A detecção de 5-Hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar 5 hydroxymethylcytosine nas pilhas e nos tecidos do cérebro, utilizando a mancha da imunofluorescência e os métodos do dot-borrão do ADN.

Resumo

As modificações múltiplas do ADN foram identificadas no genoma mamífero. Deste, 5-methylcytosine e 5-hydroxymethylcytosine-mediam mecanismos epigenéticas foram estudados intensivamente. 5-Hidroximetilcitosina apresenta características dinâmicas durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal do cérebro, desempenha uma função reguladora na expressão gênica, e está envolvida em múltiplas desordens neurológicas. Aqui, nós descrevemos os métodos detalhados que incluem a coloração da imunofluorescência e o dot-borrão do ADN para detectar 5 hydroxymethylcytosine em pilhas cultivadas e em tecidos do cérebro do rato.

Introdução

As modificações epigenéticas, incluindo a modificação do ADN, a modificação do histona e a modificação do RNA, foram mostradas para jogar funções essenciais em processos e em doenças biológicos diversos^{1,2,3, 4. º , 5. º , 6} anos de ^{, 7}. por um longo tempo, METILAÇÃO de DNA (ou seja, 5-metilcitosina (5-MC)) tem sido visto como um marcador epigenético altamente estável e não pode ser mais modificado no genoma. Recentemente, verificou-se que 5-MC poderia ser oxidado a 5-Hidroximetilcitosina (5-hmC) por Tet (dez-onze translocações) proteínas da^{família, incluindoTET1, TET2}, e TET3^8,9. Estudos adicionais mostram que 5-hmC poderia servir como um marcador estável e desempenhar papéis biológicos através da regulação da expressão gênica^4,10,11,12.

As evidências atuais indicam que 5-hmC é altamente enriquecido em tecidos/células neuronais em relação a outros tipos de tecidos em mamíferos, e apresenta características dinâmicas durante o desenvolvimento neuronal^13,14. No sistema neuronal, as modificações epigenéticas mediadas por 5 hmC desempenham um papel importante na regulação das células-tronco neurais, atividade neuronal, aprendizagem e memória, e está envolvida em múltiplas desordens neurológicas, incluindo Síndrome de Rett, autismo, Alzheimer doença de Huntington, etc.^{2,13,15,16,17,18,19,20}.

Existem várias abordagens para a detecção de 5-hmC em células e tecidos^{14,21,22,23,24}. Aqui, nós descrevemos dois métodos para detectar a existência de 5-hmC e quantificamos o nível global de 5-hmC: a coloração da imunofluorescência e o dot-borrão do ADN. Estes dois métodos são convenientes e sensíveis, e foram usados com sucesso em estudos precedentes^{25,26,27,28,29,30}. Os passos-chave destes dois métodos são a desnaturação do DNA. Para a coloração da imunofluorescência de 5-hmC, o pré-tratamento das amostras com 1 M HCl é exigido. Para o ponto-borrão de 5 hmC, a desnaturação do ADN é executada com solução de NaOH. Esses dois métodos, juntamente com o sequenciamento de próxima geração, são ferramentas muito úteis para investigar a função do 5-hmC.

Protocolo

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de ética animal da Universidade de Zhejiang.

1. a cultura de células-tronco neurais adultas e neurônios

1. Isole pilhas de haste neural adultas do prosencéfalo de um adulto (8-10 semanas velho) C57/BL6 macho rato como descrito previamente^31,32.
2. Cultura células tronco neurais adultas em DMEM/F-12 médio contendo 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 suplemento, 1% antibiótico-antimicótico, e 2 mM L-glutamina em uma incubadora de 5% CO₂ em 37 ° c. Induzir a diferenciação de células-tronco neurais adultas com 1 μm de ácido retinóico e 5 μm de forskolina para 48 h, conforme descrito anteriormente^31,32.
3. Isolar os neurônios do dia embrionário 17 (E17) hipocampo do rato e cultura com meio neurobasal contendo de 0,25% L-glutamina, 0,125% glutamax e 2% B27 suplemento em uma incubadora de co₂ de 5% a 37 ° c como descrito anteriormente³³.

2. perfusão transcardial do rato

1. Prepare 10% de hidrato de cloral, 4% paraformaldeído (PFA) e tampão fosfato salina (PBS) um dia antes do experimento, e armazene a 4 ° c.
2. Anestesiar um adulto macho ou fêmea C57 BL/6J rato com 10% hidrato de cloral (50 mg/kg, i.p.), e certifique-se de que o animal está profundamente anestesiado, verificando a reação do corpo. Fixar cada membro com fita adesiva em uma placa de plástico (em uma posição de face para cima).
3. Corte a pele e, em seguida, o músculo com tesoura cirurgia. Abra a cavidade torácica com uma tesoura cirúrgica. Expor o coração e cortar uma pequena parte do átrio direito com uma tesoura cirúrgica multa.
4. Perfuse o rato com uma seringa esterilizada descartável de 10 mL do ventrículo esquerdo com PBS frio (ao redor 30 mL por o rato adulto).
5. Perfuse o rato com o PFA de 4% (ao redor 30 mL em 10 minutos por ratos adultos) até que esteja duro.
6. Abra o crânio do mouse com fórceps ósseo. Retire o cérebro e coloque em 5 mL de PFA de 4% em um tubo de centrífuga de 15 mL para a pós-fixação a 4 ° c.
   Nota: Limpe a área cirúrgica após a cirurgia ter terminado.
7. Pelo menos 24 h mais tarde, transfira as amostras do cérebro em uma solução da sacarose de 30% para a desidratação completa em 4 ° c.

3. seccionamento cerebral

1. Incorpore as amostras cerebrais em um composto de temperatura de corte ideal (OCT) em um pequeno recipiente e esfrie a-20 ° c por pelo menos 1 h.
2. Amostras do cérebro da seção em uma espessura de 20-40 μm com um micrótomo do criostato.
3. Colete seções em PBS e armazene a 4 ° c.

4. coloração da imunofluorescência

1. Pegue as seções com as regiões cerebrais alvo e colocá-los em uma placa de 24 poços com PBS. Para células cultivadas em uma lamínula, vá diretamente para a etapa 4,2.
2. Lave com PBS na coqueteleira à temperatura ambiente durante 10 min. Repita isto duas vezes mais.
3. Remova o PBS e trate com HCl pré-aquecido de 1 M por 30 min a 37 ° c.
   Nota: Prepare 1 M HCl adicionando 1 mL de ácido clorídrico (36-38%) em 10 mL de água em um capuz químico. Pré-aqueça 1 M HCl na incubadora a 37 ° c.
4. Lave as amostras com PBS durante 5 min. Repita isso duas vezes mais.
5. Amostras de bloco com PBS contendo 3% de soro de cabra normal e 0,1% Triton X-100 por 1 h na coqueteleira à temperatura ambiente.
6. Incubar secções com anticorpos primários específicos durante a noite a 4 ° c na coqueteleira.
   Nota: Use os seguintes anticorpos preliminares: anticorpos Polyclonal do coelho anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5000), anticorpo monoclonal anti-NeuN do rato (1:500).
7. Tire as amostras e incubar ainda à temperatura ambiente durante 1 h.
8. Lave as amostras com PBS durante 10 min. Repita isso duas vezes mais.
9. Incubar com anticorpos secundários correspondentes aos anticorpos primários à temperatura ambiente durante 1 h na coqueteleira. Cubra a placa com alumínio.
   Nota: Use os seguintes anticorpos secundários: Alexa fluor 488 cabra anti-coelho IgG (1:500), Alexa fluor 568 cabra anti-mouse IgG (1:500). Núcleos de contratura com 4 ′-2-diamidino-phenylindole (DAPI).
10. Lave as amostras com PBS durante 10 min na coqueteleira. Repita isso duas vezes mais.
11. Monte seções cerebrais sobre as lâminas, adicione uma quantidade adequada de meio de montagem Antifade (cerca de 100-150 μL), e cubra com vidro de cobertura Premium. Selo com lustrador de prego.
12. Tome imagens com um microscópio de fluorescência regular ou confocal.

5. isolação do ADN de Genomic

1. Eutanizar um adulto C57 BL/6J mouse (masculino ou feminino) por luxação cervical e remover o cérebro.
2. Dissecar os tecidos do hipocampo, córtex e cerebelo em um prato refrigerado a gelo. Esfregue os tecidos com um moedor de tecido em 1 mL de tampão de lise de DNA e transfira para o tubo de microcentrífuga limpo. Adicionar 250 μg de proteinase K por 600 μL de tampão de Lise. Para pelotas da pilha, adicione diretamente o amortecedor do lysis, proteinase K, e misture-o completamente.
   Nota: Prepare o tampão do lysis do ADN: EDTA de 5 milímetros, 0,2% SDS, 200 milímetros NaCl em 100 milímetros Tris-HCl, pH 8,5. Lave e autoclave o moedor de tecido antes do experimento.
3. No segundo dia, acrescentar cerca de 50 μg de RNase A por amostra de pelo menos 12 h a 37 ° c.
4. Adicione um volume igual de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) e misture completamente.
5. Centrifugue a 20.817 x g durante 15 min e retire o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.
6. Adicionar 600 μL de clorofórmio ao sobrenadante para precipizar o ADN e misturar completamente.
7. Centrifugue a 20.817 x g durante 15 min e retire o sobrenadante para outro tubo novo.
8. Adicionar 500 μL de isopropanol ao sobrenadante e misturar cuidadosamente.
9. Centrifugue em 20.817 x g por 15 min, e retire o sobrenadante completamente.
10. Lave a precipitação com 1 mL de 70% de etanol, Centrifugue a 20.817 x g durante 1 min e retire o sobrenadante completamente. Repita uma vez.
11. Seque completamente o pellet de DNA.
12. Dissolva a pelota do ADN com amortecedor de Tris-HCl (pH 8,5) à concentração apropriada.

6. borrão do ponto do ADN

1. Preparar as soluções: 2 M NaOH, tampão Tris-HCl (pH 8,5), 6x citrato de sódio salino (SSC).
2. Faça a mistura da amostra como tabela 1.
3. Amostras de DNA de denature a 100 ° c por 10 min, e resfriar no gelo.
4. Corte o tamanho adequado da membrana de nylon (por exemplo, HYBOND-N +) e enxague com 6x SSC.
5. Põr a membrana sobre o instrumento do ponto-Borrão e conecte-a à bomba de vácuo. Ponto 6 μL de mistura por ponto na membrana.
6. Hibridizar por 30 min a 80 ° c e bloquear a membrana da amostra com leite sem gordura em soro fisiológico com tampão Tris (TBS) por 1 h.
7. Incubar com anticorpo primário a 4 ° c durante a noite.
   Nota: o seguinte anticorpo preliminar: coelho Polyclonal anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5000).
8. No segundo dia, incubar as membranas da amostra à temperatura ambiente durante 1 h. Lave com TBS durante 10 min. Repita esta lavagem mais duas vezes.
9. Incubar a membrana com anticorpo secundário anticoelho (1:5000) durante 30 min à temperatura ambiente.
10. Lave com TBS durante 10 min. Repita esta lavagem mais duas vezes.
11. Visualize os sinais de quimioluminescência e quantifique intensidades de sinal.

Resultados

Para revelar a distribuição de 5-hmC no hipocampo de camundongos adultos, realizamos imunofluorescência com anticorpos contra células neuronais (NeuN) e 5-hmC. No hipocampo, o 5-hmC colocalizada bem com marcador de células neuronais NeuN (Figura 1a-H), sugerindo um enriquecimento de 5-HMC em neurônios.

Para determinar a dinâmica de 5-hmC durante o desenvolvimento neuronal, um dot-blot foi realizado pela primeira vez com amostras de DNA isol...

Discussão

Modificações epigenéticas desempenham papéis essenciais durante o desenvolvimento do cérebro, maturação e função. Como um marcador estável para a modificação do ADN, o 5-hmC dinâmico responde à adaptação comportamental, à atividade neuronal, e é correlacionado positivamente com a expressão de gene; assim, está envolvida na função normal do cérebro e da desordem neurológica⁴. Para explorar sua função em células e tecidos, é necessário detectar a existência de 5-hmC e c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )	Sigma-Aldrich	D8417
Adobe Photoshop software	Adobe Inc.	/
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher	A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher	A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine	Active Motif	39769
anti-NeuN	Millipore	MAB377
B27 supplement	Gibco	12587-010
B27 supplement	Gibco	12580-010
B27 supplement	Gibco	17504-044
Cryostat microtome	Leica	CM1950
DMEM/F-12 medium	OmegaScientific	DM25
Epidermal growth factor	PeproTech	100-15
Fibroblast growth factor-basic	PeproTech	100-18B
Forskolin	Sigma-Aldrich	F6886
GlutaMax	Thermo	35050061
L-Glutamine	Gibco	25030-149
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Normal goat serum	Vector Laboratories	Z0325
Nylon membrane (Hybond™-N+ )	Amersham Biosciences	RPN303B
OCT	Leica	14020108926
Pen Strep	Gibco	15140-122
Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )	Sigma-Aldrich	516726
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899-10
Proteinase K	VVR	39450-01-6
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Triton X-100	Solarbio	T8210