La détection de 5-Hydroxymethylcytosine dans les cellules souches neurales et le cerveau des souris

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour détecter 5-hydroxymethylcytosine dans les cellules et les tissus cérébraux, utilisant la coloration d'immunofluorescence et les méthodes de point-blot d'ADN.

Résumé

Plusieurs modifications de l'ADN ont été identifiées dans le génome des mammifères. De cela, 5-méthylcytosine et 5-hydroxymethylcytosine-négociés mécanismes épigénétiques ont été intensivement étudiés. 5-hydroxymethylcytosine affiche des caractéristiques dynamiques pendant le développement embryonnaire et postnatal du cerveau, joue une fonction de régulation dans l'expression des gènes, et est impliqué dans de multiples troubles neurologiques. Ici, nous décrivons les méthodes détaillées comprenant la coloration d'immunofluorescence et le point-blot d'ADN pour détecter 5-hydroxymethylcytosine dans les cellules cultivées et les tissus de cerveau de la souris.

Introduction

Les modifications épigénétiques, y compris la modification de l'ADN, la modification de l'histone et la modification de l'ARN, ont été montrées pour jouer des fonctions essentielles dans divers processus biologiques et maladies^{1,2,3, 4 ( en} plus) ^{, 5 Annonces , 6} Annonces ^{, 7}. Pendant longtemps, la méthylation de l'ADN (c.-à-d. 5-méthylcytosine (5-mC)) a été considérée comme un marqueur épigénétique très stable et ne peut pas être modifiée davantage dans le génome. Récemment, il a été constaté que 5-mC pourrait être oxydé à 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) par TET (Ten-eleven translocations) protéines familiales, y compris TET1, TET2, et TET3^8,9. D'autres études montrent que 5-hmC pourrait servir de marqueur stable et jouer des rôles biologiques en régulant l'expression des gènes^4,10,11,12.

Les preuves actuelles indiquent que le 5-hmC est fortement enrichi dans les tissus/cellules neuronaux par rapport à d'autres types de tissus chez les mammifères, et présente des dispositifs dynamiques pendant le développement neuronal^13,14. Dans le système neuronal, les modifications épigénétiques négociées 5-hmC jouent un rôle important dans la régulation des cellules souches neurales, de l'activité neuronale, de l'apprentissage et de la mémoire, et sont impliquées dans de multiples troubles neurologiques, y compris le syndrome de Rett, l'autisme, la maladie d'Alzheimer maladie, la maladie de Huntington, etc.^{2,13,15,16,17,18,19,20}.

Il existe plusieurs approches pour détecter 5-hmC dans les cellules et les tissus^{14,21,22,23,24}. Ici, nous décrivons deux méthodes pour détecter l'existence de 5-hmC et quantifier le niveau global de 5-hmC : coloration d'immunofluorescence et point-blot d'ADN. Ces deux méthodes sont pratiques et sensibles, et ont été utilisées avec succès dans les études précédentes^{25,26,27,28,29,30}. Les étapes clés de ces deux méthodes sont la dénaturation de l'ADN. Pour la coloration d'immunofluorescence de 5-hmC, le pré-traitement des échantillons avec 1 M HCl est exigé. Pour 5-hmC dot-blot, la dénaturation de l'ADN est effectuée avec la solution NaOH. Ces deux méthodes ainsi que le séquençage de la prochaine génération sont des outils très utiles pour étudier la fonction de 5-hmC.

Protocole

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité d'éthique animale de l'Université du Zhejiang.

1. La culture des cellules souches et neurones neuronaux neuronaux adultes

1. Isoler les cellules souches neurales adultes du cerveau d'un adulte (8-10 semaines) souris mâle C57/BL6 tel que décrit précédemment^31,32.
2. Culture cellules souches neurales adultes dans le milieu DMEM/F-12 contenant 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% Supplément B27, 1% antibiotique-antimycotique, et 2 mM L-Glutamine dans un incubateur de CO₂ de 5% à 37 oC. Induire la différenciation des cellules souches neurales adultes avec 1 'M d'acide rétinoïque et 5 'M forskolin e pour 48 h comme décrit précédemment^31,32.
3. Isoler les neurones du jour embryonnaire 17 (E17) hippocampi de la souris et de la culture avec un milieu neurobasal contenant 0,25% de L-Glutamine, 0,125% GlutaMax et 2% Supplément B27 dans un incubateur de 5% CO₂ à 37 oC comme décrit précédemment³³.

2. Perfusion transcardique de la souris

1. Préparer 10 % d'hydrate de chloral, 4 % de paraformaldéhyde (PFA) et de phosphate tamponné salin (PBS) un jour avant l'expérience, et stocker à 4 oC.
2. Anesthésiez une souris C57 BL/6J mâle ou femelle adulte avec 10 % d'hydrate de chloral (50 mg/kg, i.p.), et assurez-vous que l'animal est profondément anesthésié en vérifiant la réaction du corps. Fixer chaque membre avec du ruban adhésif sur une planche en plastique (en position face cachée).
3. Couper la peau, puis le muscle avec des ciseaux de chirurgie. Ouvrez la cavité thoracique à l'aide d'un ciseau chirurgical. Exposer le cœur et couper une petite partie de l'atrium droit avec un ciseaux chirurgicaux fin.
4. Perfuser la souris avec une seringue stérilisée jetable de 10 ml du ventricule gauche avec du PBS froid (environ 30 ml par souris adulte).
5. Perfil la souris avec 4% de PFA (environ 30 ml en 10 min par souris adulte) jusqu'à ce qu'elle soit raide.
6. Ouvrez le crâne de la souris avec des forceps osseux. Retirer le cerveau et mettre en 5 ml de 4 % de PFA dans un tube de centrifugeuse de 15 ml pour la post-fixation à 4 oC.
   REMARQUE: Nettoyer la zone chirurgicale après la chirurgie a terminé.
7. Au moins 24 h plus tard, transférez les échantillons de cerveau dans une solution de saccharose de 30% pour une déshydratation complète à 4 oC.

3. Sectionnement du cerveau

1. Intégrer les échantillons de cerveau dans un composé optimal de température de coupe (OCT) dans un petit récipient, et refroidir à -20 oC pendant au moins 1 h.
2. Section des échantillons de cerveau à une épaisseur de 20-40 m avec un microtome de cryostat.
3. Recueillir les sections dans le PBS et les stocker à 4 oC.

4. Staining immunofluorescence

1. Ramassez les sections avec les régions ciblées du cerveau et mettez-les dans une plaque de 24 puits avec PBS. Pour les cellules cultivées sur un bordereau, allez directement à l'étape 4.2.
2. Laver avec du PBS sur le shaker à température ambiante pendant 10 min. Répétez cette double fois de plus.
3. Retirer le PBS et traiter avec 1 M HCl préchauffé pendant 30 min à 37 oC.
   REMARQUE: Préparer 1 M HCl en ajoutant 1 ml d'acide chlorhydrique (36-38%) dans 10 ml d'eau dans une hotte chimique. Préchauffer 1 M HCl dans l'incubateur à 37 oC.
4. Laver les échantillons avec du PBS pendant 5 min. Répétez cette fois de plus.
5. Bloquer les échantillons avec PBS contenant 3% de sérum de chèvre normal et 0,1% Triton X-100 pour 1 h sur le shaker à température ambiante.
6. Incuber les sections avec des anticorps primaires spécifiques pendant la nuit à 4 oC sur le shaker.
   REMARQUE: Utilisez les anticorps primaires suivants : anticorps polyclonal de lapin anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5,000), anticorps monoclonal de souris anti-NeuN (1:500).
7. Sortez les échantillons et incubez à température ambiante pendant 1 h.
8. Laver les échantillons avec du PBS pendant 10 min. Répétez cette fois de plus.
9. Incuber avec des anticorps secondaires correspondant aux anticorps primaires à température ambiante pendant 1 h sur le shaker. Couvrir la plaque d'aluminium.
   REMARQUE: Utilisez les anticorps secondaires suivants : Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG (1:500), Alexa Fluor 568 chèvre anti-souris IgG (1:500). Counterstain noyaux avec 4-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
10. Laver les échantillons avec du PBS pendant 10 min sur le shaker. Répétez cette répétition deux fois de plus.
11. Montez les sections du cerveau sur les diapositives, ajoutez une quantité appropriée de milieu de montage antifade (environ 100-150 l), et recouvrez-la de verre de couverture haut de gamme. Sceller avec du vernis à ongles.
12. Prenez des images avec un microscope à fluorescence régulier ou confocal.

5. Isolement d'ADN génomique

1. Euthanasier une souris adulte C57 BL/6J (mâle ou femelle) par luxation cervicale et enlever le cerveau.
2. Disséquer les tissus de l'hippocampe, du cortex et du cervelet sur un plat refroidi à la glace. Moudre les tissus avec un broyeur de tissu dans 1 ml de tampon de lyse d'ADN et transférer dans le tube propre de microcentrifuge. Ajouter 250 g de protéinase K par 600 l de tampon de lyse. Pour les granulés cellulaires, ajouter directement le tampon de lyse, la protéinase K, et bien mélanger.
   REMARQUE: Préparer le tampon de lyse d'ADN : 5 mM EDTA, 0,2 % SDS, 200 mM NaCl en 100 mM Tris-HCl, pH 8,5. Laver et autoclaver le broyeur de tissu avant l'expérience.
3. Le deuxième jour, ajouter environ 50 g de RNase A par échantillon pendant au moins 12 h à 37 oC.
4. Ajouter un volume égal de phénol:chloroform:isoamyl alcool (25:24:1) et mélanger complètement.
5. Centrifugeuse à 20 817 x g pendant 15 min, et retirez le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifuge.
6. Ajouter 600 l de chloroforme au supernatant pour précipiter l'ADN, et bien mélanger.
7. Centrifugeuse à 20 817 x g pendant 15 min, et retirez le supernatant dans un autre nouveau tube.
8. Ajouter 500 oL d'isopropanol au supernatant et bien mélanger.
9. Centrifugeàeur à 20 817 x g pendant 15 min, et retirez complètement le supernatant.
10. Laver les précipitations avec 1 ml d'éthanol à 70 %, la centrifugeuse à 20 817 x g pendant 1 min, et retirer complètement le supernatant. Répétez une fois.
11. Séchez complètement la pastille d'ADN.
12. Dissoudre le granule d'ADN avec le tampon Tris-HCl (pH 8.5) à la bonne concentration.

6. Blot de point d'ADN

1. Préparer les solutions: 2 M NaOH, Tris-HCl tampon (pH 8.5), 6x citrate de sodium salin (SSC).
2. Faire le mélange d'échantillon comme tableau 1.
3. Dénaturer les échantillons d'ADN à 100 oC pendant 10 min et refroidir sur la glace.
4. Couper la bonne taille de la membrane de nylon (p. ex., Hybond-NMD) et rincer à l'adresse 6x SSC.
5. Placez la membrane sur l'appareil à points et connectez-vous à la pompe à vide. Spot 6 'L de mélange par point sur la membrane.
6. Hybrider pendant 30 min à 80 oC et bloquer la membrane de l'échantillon avec du lait sans gras dans la saline (TBS) tamponnée tris pendant 1 h.
7. Incuber avec l'anticorps primaire à 4 oC pendant la nuit.
   REMARQUE : l'anticorps primaire suivant : lapin polyclonal anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5,000).
8. Le deuxième jour, incuber les membranes de l'échantillon à température ambiante pendant 1 h. Laver avec le SCT pendant 10 min. Répétez ce lavage deux fois de plus.
9. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire anti-lapin (1:5 000) pendant 30 min à température ambiante.
10. Laver avec le SCT pendant 10 min. Répétez ce lavage deux fois de plus.
11. Visualisez les signaux de chimiluminescence et quantifiez les intensités du signal.

Résultats

Pour révéler la distribution de 5-hmC dans l'hippocampe des souris adultes, nous avons exécuté l'immunofluorescence avec des anticorps contre des cellules neuronales (NeuN) et 5-hmC. Dans l'hippocampe, 5-hmC co-localisé bien avec le marqueur cellulaire neuronal NeuN (Figure 1A-H), suggérant un enrichissement de 5-hmC dans les neurones.

Pour déterminer la dynamique du 5-hmC pendant le développement neuronal, un point-blot a été réalisé ...

Discussion

Les modifications épigénétiques jouent des rôles essentiels pendant le développement, la maturation et la fonction du cerveau. Comme marqueur stable pour la modification d'ADN, le 5-hmC dynamique répond à l'adaptation comportementale, à l'activité neuronale, et est positivement corrélé avec l'expression de gène ; ainsi, il est impliqué dans la fonction normale du cerveau et du désordre neurologique^4. Pour explorer sa fonction dans les cellules et les tissus, il est nécessaire de dé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )	Sigma-Aldrich	D8417
Adobe Photoshop software	Adobe Inc.	/
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher	A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher	A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine	Active Motif	39769
anti-NeuN	Millipore	MAB377
B27 supplement	Gibco	12587-010
B27 supplement	Gibco	12580-010
B27 supplement	Gibco	17504-044
Cryostat microtome	Leica	CM1950
DMEM/F-12 medium	OmegaScientific	DM25
Epidermal growth factor	PeproTech	100-15
Fibroblast growth factor-basic	PeproTech	100-18B
Forskolin	Sigma-Aldrich	F6886
GlutaMax	Thermo	35050061
L-Glutamine	Gibco	25030-149
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Normal goat serum	Vector Laboratories	Z0325
Nylon membrane (Hybond™-N+ )	Amersham Biosciences	RPN303B
OCT	Leica	14020108926
Pen Strep	Gibco	15140-122
Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )	Sigma-Aldrich	516726
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899-10
Proteinase K	VVR	39450-01-6
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Triton X-100	Solarbio	T8210