sistema sul campione in modalità Live imaging.
3. Per ogni canale laser utilizzato, ottimizzare l'intensità del laser, il guadagno principale e la dimensione del foro stenopeico come segue:
   1. Passare alla modalità Continua per l'imaging.
   2. Ottimizzare l'intensità laser (che controlla la potenza laser) e guadagno (Master) (che controlla la tensione per tubo fotomoltiplicatore) barre di scorrimento durante il monitoraggio dell'istogramma look Up Table (LUT). Regolare queste due impostazioni fino a quando l'intervallo dinamico dell'istogramma non viene riempito senza saturare i pixel.
      NOTA: Se l'intensità del laser è troppo alta, si verificherà il fotosbleaching. Se il guadagno (Maestro) è troppo alto, l'immagine diventerà rumorosa. Idealmente, il guadagno (Maestro) sarà al centro della sua gamma.
   3. Impostare il foro stenopeico su 1 unità ariosa (AU), che dà la massima risoluzione e la più sottile z-slice.
   4. Far scorrere la barra Scostamento digitale per ridurre al minimo il rumore del rumore sull'istogramma LUT per un vero sfondo nero.
      NOTA: una volta che le impostazioni di microscopia sono ottimizzate per ogni canale laser e obiettivo, mantenerle costanti per tutta la sessione di imaging e per l'imaging di tutti i vetrini, per consentire il confronto quantitativo tra le diapositive.
4. Nella scheda Modalità acquisizione, in Media,selezionare il numero e la profondità di bitdesiderati. Fare clic sul pulsante Ottimale per impostare le dimensioni ottimali in pixel.
5. Utilizzare il pulsante di acquisizione Snap per raccogliere un'immagine di alta qualità. Qui, campi di vista casuali sono stati selezionati dall'interno del tumore, ma altre aree di interesse possono applicarsi per diverse applicazioni (vasi, margini tumorali, profondità di penetrazione, ecc.)
6. Salvare i file di immagine nel formato utilizzato dal software confocal (qui, ".lsm") per l'elaborazione offline e la quantificazione.
   NOTA: se non tutte le diapositive vengono fotografate durante la stessa sessione, salvare le impostazioni e ricaricarle nelle visite successive, anche se non è consigliabile ricreare l'immagine della stessa diapositiva a causa del fotosbiancamento.
7. Eseguire le misurazioni dell'intensità quantitativa di fluorescenza. Aprire Fiji (Fiji Is Just ImageJ software)^19,23 e caricare un file di immagine .lsm trascinando sulla barra di stato.
8. Dividere i dati del canale a colori. Passare a Immagine > Pile > Dividi canali.
9. Pre-elaborare le immagini a fluorescenza in base alle esigenze, ovvero sottrarre il segnale di sfondo (Processo > Sottrai sfondo) o ridurre il rumore tramite un metodo di filtraggio.
10. Segmentare il canale di colore corrispondente alla proteina di riferimento (vascolare, nucleare, macchia cellulare) impostando una soglia sull'intensità del segnale (Immagine > Regola > Soglia).
    NOTA: la soglia manuale introduce la soggettività nell'analisi dell'immagine, pertanto, l'utilizzo di un algoritmo di soglia automatico o il riferimento agli istogrammi dell'immagine rende i risultati dell'analisi dell'immagine meno di parte.
11. Utilizzare questa soglia per creare una maschera binaria (Processo > Binario > Converti in maschera).
12. Misurare ed etichettare i ROI all'interno della maschera (Analizza > Analizza particelle > Controlla Aggiungi a gestore > OK).
13. Applicare ROI al canale di colore corrispondente all'anticorpo di interesse (Clicca immagine canale, Analizza > Strumenti > Gestione ROI > Misura). Questo applicherà i ROI della maschera all'immagine dell'anticorpo e fornirà le misure dell'immagine per le sezioni delle etichette nella finestra Risultati. Finestra Salva risultati (File > Salva).
14. Calcolare la statistica desiderata di interesse, come l'intensità media di fluorescenza come descritto qui²⁴.
15. Eseguire tutti i passaggi di elaborazione in modo identico a ogni immagine all'interno di un set di diapositive. Creare una macro per eseguire automaticamente questa operazione per i batch di immagini di grandi dimensioni²³.
16. Per la visualizzazione dell'immagine solo dopo misurazioni quantitative, applicare regolazioni qualitative dell'immagine per ottimizzare la visualizzazione dei modelli di biodistribuzione regolando il minimo, il massimo, la luminosità e il contrasto agli stessi livelli su tutte le diapositive(Immagine > Regola > Luminosità/Contrasto).
17. Convertire il tipo di immagine (Immagine > Tipo > Colore RGB) e salvare i file in un tipo di immagine senza perdita di dati, ad esempio .tiff ( File> Salva con nome > Tiff...) da utilizzare nelle presentazioni e nelle pubblicazioni.

Risultati

Il metodo IVIL è stato utilizzato qui per esaminare la biodistribuzione in vivo e l'interazione dei tessuti di B7-H3-ICG e Iso-ICG, consentendo agli agenti, dopo l'iniezione endovenosa in un animale vivente, di interagire con il tessuto bersaglio per 96 h, e poi una volta che i tessuti sono primario anticorpi durante l'immunostaining ex vivo. Il metodo IVIL è stato anche confrontato con la colorazione IF standard dei tessuti per il marcatore B7-H3. Le normali ghiandole mammarie murine n...

Discussione

Questo metodo ha diversi passaggi critici e richiede potenziali modifiche per garantire una corretta implementazione. In primo luogo, il dosaggio e la tempistica dell'iniezione endovenosa anticorpo/anticorpo devono essere adattati all'applicazione specifica. Generalmente, dosaggi dovrebbero essere utilizzati che sono coerenti con come l'anticorpo coniugato sarà in genere utilizzato, cioè, dosaggi corrispondenti dell'anticorpo terapeutico o agente di contrasto basato su anticorpi. Inoltre, i tempi della raccolta dei tes...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Model
FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J	The Jackson Laboratory	002374	Females, 4-6 weeks of age
Animal Handling Supplies
27G Catheter	VisualSonics	Please call to order	Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit
Alcohol Wipes	Fisher Scientific	22-246073
Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply)	Cardinal Health	2913
Heat Lamp	Morganville Scientific	HL0100
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	29404
Ophthalmic Ointment	Fisher Scientific	NC0490117
Surgical Tape	3M	1530-1
Tissue Collection
Disposable Base Molds	Fisher Scientific	22-363-556
Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium	Fisher Scientific	23-730-571
Surgical London Forceps	Fine Science Tools	11080-02
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Antibodies
AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG	Life Technologies	A-11006
AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A-11010
AlexaFluor-594 goat anti-human IgG	Life Technologies	A11014
Human IgG Isotype Control	Novus Biologicals	NBP1-97043
Humanized anti-netrin-1 antibody	Netris Pharma		contact@netrispharma.com
Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3)	Abcam	ab134161	EPNCIR122 Clone
Rat anti-Mouse CD31	BD Biosciences	550274	MEC 13.3 Clone
Reagents
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153-50G
Clear Nail Polish			Any local drug store
Indocyanine Green - NHS	Intrace Medical	ICG-NHS ester
Mounting Medium	ThermoFisher Scientific	TA-006-FM
Normal Goat Serum	Fisher Scientific	ICN19135680
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	14190250
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
Supplies
Adhesion Glass Slides	VWR	48311-703
Desalting Columns	Fisher Scientific	45-000-148
Glass Cover Slips	Fisher Scientific	12-544G
Hydrophobic Barrier Pen	Ted Pella	22311
Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-402-25
Slide Staining Tray	VWR	87000-136
Software
FIJI	LOCI, UW-Madison.	Version 4.0	https://fiji.sc/