JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол предоставляет метод для облегчения генерации определенных гетерозиготных или гомозиготных изменений ядра с использованием CRISPR-CAS9 в стволовых клетках человека.

Аннотация

Человеческие плюрипотентные стволовые клетки предлагают мощную систему для изучения функции генов и моделирования конкретных мутаций, имеющих отношение к болезни. Генерация точных гетерозиготных генетических модификаций является сложной задачей из-за CRISPR-CAS9 опосредованного индель образования во втором аллеле. Здесь мы демонстрируем протокол, помогающий преодолеть эту трудность, используя два шаблона ремонта, в которых только один выражает желаемое изменение последовательности, в то время как оба шаблона содержат молчаливые мутации, чтобы предотвратить повторное вырезание и образование indel. Эта методология является наиболее выгодным для редактирования генов кодирования регионов ДНК для создания изогенного контроля и мутантных линий стволовых клеток человека для изучения болезней человека и биологии. Кроме того, была проведена оптимизация методологий трансфекции и скрининга для снижения рабочей силы и затрат на эксперимент по редактированию генов. В целом, этот протокол широко применим ко многим проектам редактирования генома, используя модель стволовых клеток человека.

Введение

Эмбриональные стволовые клетки человека (HESCs) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) являются ценными инструментами для моделирования болезни человека из-за их способности к обновлению, сохраняя при этом способность генерировать типы клеток различных линий1,2 ,3,4. Эти модели открывают возможность изыскнуть функцию генов и понять, как специфические мутации и фенотипы связаны с различными заболеваниями5,6. Однако, чтобы понять, как конкретное изменение связано с определенным фенотипом, использование парного изогенного контроля и мутантных клеточных линий важно контролировать для линии к линии изменчивости7,8. Транскрипционный активатор- как эффектиор нуклеазы (TALENs) и цинк палец нуклеазы были использованы для создания вставки или удаления (indels) мутации в различных генетических моделей, в том числе первичных клеток; но эти нуклеазы могут быть громоздкими в использовании и дорогими9,10,11,12,13,14. Открытие кластерных регулярно межпространственный короткий палиндромический повтор (CRISPR)-CAS9 нуклеаза произвела революцию в этой области из-за эффективности в формировании indel практически в любой области генома, простота использования, и снижение стоимости15 , 16 Год , 17 Лет , 18 лет , 19.

Проблема в использовании технологии редактирования генома на основе CRISPR-CAS9 заключается в генерации или коррекции конкретных мутаций в одном аллеле без создания indel мутации во втором аллеле20. Основная цель этого протокола заключается в преодолении этой проблемы с помощью двух одноцепочечных шаблонов ремонта олигонуклеотида (ssODN) для уменьшения образования indel во втором аллеле. Оба ssODNs предназначены для сдерживания молчаливых мутаций, чтобы предотвратить повторное сокращение нуклеазой CAS9, но только один содержит изменение интереса. Этот метод повышает эффективность генерации специфической гетерозиготной генетической модификации без индуцирования во втором аллеле. Используя этот протокол, эксперименты по редактированию генов в шести независимых геномных местах демонстрируют точное введение желаемого геномного изменения в одном аллеле без образования indel во втором аллеле и происходит с общей эффективностью в 10%. Описанный протокол был адаптирован из Магуайр и др.21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Проектирование и строительство направляющей РНК (gRNA)

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая gRNA состоит из двух 60 базовых пар (bp) олигонуклеотидов, которые annealed для создания 100 bp двойной мель (ds) олигонуклеотид (Рисунок 1A-C). Сроки разработки, генерации и тестирования эффективности работы gRNA составляют примерно 2 недели(рисунок 2).

  1. Выберите область ДНК, представляющий интерес, чтобы быть отредактированным геномом и определите 3-4 23 bp последовательности, которые соответствуют формату, 5'-G (N19)NGG-3'. Эти последовательности должны быть расположены в пределах 20 bp от региона интереса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентация может быть выполнена на смысле или анти-чувство прядь.
  2. Оцените последовательности gRNA для геномной избыточности и вероятности вне цели с помощью такого ресурса, как CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
  3. Включите 20 BP целевой последовательности (за исключением протосказер смежных мотив или PAM) в два 60-мер олигонуклеотидов, как показано (последовательности 5 'до 3' и красный и зеленый являются обратными дополнениями, как показано на рисунке 1C).
  4. Закажите два 60 bp олигонуклеотидов от поставщика выбора. После получения олигонуклеотидов, повторной каждой до конечной концентрации 100 мкм в ddH2O. Сделать рабочий запас 10 мкм.
  5. Аннал два олигонуклеотидов и генерировать 100 bp dsDNA фрагмент с помощью ПОЛимеразы ДНК (Таблица материалов). Смешайте 5 qL из 10 мкм вперед олигонуклеотида и 5 qL из 10 ММ обратного олигонуклеотида в полимеразовой цепной реакции (ПЦР) полоски трубки и инкубировать при 95 кв КС в течение 5 мин. Охладите реакцию в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
  6. Настройка ПЦР, как описано в таблице 1. Выполните усиливание ПЦР в тепловом циклическом цикле, используя параметры, изложенные в таблице 2.
  7. Визуализируйте продукты ПЦР на 1,5% (w/v) бромистого этидия (EtBr) агарозии гель электрофорезируется при 80-100 V в течение 40 мин. Акциз 100 bp band (Рисунок 3A), визуализированный на светодиодной световой коробке, от геля с помощью бритвы лезвие и очистить с помощью геля комплект извлечения(Таблица материалов).

2. Дизайн праймеров ПЦР для скрининга

  1. Выполните скрининг отредактированной ДНК с помощью передних и обратных праймеров ПЦР, которые специально разработаны для усиления области 400-500 bp гена интереса (Таблица 2). Используйте ДНК, изолированную от любой контрольной линии iPSC, чтобы подтвердить чистую ампликон при выполнении скрининга ПЦР.
  2. Визуализируйте пЦР-продукты на 1,5% (w/v) геле после электрофореза при 80-100 В на 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование отредактированных клонов выполняется с помощью вложенного грунтовки, которая разработана после подтверждения набора грунтовки скрининга. Образцы отправляются в коммерческий источник для секвенирования.

3. Приготовление гРНЗА-клонирования векторной плазмиды

  1. Для линейной девициционирования вектора, возьмите 1,5 мл центрифуги трубки и добавить 1-5 мкг ДНК вектора gRNA'cloning вместе с 4 Зл из буфера ограничения AflII и 1,5 л фермента ограничения AflII. Подведите реакцию на 24 л ddH2O. Смешайте реакцию, подав трубку вверх и вниз. Инкубировать при 37 градусах Цельсия на ночь (O/N).
  2. Электрофорес на 1% агарозный гель на 80-100 В на 1 ч и акцизных полос (ожидаемый размер полосы составляет 3519 евро).
  3. Извлекайте и очищайте как в шаге 1.6.

4. Сборка вектора gRNA

  1. Настройка реакций и собрать фрагменты ДНК с помощью комплекта сборки (Таблица материалов) в 1:5 соотношения AflII переваренный вектор клонирования gRNA к 100 bp гель очищенной вставки, как описано в таблице 3.
  2. Инкубировать реакцию при 50 градусах по Цельсию в течение 15 мин. Разбавьте реакцию 1:3 в ddH2O и используйте 3 ЗЛ для бактериальной трансформации, в соответствии с инструкциями производителя(Таблица материалов). Плиты на канамицинл LB / агар пластин.
  3. Выберите 3-5 колоний на гРНК. Прививать каждую колонию в 4 мл Lb и расти O / N на 37 градусов по Цельсию в орбитальном встряхивания инкубатора.
  4. Очистка плазмидной ДНК с помощью комплекта изоляции минопов и последовательности каждого gRNA с использованием следующих грунтовок для обеспечения успешного клонирования: Forward: GTACAAAAAGCAGGCTTAAAGG; Обратный: TGCCAACTTGTACAAAAGCT.

5. Эффективность резки гРНК

  1. Плита hESCs на облученных морин эмбриональных фибробластов (MEFs) в 6-хорошо пластины, как ранее описано21. Когда клетки достигают 70-80% всблонения, подготовить трансфекции мастер смесь, изложенные в таблице 4.
  2. Смешайте путем pipetting и инкубировать на RT в течение 15 мин. Добавить dropwise к клеткам и инкубировать при 37 кс для 48 ч (с изменением носителя после 24 ч).
  3. Урожайные ячейки для сортировки после 48 ч.
    1. Удалите MEFs ферментативно(Таблица материалов) с 3 мин RT инкубации.
    2. Промыть клетки 1x со средой hESC(Таблица 5) и скоблить в hESC среднего 10 МКм Y-27632 дигидрохлорид(Таблица материалов).
    3. Пеллетные клетки на 300 х г в течение 3 мин и повторно притяжаются в 0,5 мл среды hESC 10 мкм Y-27632 дигидрохлорида.
    4. Фильтр в трубку 5 мл через 35 мкм ячейки-ситечко крышка.
  4. Используя флуоресценцию активированной сортировки клеток (FACS), ворота на живые клетки и сортировать зеленый флуоресцентный белок (GFP) положительные клетки.
  5. Передача максимум 1,5 х 104 отсортированных клеток непосредственно в 10 см2 блюдо покрытием с 1:3 подвал мембранной матрицы (Таблица материалов) и облученных MEFs в среде hESC (Таблица 5), содержащий Y-27632 дигидрохлорид.
  6. Изменение среднего ежедневно с помощью среды hESC (Таблица 5) без Y-27632 дигидрохлорид и вручную выбрать клонов после 10-15 дней, когда колонии 1 мм в диаметре.
    1. Используя пипетку P200 и микроскоп, тщательно соскребите один клон и нарисовать клетки в пипетку.
    2. Разогнать клетки, аккуратно pipetting 3-4x в 96 хорошо пластины в среде составлен с колонией.
    3. Распределите в прокладки полоски ПЦР для скрининга и гранулы клетки центрифугирование мецентрирования при 10000 х г в течение 5 мин. Выберите 20 колоний на гРНК.

6. Скрининг клонов

  1. Изолировать ДНК путем инкубации клеточных гранул в 20 qL буфера протеиназа K(Таблица 5) (1 ч при 55 градусах по Цельсию и 10 мин при 95 градусах Цельсия) и вихревом энергично. Центрифуга при 10 000 х г в течение 5 мин и соберите супернатант.
  2. Выполните скрининг ПЦР (раздел 2) в общем объеме 20 зл, используя мастер-микс, включав в себя грунтовки, предназначенные для усиления интересуемой области и 5 зле циферей к дайджеста. Используйте геномную ДНК, изолированную от клеточной линии, которая редактировалась геном в качестве контроля.
  3. Оцените изменения размера продуктов ПЦР после 1 л электрофореза при 70-90 В на 2,5% (w/v) агарозный гель(рисунок 3B, C). Любая разница в размерах свидетельствует о расщеплении.

7. Точное редактирование генома в плюрипотентных стволовых клетках с использованием одной нити олиго ДНК (ssODNs)

  1. Дизайн 100 bp ssODNs сосредоточены вокруг наиболее эффективной последовательности gRNA определяется иметь лучшую эффективность резки.
  2. Предотвращение повторного расщепления рекомбинуемого ODN путем введения молчаливых мутаций в последовательность gRNA. Одной молчаливой мутации в последовательности PAM достаточно, но если это невозможно, 3-4 тихих мутации будут работать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения скрининга целевых клонов, введение места ограничения в пределах 20 bp последовательности gRNA является идеальным.
  3. Создайте одно ODN с пожеланным изменением основания (s) для того чтобы создать перегласовку интереса и одно ODN без изменения основания (s).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти изменения должны быть не более чем на 20 евро за баррель от прогнозируемого участка сокращения CRISPR/CAS9, так как рекомбинация значительно падает на больших расстояниях.
  4. Закажите два ssODNs от поставщика выбора и resuspend в воде, чтобы сделать 1 мкг / Л запасов. Храните запасы при -20 градусах по Цельсию.

8. Трансфекция установка

  1. Чтобы переоборудовать ssODN и плазмиды CRISPR-CAS9, пластины целевой линии клеток в 6-ну хорошо блюдо на облученных MEFs достичь 70-80% выпуклость после Инкубации O / N.
  2. Настройка реакции трансфекции, как описано в таблице 6. Смешайте реакцию путем pipetting и инкубировать в течение 15 минут на RT. Добавить трансфекционной реакции смеси dropwise к клеткам.
  3. После 48 ч подготовьте клетки для сортировки клеток, как описано в разделе 5.3.
  4. Выберите колонии 10 дней после покрытия одиночных клеток с помощью 200-й пипетки. Перенесите 100 л клеток в одну скважину из 24 или 48 хорошо пластины, ранее покрытые желатином и облученных МЭФов в среде hESC с дигидрохлоридом Y-27632. Используйте оставшиеся 100 л для изоляции ДНК, как описано в разделе 6.

9. Проверка на наличие мутаций в отдельных колониях

  1. Чтобы проверить на успешную интеграцию ssODN, возьмите 5 зЛ ДНК, изолированной от каждой колонии, чтобы выполнить ПЦР с помощью скрининговых праймеров, разработанных в разделе 2. Очистите продукты ПЦР(Таблица материалов)и подготовьте переваривание фермента ограничения с помощью уникального фермента, созданного в ssODN.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это пищеварение также включает в себя буфер фермента ограничения и рекомендуемую производителем концентрацию фермента ограничения в объеме 40 зл.
  2. Смешайте реакцию путем пипетки и инкубируйте при рекомендуемой температуре производителя 1-3 ч.
  3. Визуализируйте переваренные продукты ПЦР на 1,5% (w/v) EtBr агарозный гель электрофоресированный при 80-100 В в течение 40 мин. Если произошла успешная интеграция ssODN, последовательность конкретных мутаций с помощью вложенного грунтовки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Генерация ГРНК и скрининг на инделы

Каждая gRNA будет клонирована в плазмидный вектор и выражена с помощью промоутера U6. Фермент ограничения AflII используется для линейной плазмиды (addgene #41824) и расположен после промоутера U6. Диапазон 100 bp, созданный после аннули...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом протоколе, использование CRISPR-CAS9 вместе с двумя шаблонами ремонта ssODN для создания конкретных гетерозиготных или гомозиготных изменений генома демонстрируется в стволовых клетках человека плюрипотентных. Этот метод привел к успешному генерации изогенных клеточных линий, выраж?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано финансированием из Национального института сердца, легких и крови (NHLBI), Национальных институтов здравоохранения через гранты U01HL099656 (P.G. и D.L.F.) и U01HL134696 (P.G. и D.L.F.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer capCorning352235
6-well polystyrene tissue culture dishesCorning353046
AflII restriction endonucleaseNew England BiolabsR0520
AgaroseVWRN605
DMEM/F12 mediumThermoFisher11320033
dNTPsRoche11969064001
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus
Gel extraction kitMacherey-Nagel740609
Gibson Assembly KitNew England BiolabsE2611
gRNA_Cloning VectorAddgene41824
LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin
Lipofectamine Stem ReagentThermoFisher(STEM00001)
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)Corning354230
Murine embryonic fibroblasts (MEFs)
Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up KitMacherey-Nagel740609
Orbital shaking incubator
pCas9_GFP vectorAddgene44719
PCR strip tubesUSA Scientific1402-2900
Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion bufferNew England BiolabsM0530
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep KitInvitrogenK210011
Proteinase KQiagenQiagen 19133
StellarTM electrocompetent Escherichia coli cellsTakara636763
SOC mediumNew England BiolabsB9020S
TrypLE Express EnzymeThermoFisher12605036
Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)Tocris1254

Ссылки

  1. Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
  2. Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
  5. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
  6. Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
  7. Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
  8. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  9. Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
  10. Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
  11. Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
  12. Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
  13. Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
  14. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
  15. Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
  16. Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
  17. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  18. Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).
  19. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
  20. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
  21. Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

151CRISPR CAS9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены