İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Özet

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanılarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerinin oluşumunu kolaylaştıracak bir yöntem sağlar.

Özet

İnsan pluripotent kök hücreleri gen fonksiyonunu incelemek ve hastalığa özgü mutasyonları modellemek için güçlü bir sistem sunar. İkinci alelde CRISPR-CAS9 aracılı indel oluşumu nedeniyle hassas heterozigot genetik modifikasyonların oluşturulması zordur. Burada, her iki şablon da yeniden kesme ve indel oluşumunu önlemek için sessiz mutasyonlar içerirken, yalnızca bir tanesinin istenen sıra değişikliğini ifade ettiği iki onarım şablonu kullanarak bu zorluğun üstesinden gelinmesine yardımcı olacak bir protokol gösteriyoruz. Bu metodoloji, insan hastalığı ve biyoloji sinaması için isojenik kontrol ve mutant insan kök hücre hatları oluşturmak için DNA'nın gen düzenleme kodlama bölgeleri için en avantajlı yöntemdir. Buna ek olarak, transfeksiyon ve tarama metodolojilerinin optimizasyonu, gen düzenleme deneyinin işçiliğini ve maliyetini azaltmak için gerçekleştirilmiştir. Genel olarak, bu protokol yaygın insan pluripotent kök hücre modeli kullanan birçok genom düzenleme projeleri için geçerlidir.

Giriş

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESCs) ve indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) insan hastalığı yenileme kapasiteleri nedeniyle modelleme için değerli araçlar, farklı soy hücre tipleri oluşturmak için yeteneğini korurken^{1,2 ,3,4}. Bu modeller gen fonksiyonunu sorgulama imkanını açar ve spesifik mutasyonların ve fenotiplerin çeşitli hastalıklarla nasıl ilişkili olduğunu^{anlarlar 5,6}. Ancak, belirli bir değişiklik belirli bir fenotip bağlı nasıl anlamak için, eşleştirilmiş bir iyojenik kontrol ve mutant hücre hatları nın kullanımı çizgi değişkenlik⁷için kontrol etmek önemlidir^{7 ,8}. Transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALENs) ve çinko parmak nükleazları, birincil hücreler de dahil olmak üzere çeşitli genetik modellerde ekleme veya silme (indels) mutasyonları oluşturmak için kullanılmıştır; ama bu nükleazlar kullanmak için hantal olabilir ve pahalı^9,10,^11,12,13,14. Kümelenmiş düzenli olarak uzaylanmış kısa palindromik tekrarın (CRISPR)-CAS9 nükleazının keşfi, genomun hemen hemen her bölgesinde indel oluşumundaki verimlilik, kullanım kolaylığı ve maliyet15'teki azalma nedeniyle sahada devrim yarattı^{15 , 16.02.20 , 17.000 , 18.000 , 19. yıl.}

CRISPR-CAS9 tabanlı genom düzenleme teknolojisini kullanmanın zorluğu, ikinci alel^20'deindel mutasyonu yaratmadan bir aleldeki spesifik mutasyonların oluşturulması veya düzeltilmesi olmuştur. Bu protokolün temel amacı, ikinci alelinin indel oluşumunu azaltmak için iki tek iplikli oligonükleotit (ssODN) onarım şablonu kullanarak bu zorluğun üstesinden gelmektir. Her iki ssODN'ler, CAS9 nükleazının yeniden kesilmesini önlemek için sessiz mutasyonlar içerecek şekilde tasarlanmıştır, ancak sadece bir tanesi ilgi nin değişimini içerir. Bu yöntem, ikinci alelinin indel oluşumunu indüklemeden belirli bir heterozigot genetik modifikasyon oluşturma nın verimliliğini artırır. Bu protokolü kullanarak, altı bağımsız genomik lokasyonda yapılan gen düzenleme deneyleri, ikinci alelde indel oluşumu olmadan bir alelde istenilen genomik değişimin kesin olarak ortaya çıkarılabilmeyi ve ~%10 genel verimlilikle meydana geldiğini göstermektedir. Açıklanan protokol Maguire ve ark.²¹uyarlanmıştır.

Protokol

1. Kılavuz RNA'nın (gRNA) tasarımı ve inşası

NOT: Her gRNA, 100 bp çift iplikçikli (ds) oligonükleotid(Şekil 1A-C)oluşturmak için annealed iki 60 baz çifti (bp) oligonükleotid oluşur. gRNA tasarımı, üretimi ve test kesme verimliliği için zaman çizelgesi yaklaşık 2 haftadır(Şekil 2).

1. Genom düzenlenecek DNA bölgesini seçin ve formata uygun 3-4 23 bp dizileri tanımlayın, 5'-G(N₁₉)NGG-3'. Bu diziler ilgi alanının 20 bp içinde yer almalıdır.
   NOT: Hedefleme duyu veya anti-sense iplikçik üzerinde yapılabilir.
2. CRISPOR (http://crispor.tefor.net) gibi bir kaynak kullanarak gRNA dizilerini genomik fazlalık ve hedef dışı olasılık açısından değerlendirin.
3. Gösterildiği gibi iki 60-mer oligonükleotid içine 20 bp hedef dizisi (protospacer bitişik motif veya PAM hariç) dahil (dizileri 5'e 3' ve kırmızı ve yeşil şekil 1Cgösterildiği gibi ters tamamlar vardır).
4. Sipariş iki 60 bp oligonükleotid satıcıdan tercih. Oligonükleotidler alındıktan sonra, ddH₂O.'da 100 μM'lik son konsantrasyona kadar her birini yeniden askıya alın.
5. Anneal iki oligonükleotid ve DNA polimeraz kullanarak 100 bp dsDNA parçası oluşturmak(Tablo Malzemeler). 5 μL 10 μM ileri oligonükleotid ve 5 μL 10 μM ters oligonükleotidbir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) şerit tüp ve inkübat 95 °C 5 dakika. Oda sıcaklığında 10 dakika için reaksiyon uçıkarın (RT).
6. PCR'yi Tablo 1'deaçıklandığı şekilde ayarlayın. Tablo 2'debelirtilen parametreleri kullanarak bir termal çevrimcide PCR amplifikasyonu gerçekleştirin.
7. PCR ürünlerini %1,5 (w/v) ethidium bromür (EtBr) agarose jelelektrofore edilip 40 dk. 100 bp bandı(Şekil 3A),led ışık kutusunda görselleştirilmiş, jilet kullanarak jelden arındırın ve jel kullanarak arındırın ekstraksiyon kiti (Malzeme Tablosu).

2. Tarama için PCR astar tasarımı

1. Özel ilgi geninin 400-500 bp bölgesini yükseltmek için tasarlanmış ileri ve ters PCR astarları kullanarak düzenlenmiş DNA'nın taramasını gerçekleştirin(Tablo 2). Tarama PCR yaparken temiz bir amplicon onaylamak için herhangi bir kontrol iPSC hattından izole DNA kullanın.
2. PCR ürünlerini 80-100 V'de 1 saat elektroforezi takip eden %1,5 (w/v) jel üzerinde görselleştirin.
   NOT: Düzenlenmiş klonların dizilişi, tarama astarı setinin onaylanmasından sonra tasarlanmış iç içe bir astar kullanılarak gerçekleştirilir. Örnekler sıralama için ticari bir kaynağa gönderilir.

3. gRNA_klonlama vektör plazmidinin hazırlanması

1. Klonlama vektörünü doğrusallaştırmak için 1,5 mL santrifüj tüp alın ve gRNA_klonlama vektörünün 1-5 g g g g g g g g g g g g g gg'sini ilave edin ve 4 μL AflII restriksiyon enzimi tamponu ve 1,5 μL AflII restriksiyon enzimi ekleyin. DDH₂O.'nun 24 μL'lik reaksiyonu yukarı ve aşağı borular ile karıştırın. Gece boyunca 37 °C'de (O/N) kuluçkaya yatırın.
2. Elektroforse 1 h ve tüketim bantları için 80-100 V bir% agarose jel üzerinde (beklenen bant boyutu ~ 3519 bp).
3. Ayıklayın ve adım 1.6 gibi arındırın.

4. gRNA vektörünün montajı

1. Reaksiyonlar ayarlayın ve Montaj kiti kullanarak DNA parçaları monte(Tablo Malzemeler) AflII sindirilmiş gRNA klonlama vektör100 bp jel saflaştırılmış eklemek için 1:5 oranları, Tablo 3açıklandığı gibi .
2. Reaksiyonu 50 °C'de 15 dk. DDH₂O'da 1:3 oranında seyreltin ve üreticinin talimatlarına göre bakteri dönüşümü için 3 μL kullanın (Malzeme Tablosu). Kanamisin LB/agar plakalarında plaka hücreleri.
3. GRNA başına 3-5 koloni seçin. Her koloniyi 4 mL LB'de aşılamak ve orbital sallayarak inkübatör de 37 °C'de O/N büyütün.
4. Plazmid DNA'sını miniprep plazmid izolasyon kiti kullanarak arındırın ve başarılı klonlama sağlamak için aşağıdaki astarları kullanarak her gRNA'yı sıralayın: İleri: GTACAAAAAAGCAGGCTTAAAGG; Ters: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.

5. Test gRNA kesme verimliliği

1. Daha önce açıklandığı gibi, 6 kuyulu bir plaka içinde ışınlanmış murine embriyonik fibroblastlar (MEFs) üzerinde Plaka hESCs²¹. Hücreler %70-80 birleşime ulaştığında, Tablo 4'teözetlenen transfeksiyon ana karışımını hazırlayın.
2. 15 dk. RT'de pipetleme ve kuluçka ile karıştırın.
3. 48 saat sonra sıralama için hasat hücreleri.
   1. 3 dk RT kuluçka ile MEF'leri enzimatik olarak(Malzeme Tablosu)çıkarın.
   2. Hücreleri 1x hESC orta ile durular (Tablo 5) ve hESC orta + 10 μM Y-27632 dihidroklorür içine kazıyın (Malzeme Tablosu).
   3. 3 dk için 300 x g pelet hücreleri ve hESC orta 0,5 mL resuspend + 10 μM Y-27632 dihidroklorür.
   4. 35 μm'lik hücre süzgeci kapağından 5 mL'lik bir tüpe süzün.
4. Floresan aktif hücre sıralama (FACS), canlı hücreler üzerinde kapı ve yeşil floresan protein (GFP) pozitif hücreleri sıralamak kullanarak.
5. 1:3 bazal membran matrisi(Malzeme Tablosu)ile kaplanmış ve HESC ortamda(Tablo 5)Y-27632 dihidroklorür içeren ışınlanmış MEF'lere doğrudan 10 cm² tabak içine maksimum 1,5 x 10⁴ sıralanmış hücre aktarın.
6. Y-27632 dihidroklorür içermeyen hESC ortamını(Tablo 5)kullanarak günlük orta yıkın ve kolonilerin ~1 mm çapında olduğu 10-15 gün sonra klonları manuel olarak seçin.
   1. P200 pipet ve mikroskop kullanarak, tek bir klonu dikkatlice kazıyın ve hücreleri pipete çekin.
   2. Koloni ile birlikte hazırlanan ortamda 96 kuyu plakasında 3-4x'i yavaşça boruhaline vererek hücreleri dağıtın.
   3. Tarama için PCR şerit tüpleriçine dağıtın ve 5 dk. gRNA başına 20 koloni seçin 10.000 x g santrifüj ile hücreleri pelet.

6. Klon taraması

1. Hücre peletlerini 20 μL proteinaz K tamponu(Tablo 5) (55 °C'de 1 saat ve 95 °C'de 10 dakika) ve girdap ta dinleyerek DNA'yı izole edin. 5 dk için 10.000 x g santrifüj ve supernatant toplamak.
2. PcR (bölüm 2) taramasını, ilgi bölgesini ve proteinaz K sindiriminin 5°L'sini yükseltmek için tasarlanmış astarlar da dahil olmak üzere ana karışım içeren bir ana karışım kullanarak toplam 20 μL hacimde gerçekleştirin. Kontrol olarak düzenlenmiş olan hücre hattından izole edilmiş genomik DNA kullanın.
3. 70-90 V'de 1 saat elektroforezi takip eden PCR ürünlerinin boyut değişikliklerini %2,5 (w/v) agarose jel(Şekil 3B,C)üzerinde değerlendirin. Herhangi bir boyut farkı dekolte göstergesidir.

7. Tek iplikçikli oligo DNA (ssODNs) kullanılarak pluripotent kök hücrelerde hassas genom düzenleme

1. Tasarım 100 bp ssODNs en verimli gRNA dizisi etrafında en iyi kesme verimliliğine sahip olduğu belirlenen merkezli.
2. GRNA dizisinde sessiz mutasyonlar oluşturarak yeniden birleştirilmiş ODN'nin yeniden bölünmesini önleyin. PAM dizisinde tek bir sessiz mutasyon yeterlidir, ancak mümkün değilse 3-4 sessiz mutasyon işe yarayacaktır.
   NOT: Hedeflenen klonların taranmasını kolaylaştırmak için, gRNA dizisinin ~20 bp içinde bir kısıtlama alanının tanıtılması idealdir.
3. Faiz mutasyonu ve baz değişimi(ler) olmadan bir ODN oluşturmak için istenilen baz değişimi(ler) ile bir ODN tasarlayın.
   NOT: Bu değişiklikler, tahmin edilen CRISPR/CAS9 kesme alanından ~20 bp'den fazla olmamalıdır, çünkü rekombinasyon daha uzak mesafelerde önemli ölçüde düşer.
4. İki ssODN'yi satıcıdan sipariş edin ve 1 μg/μL hisse senedi yapmak için suda yeniden askıya alın. Stokları -20 °C'de saklayın.

8. Transfection kurulumu

1. SsODN ve CRISPR-CAS9 plazmidlerini nakletmek için, hedef hücre hattını, O/N kuluçkadan sonra %70-80'lik bir araya gelmek için ışınlanmış MEF'ler üzerinde 6 kuyulu bir tabakta plakalayın.
2. Tablo 6'daaçıklandığı gibi transfeksiyon reaksiyonu ayarlayın. REAKSIYONu pipetleme ile karıştırın ve 15 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın. Transfeksiyon reaksiyonu karışımını damla yla hücrelere ekleyin.
3. 48 saat sonra, bölüm 5.3'te açıklandığı gibi hücreleri hücre sıralamasıiçin hazırlayın.
4. 200 μL pipet kullanarak tek hücreleri kaplamaktan yaklaşık 10 gün sonra kolonileri seçin. 100 μL'lik hücreyi daha önce jelatin ve Radyasyonlu MEF'ler hESC ortamda Y-27632 dihidroklorür ile kaplanmış 24 veya 48 kuyu plakalı bir kuyuya aktarın. Bölüm 6'da açıklandığı gibi DNA izolasyonu için kalan 100 μL'yi kullanın.

9. Tek kolonilerdeki mutasyonların kontrol edilmesi

1. ssODN'nin başarılı entegrasyonunu kontrol etmek için, bölüm 2'de tasarlanan tarama astarlarını kullanarak PCR'yi gerçekleştirmek için her koloniden izole edilmiş 5 μL DNA alın. PCR ürünlerini(Malzeme Tablosu)arındırın ve ssODN'de oluşturulan benzersiz enzim bölgesini kullanarak restriksiyon enzim sindirimini hazırlayın.
   NOT: Bu sindirim aynı zamanda restriksiyon enzimtamponve 40 μL bir hacimde restriksiyon enzimüreticinin önerilen konsantrasyon içerir.
2. 1-3 saat boyunca üreticinin tavsiye edilen sıcaklıkta pipetleme ve kuluçka ile reaksiyonu karıştırın.
3. Sindirilmiş PCR ürünlerini %1,5 (w/v) EtBr agarose jel elektroforeli 80-100 V'da 40 dakika boyunca görselleştirin. SSODN'nin başarılı entegrasyonu gerçekleşmişse, iç içe olmuş bir astar kullanarak diziye özgü mutasyonlar meydana geldi.

Sonuçlar

GRNA'ların üretimi ve indels için tarama

Her gRNA bir plazmid vektör içine klonlanmış olacak ve U6 organizatörü kullanılarak ifade edilecektir. AflII restriksiyon enzimi plazmidi doğrusallaştırmak için kullanılır (addgene #41824) ve U6 organizatöründen sonra bulunur. İki 60 bp oligonun karıştırıldıktan sonra oluşturulan 100 bp bandı, DNA montajı kullanılarak gRNA ekspresyon vektörüne klonlanır. GRNA plazmidleri oluşturulduktan sonra CRI...

Tartışmalar

Bu protokolde, CRISPR-CAS9'un iki ssODN onarım şablonu ile birlikte belirli heterozigot veya homozigot genom değişiklikleri oluşturmak için kullanılması insan pluripotent kök hücrelerinde gösterilmiştir. Bu yöntem, heterozigot genomik değişiklikleri %10'a yakın bir verimlilikle ifade eden izojenik hücre hatlarının başarılı bir şekilde üretilmesiyle sonuçlandı. Bu protokol, hücre ayrıştırma sonrası düşük yoğunlukta hücre kültürlerinden sonra hücre büyümesini ve sağkalımlarını d...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Corning	352235
6-well polystyrene tissue culture dishes	Corning	353046
AflII restriction endonuclease	New England Biolabs	R0520
Agarose	VWR	N605
DMEM/F12 medium	ThermoFisher	11320033
dNTPs	Roche	11969064001
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus
Gel extraction kit	Macherey-Nagel	740609
Gibson Assembly Kit	New England Biolabs	E2611
gRNA_Cloning Vector	Addgene	41824
LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin
Lipofectamine Stem Reagent	ThermoFisher	(STEM00001)
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)	Corning	354230
Murine embryonic fibroblasts (MEFs)
Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609
Orbital shaking incubator
pCas9_GFP vector	Addgene	44719
PCR strip tubes	USA Scientific	1402-2900
Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer	New England Biolabs	M0530
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K210011
Proteinase K	Qiagen	Qiagen 19133
StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells	Takara	636763
SOC medium	New England Biolabs	B9020S
TrypLE Express Enzyme	ThermoFisher	12605036
Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)	Tocris	1254