Farelerin Nöral Kök Hücreleri ve Beyinlerinde 5-Hidroksimetilsitozozin Insaptama

Özet

Burada, immünororesans boyama ve DNA nokta-leke yöntemleri kullanarak, hücre ve beyin dokularında 5-hidroksimetilitozin tespit etmek için bir protokol salıyoruz.

Özet

Memeli genomunda birden fazla DNA modifikasyonu tespit edilmiştir. Bunun 5-metilsitozin ve 5-hidroksimetilsitozin aracılı epigenetik mekanizmaları yoğun olarak çalışılmıştır. 5-hidroksimetilsitozin beynin embriyonik ve doğum sonrası gelişimi sırasında dinamik özellikler gösterir, gen ekspresyonunda düzenleyici bir işlev oynar ve birden fazla nörolojik bozukluklar yer almaktadır. Burada, kültürlü hücrelerde ve farenin beyin dokularında 5-hidroksimetilitozini saptamak için immünoresans boyama ve DNA nokta-leke dahil olmak üzere ayrıntılı yöntemleri açıklıyoruz.

Giriş

DNA modifikasyonu, histon modifikasyonu ve RNA modifikasyonu da dahil olmak üzere epigenetik modifikasyonlar, çeşitli biyolojik süreçler ve^{hastalıklarda}temel işlevleri oynamak için gösterilmiştir 1^{,2,3, 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7}. Uzun bir süre için, DNA metilasyon (yani, 5-metisitozin (5-mC)) son derece istikrarlı bir epigenetik belirteç olarak görülüyor ve daha fazla genom değiştirilemez. Son zamanlarda, 5-mC TET1, TET2 ve TET3^8,9dahil olmak üzere TET (Ten-onbir translokasyonlar) aile proteinleri tarafından 5-hidroksimetilsitozin (5-hmC) oksitlenmiş olabilir bulunmuştur. Daha ileri çalışmalar 5-hmC istikrarlı bir belirteç olarak hizmet verebilir ve gen ekspresyonu^düzenleyen4,^10,11,12ile biyolojik roller oynayabilir göstermektedir.

Mevcut kanıtlar 5-hmC yüksek memelilerde dokuların diğer türlerine göre nöronal dokularda / hücrelerde zenginleştirilmiş olduğunu göstermektedir, ve nöronal gelişim sırasında dinamik özellikler sergiler^13,14. Nöronal sistemde, 5-hmC aracılı epigenetik değişiklikler nöral kök hücrelerin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar, nöronal aktivite, öğrenme ve bellek, ve Rett sendromu dahil olmak üzere birden fazla nörolojik bozukluklar yer almaktadır, otizm, Alzheimer hastalık, Huntington hastalığı, vb^{2,13,15,16,17,18,19,20}.

Hücre ve dokularda 5-hmC tespit etmek için çeşitli yaklaşımlar vardır^{14,21,22,23,24}. Burada, 5-hmC varlığını tespit etmek ve 5-hmC küresel düzeyini ölçmek için iki yöntem açıklar: immünoresans boyama ve DNA nokta-blot. Bu iki yöntem uygun ve duyarlı, ve başarıyla önceki çalışmalarda kullanılmıştır^{25,26,27,28,29,30}. Bu iki yöntemin temel adımları DNA denatürasyonuvardır. 5-hmC immünoresans boyama için 1 M HCl'li numunelerin ön tedavisi gereklidir. 5-hmC nokta-blot için DNA denatürasyonu NaOH çözeltisi ile yapılır. Yeni nesil sıralama ile birlikte bu iki yöntem 5-hmC işlevini araştırmak için çok yararlı araçlardır.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Zhejiang Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Yetişkin Nöral Kök Hücre ve Nöronların Kültürü

1. Daha önce açıklandığı gibi bir yetişkin (8-10 haftalık) C57/BL6 erkek fare ön beyin yetişkin nöral kök hücreleri izole^31,32.
2. DMEM/F-12 ortamlarında 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, %2 B27 takviyesi, %1 antibiyotik antimikotik ve %5 CO₂ inkübatörde 37 °C'de 2 mM L-Glutamin içeren yetişkin nöral kök hücreler. Daha önce açıklandığı gibi 1 μM retinoik asit ve 5 μM forskolin ile yetişkin nöral kök hücrelerin farklılaşması nı neden 48 h^,32.
3. Embriyonik gün 17 nöronlar izole (E17) fare ve kültür hipokampi nörobazal orta içeren 0.25% L-Glutamin, 0.125% GlutaMax ve% 2 B27 ek 5% CO₂ kuvöz 37 ° C daha önce açıklandığı gibi³³.

2. Farenin Transkardiyal Perfüzyonu

1. Deneyden bir gün önce %10 kloral hidrat, %4 paraformaldehit (PFA) ve fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
2. Yetişkin bir erkek veya dişi C57 BL/6J fareyi %10 kloral hidrat (50 mg/kg, i.p.) ile anesteize edin ve hayvanın vücut reaksiyonu kontrol edilerek derinden anestezi altında olduğundan emin olun. Plastik bir tahta üzerinde yapışkan bant ile her uzuv düzeltin (bir yüz-up pozisyonda).
3. Ameliyat makası ile deri ve sonra kas kesin. Göğüs boşluğunu cerrahi bir makasla açın. Kalbi ortaya çıkar ve sağ atriyumun küçük bir kısmını ince bir cerrahi makasla kes.
4. Fareyi sol ventrikülden 10 mL tek kullanımlık sterilize şırınga ile soğuk PBS (yetişkin fare başına yaklaşık 30 mL) ile perfüzyon.
5. Fareyi sert olana kadar %4 PFA (yetişkin fare başına 10 dakikada yaklaşık 30 mL) ile perfüzyon edin.
6. Farenin kafatasını kemik çerteleriyle açın. Beyni çıkarın ve 4 °C'de fiksasyon sonrası için 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde %4 PFA'nın 5 mL'sine yerleştirin.
   NOT: Ameliyat bittikten sonra cerrahi alanı temizleyin.
7. En az 24 saat sonra, beyin örneklerini 4 °C'de tam dehidratasyon için %30 sakaroz çözeltisine aktarın.

3. Beyin Kesiti

1. Beyin örneklerini en uygun kesme sıcaklık bileşimesini (OCT) küçük bir kapta yerleştirin ve -20 °C'de en az 1 saat soğutun.
2. Bir kriyostat mikrotom ile 20-40 μm kalınlığında kesit beyin örnekleri.
3. Bölümleri PBS'ye toplayın ve 4 °C'de saklayın.

4. İmmünofluoresan Boyama

1. Hedeflenen beyin bölgeleri ile bölümleri almak ve PBS ile 24-iyi plaka içine koyun. Bir kapak üzerinde kültürlü hücreler için, doğrudan adım 4.2 gidin.
2. 10 dakika oda sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde PBS ile yıkayın.
3. PBS'yi çıkarın ve önceden ısıtılmış 1 M HCl ile 37 °C'de 30 dakika tedavi edin.
   NOT: 1 mL hidroklorik asit (%36-38) ekleyerek 1 M HCl hazırlayın kimyasal bir başlık içinde su 10 mL içine. 37 °C'de kuvözde 1 M HCl önceden ısıtın.
4. Örnekleri PBS ile 5 dk boyunca yıkayın.
5. Oda sıcaklığında shaker üzerinde % 3 normal keçi serumu ve %0.1 Triton X-100 içeren PBS içeren blok numuneler.
6. Shaker üzerinde 4 °C'de bir gecede belirli primer antikorlar içeren kuluçka bölümleri.
   NOT: Aşağıdaki primer antikorları kullanın: poliklonal tavşan antikorları anti-5-hidroksimetilsitozin (1:5,000), fare monoklonal antikor anti-NeuN (1:500).
7. Örnekleri alın ve 1 saat oda sıcaklığında daha fazla kuluçka.
8. Numuneleri PBS ile 10 dakika yıkayın.
9. Çalkalama da oda sıcaklığında primer antikorlara karşılık gelen ikincil antikorlarla kuluçkaya yatırın. Alüminyum ile plaka kapağı.
   NOT: Aşağıdaki ikincil antikorları kullanın: Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG (1:500), Alexa Fluor 568 keçi anti-fare IgG (1:500). 4′-6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ile karşı leke çekirdekleri.
10. Numuneleri 10 dakika boyunca PBS ile çalkalayıcıüzerinde yıkayın. Bunu iki kez daha tekrarlayın.
11. Slaytların üzerine beyin bölümlerini monte edin, uygun miktarda antifade montaj ortamı (yaklaşık 100-150 μL) ekleyin ve birinci sınıf camla kaplayın. Ojeli fok.
12. Düzenli veya konfokal floresan mikroskobu ile fotoğraf çek.

5. Genomik DNA İzolasyon

1. Servikal çıkış tarafından yetişkin bir C57 BL/6J fare (erkek veya kadın) ötenazi ve beyin kaldırın.
2. Buz soğutmalı bir çanak üzerinde hipokampus, korteks ve beyincik dokuları incelemek. 1 mL DNA lisis tamponunda doku öğütücü ile dokuları öğütün ve temiz mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 600 μL lysis tampon başına 250 μg proteinaz K ekleyin. Hücre peletleri için, doğrudan lysis tampon ekleyin, proteinaz K, ve iyice karıştırın.
   NOT: DNA lysis tamponu hazırlayın: 5 mM EDTA, %0.2 SDS, 100 mM Tris-HCl'de 200 mM NaCl, pH 8.5. Deneyden önce doku öğütücüse otoklavı.
3. İkinci gün, 37 °C'de en az 12 saat boyunca numune başına yaklaşık 50 μg RNase A ekleyin.
4. Fenol eşit hacimli ekleyin:kloroform:isoamyl alkol (25:24:1) ve tamamen karıştırın.
5. 15 dakika boyunca 20.817 x g santrifüj ve yeni bir mikrosantrifüj tüp içine supernatant çıkarın.
6. DNA'yı çökeltmek için süpernatant'a 600 μL kloroform ekleyin ve iyice karıştırın.
7. 15 dakika boyunca 20.817 x g santrifüj ve başka bir yeni tüp içine supernatant çıkarın.
8. Supernatant'a 500 μL isopropanol ekleyin ve iyice karıştırın.
9. 15 dakika boyunca 20.817 x g santrifüj ve supernatant tamamen çıkarın.
10. 1 mL%70 etanol, santrifüj 20.817 x g 1 dk ile yıkayın ve supernatant tamamen çıkarın. Bir kez tekrarlayın.
11. DNA peletini tamamen kurutun.
12. Tris-HCl tamponu (pH 8.5) ile DNA peletini uygun konsantrasyona kadar çözün.

6. DNA Nokta Blot

1. Çözeltileri hazırlayın: 2 M NaOH, Tris-HCl tampon (pH 8.5), 6x tuzlu sodyum sitrat (SSC).
2. Örnek karışımı Tablo 1olarak yapın.
3. 10 0 0 00 dakika boyunca 100 °C'de DNA örneklerini denatüre edin ve buzüzerinde soğutun.
4. Naylon membranın uygun boyutunu kesin (örn. Hybond-N+) ve 6x SSC ile durula.
5. Membranı nokta-leke aparatına koyun ve vakum pompasına bağlayın. Membran üzerine nokta başına karışım Nokta 6 μL.
6. 80 °C'de 30 dakika hibritleştirin ve tris-tamponlu tuzlu (TBS) içinde yağsız süt ile örnek membran blok 1 saat.
7. Bir gecede 4 °C'de birincil antikor ile inkübat.
   NOT: Aşağıdaki primer antikor: poliklonal tavşan anti-5-hidroksimetilsitozin (1:5,000).
8. İkinci gün, numune membranlarını oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
9. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca anti-tavşan ikincil antikor (1:5,000) ile membran kuluçka.
10. 10 dk. TBS ile yıkayın.
11. Kemilüminesans sinyallerini görselleştirin ve sinyal yoğunluklarını ölçün.

Sonuçlar

Erişkin farelerin hipokampusundaki 5-hmC dağılımını ortaya çıkarmak için nöronal hücrelere (NeuN) ve 5-hmC'ye karşı antikorlarla immünorfloresans uyguladık. Hipokampus, 5-hmC nöronal hücre belirteci NeuN ile iyi lokalize (Şekil 1A-H), nöronlarda 5-hmC bir zenginleştirme düşündüren.

Nöronal gelişim sırasında 5-hmC'nin dinamiklerini belirlemek için ilk olarak çoğalan ve farklılaşmış erişkin nöral kök hücrelerde...

Tartışmalar

Epigenetik modifikasyonlar beyin gelişimi, olgunlaşma ve fonksiyon sırasında önemli roller oynar. DNA modifikasyonu için kararlı bir belirteç olarak, dinamik 5-hmC davranışsal adaptasyon, nöronal aktivite yanıt verir ve pozitif gen ekspresyonu ile ilişkilidir; böylece, beyin ve nörolojik bozukluk⁴normal fonksiyonu nda yer almaktadır. Hücre ve dokularda işlevini keşfetmek için, 5-hmC varlığını tespit etmek ve tedavi öncesi ve sonrası düzeyini karşılaştırmak için gere...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )	Sigma-Aldrich	D8417
Adobe Photoshop software	Adobe Inc.	/
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher	A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher	A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine	Active Motif	39769
anti-NeuN	Millipore	MAB377
B27 supplement	Gibco	12587-010
B27 supplement	Gibco	12580-010
B27 supplement	Gibco	17504-044
Cryostat microtome	Leica	CM1950
DMEM/F-12 medium	OmegaScientific	DM25
Epidermal growth factor	PeproTech	100-15
Fibroblast growth factor-basic	PeproTech	100-18B
Forskolin	Sigma-Aldrich	F6886
GlutaMax	Thermo	35050061
L-Glutamine	Gibco	25030-149
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Normal goat serum	Vector Laboratories	Z0325
Nylon membrane (Hybond™-N+ )	Amersham Biosciences	RPN303B
OCT	Leica	14020108926
Pen Strep	Gibco	15140-122
Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )	Sigma-Aldrich	516726
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899-10
Proteinase K	VVR	39450-01-6
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Triton X-100	Solarbio	T8210