Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Erleichterung der Erzeugung definierter heterozygoter oder homozygoter Nukleotid-Änderungen mit CRISPR-CAS9 in menschlichen pluripotenten Stammzellen.

Zusammenfassung

Menschliche pluripotente Stammzellen bieten ein leistungsfähiges System, um die Genfunktion zu untersuchen und modellspezifische Mutationen zu modellieren, die für Krankheiten relevant sind. Die Erzeugung präziser heterozygoter genetischer Modifikationen ist aufgrund der CRISPR-CAS9-vermittelten Indelbildung im zweiten Allel eine Herausforderung. Hier zeigen wir ein Protokoll, um diese Schwierigkeit zu überwinden, indem wir zwei Reparaturvorlagen verwenden, in denen nur eine die gewünschte Sequenzänderung ausdrückt, während beide Vorlagen stille Mutationen enthalten, um Nachschneiden und Indelbildung zu verhindern. Diese Methode ist am vorteilhaftesten für Gen-Editing-Codierungsregionen der DNA, um isogene Kontrolle und mutierte menschliche Stammzelllinien für die Untersuchung menschlicher Krankheiten und Biologie zu generieren. Darüber hinaus wurden Optimierungen von Transfektions- und Screening-Methoden durchgeführt, um Arbeit und Kosten eines Gen-Editing-Experiments zu reduzieren. Insgesamt ist dieses Protokoll weithin auf viele Genom-Editing-Projekte anwendbar, die das menschliche pluripotente Stammzellmodell verwenden.

Einleitung

Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) sind wertvolle Werkzeuge zur Modellierung menschlicher Krankheiten aufgrund ihrer Fähigkeit zur Erneuerung, wobei die Fähigkeit zur Erzeugung von Zelltypen verschiedener Abstammungen beibehalten wird^{1,2 ,3,4}. Diese Modelle eröffnen die Möglichkeit, die Genfunktion zu befragen und zu verstehen, wie spezifische Mutationen und Phänotypen mit verschiedenen Krankheiten zusammenhängen^5,6. Um jedoch zu verstehen, wie eine bestimmte Veränderung mit einem bestimmten Phänotyp verbunden ist, ist die Verwendung einer gepaarten isogenen Kontrolle und mutierter Zelllinien wichtig, um die Linien-zu-Linienvariabilität^7,8zu steuern. Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs) und Zinkfingernukleasen wurden verwendet, um Insertions- oder Deletionsmutationen (Indels) in verschiedenen genetischen Modellen, einschließlich Primärzellen, zu erzeugen; aber diese Nukleasen können umständlich zu bedienen und teuer^{sein 9,10,11,12,13,14}. Die Entdeckung der gruppierten regelmäßig interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-CAS9 Nuklease hat das Feld aufgrund der Effizienz in der Indelbildung in praktisch jeder Region des Genoms, der Einfachheit der Anwendung und der Senkung der Kosten revolutioniert^{15 , 16 , 17 , 18 , 19}.

Eine Herausforderung bei der Verwendung der CRISPR-CAS9-basierten Genom-Editing-Technologie war die Erzeugung oder Korrektur spezifischer Mutationen in einem Allel, ohne eine Indelmutation im zweiten Allel²⁰zu erzeugen. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, diese Herausforderung zu überwinden, indem zwei einsträngige Oligonukleotid (ssODN) Reparaturvorlagen verwendet werden, um die Indelbildung im zweiten Allel zu reduzieren. Beide ssODNs sind so konzipiert, dass sie stille Mutationen enthalten, um ein erneutes Schneiden durch die CAS9-Nuklease zu verhindern, aber nur eine enthält die Veränderung des Interesses. Diese Methode erhöht die Effizienz der Erzeugung einer spezifischen heterozygoten genetischen Veränderung, ohne induzieren Indelbildung im zweiten Allel. Anhand dieses Protokolls zeigen Gen-Editing-Experimente an sechs unabhängigen genomischen Standorten die genaue Einführung der gewünschten genomischen Veränderung in einem Allel ohne Indelbildung im zweiten Allel und treten mit einer Gesamteffizienz von 10 % auf. Das beschriebene Protokoll wurde von Maguire et al.²¹angepasst.

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Protokoll

1. Entwurf und Konstruktion von Guide RNA (gRNA)

HINWEIS: Jede gRNA besteht aus zwei 60 Basenpaar (bp) Oligonukleotiden, die geglüht werden, um ein 100 bp Doppelsträngiges (ds) Oligonukleotid zu erzeugen (Abbildung 1A-C). Der Zeitplan für die Effizienz des gRNA-Designs, der Erzeugung und des Testens beträgt ca. 2 Wochen (Abbildung 2).

1. Wählen Sie den DNA-Bereich aus, der für das Genom von Interesse ist, und identifizieren Sie 3-4 23 bp Sequenzen, die in das Format 5'-G(N₁₉)NGG-3' passen. Diese Sequenzen sollten sich innerhalb von 20 bp der Interessenregion befinden.
   HINWEIS: Targeting kann auf den Sinnes- oder Anti-Sinn-Strang durchgeführt werden.
2. Bewerten Sie die gRNA-Sequenzen auf genomische Redundanz und Off-Target-Wahrscheinlichkeit mit einer Ressource wie CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
3. Integrieren Sie die 20 bp Zielsequenz (mit Ausnahme des protospaceer angrenzenden Motivs oder PAM) in zwei 60-Mer-Oligonukleotide wie gezeigt (Sequenzen sind 5' bis 3' und Rot und Grün sind umgekehrte Ergänzungen, wie in Abbildung 1Cdargestellt).
4. Bestellen Sie die beiden 60 bp Oligonukleotide beim Lieferanten der Wahl. Sobald die Oligonukleotide empfangen sind, setzen Sie jeweils eine Endkonzentration von 100 M in ddH₂O aus. Machen Sie einen Arbeitsbestand von 10 M.
5. Anneal die beiden Oligonukleotide und erzeugen Sie ein 100 bp dsDNA Fragment mit DNA-Polymerase (Tabelle der Materialien). Kombinieren Sie 5 l von 10 'M vorwärts Oligonukleotid und 5 'L von 10 'M Reverse Oligonukleotid in einem Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Streifenrohr und inkubieren bei 95 °C für 5 min. Kühlen Sie die Reaktion für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
6. Richten Sie die PCR wie in Tabelle 1beschrieben ein. PcR-Verstärkung in einem thermischen Cycler unter Verwendung der in Tabelle 2beschriebenen Parameter durchführen.
7. Visualisieren Sie die PCR-Produkte auf einem 1,5% (w/v) Ethidiumbromid (EtBr) Agarose-Gel elektrophoresed bei 80-100 V für 40 min. Verbrauchen Sie das 100 bp Band (Abbildung 3A), visualisiert auf einem LED-Leuchtkasten, aus dem Gel mit einer Rasierklinge und reinigen Sie mit einem Gel Extraktionskit (Materialtabelle).

2. Design von PCR-Primern zum Screening

1. Führen Sie das Screening der bearbeiteten DNA mit Vorwärts- und Reverse-PCR-Primern durch, die speziell entwickelt wurden, um eine 400-500 bp-Region des Gens von Interesse zu verstärken (Tabelle 2). Verwenden Sie DNA isoliert aus jeder Kontroll-iPSC-Leitung, um ein sauberes Amplikon zu bestätigen, wenn Sie die Screening-PCR durchführen.
2. Visualisieren Sie PCR-Produkte auf einem 1,5% (w/v) Gel nach Elektrophorese bei 80-100 V für 1 h.
   HINWEIS: Die Sequenzierung der bearbeiteten Klone erfolgt mit einem verschachtelten Primer, der nach Bestätigung des Screening-Primers-Sets entworfen wurde. Beispiele werden zur Sequenzierung an eine kommerzielle Quelle gesendet.

3. Vorbereitung des gRNA_cloning Vektorplasmids

1. Um den Klonvektor linearisieren zu können, nehmen Sie ein 1,5 ml Zentrifugenrohr und fügen Sie 1-5 g DNA des gRNA_cloning-Vektors zusammen mit 4 l des Afl II-Restriktionsenzympuffers und 1,5 l des Afl-II-Restriktionsenzymshinzu. Bringen Sie die Reaktion auf 24 l ddH₂O. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren nach oben und unten. Bei 37 °C über Nacht (O/N) inkubieren.
2. Elektrophorese auf einem 1% Agarose-Gel bei 80-100 V für 1 h und Verbrauchbandbreiten (erwartete Bandgröße beträgt 3519 bp).
3. Extrahieren und reinigen sie wie in Schritt 1.6.

4. Montage des gRNA-Vektors

1. Richten Sie Reaktionen ein und montieren Sie DNA-Fragmente mit dem Montagesatz (Materialtabelle) bei 1:5 Verhältnissen von AflII verdaut gRNA Klonvektor zu 100 bp gel gereinigten Einsatz, wie in Tabelle 3beschrieben.
2. Inkubieren Sie die Reaktion bei 50 °C für 15 min. Verdünnen Sie die Reaktion 1:3 in ddH₂O und verwenden Sie 3 l für die bakterielle Transformation, wie vom Hersteller vorgeschrieben (Materialtabelle). Plattenzellen auf Kanamycin LB/Agar-Platten.
3. Wählen Sie 3-5 Kolonien pro gRNA. Impfen Sie jede Kolonie in 4 ml LB und wachsen Sie O/N bei 37 °C in einem orbitalen Schüttelinkubator.
4. Reinigen Sie Plasmid-DNA mit einem Miniprep-Plasmid-Isolationskit und sequenzieren Sie jede gRNA mit den folgenden Primern, um ein erfolgreiches Klonen zu gewährleisten: Weiter: GTACAAAAAAAGCAGGTTAAAGG; Umgekehrt: TGCCAACTTTGTACAAGAAAAGCT.

5. Test gRNA Schneideffizienz

1. Platten-HESCs auf bestrahlten murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs) in einer 6-Well-Platte, wie zuvor beschrieben²¹. Wenn die Zellen 70-80% Konfluenz erreichen, bereiten Sie den in Tabelle 4beschriebenen Transfektionsmaster-Mix vor.
2. Durch Pipettieren mischen und bei RT 15 min inkubieren. Tropfenweise zu den Zellen hinzufügen und bei 37 °C für 48 h brüten (mit einem Medienwechsel nach 24 h).
3. Erntezellen zum Sortieren nach 48 h.
   1. Entfernen Sie MEFs enzymatisch (Tabelle der Materialien) mit einer 3 min RT Inkubation.
   2. Spülzellen 1x mit hESC-Medium (Tabelle 5) und in hESC-Medium + 10 M Y-27632 Dihydrochlorid (Materialtabelle )kratzen.
   3. Pelletzellen bei 300 x g für 3 min und resuspendieren in 0,5 ml hESC-Medium + 10 M Y-27632 Dihydrochlorid.
   4. Filtern Sie in ein 5 ml-Rohr durch eine 35 m Zell-Siebkappe.
4. Mit Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS), Gate auf lebenden Zellen und sortieren die grünen fluoreszierenden Protein (GFP) positive Zellen.
5. Übertragen Sie maximal 1,5 x 10⁴ sortierte Zellen direkt in eine 10 cm² Schale, die mit 1:3 Kellermembranmatrix (Materialtabelle) und bestrahlten MEFs in hESC-Medium (Tabelle 5) mit Y-27632-Dihydrochlorid beschichtet ist.
6. Täglich mit dem hESC-Medium (Tabelle 5) ohne Y-27632-Dihydrochlorid wechseln und Klone nach 10-15 Tagen manuell pflücken, wenn die Kolonien einen Durchmesser von 1 mm haben.
   1. Mit einer P200 Pipette und einem Mikroskop einen einzelnen Klon sorgfältig kratzen und Zellen in die Pipette ziehen.
   2. Dispergieren Sie die Zellen durch sanfte Pipettierung 3-4x in einer 96-Well-Platte im Medium mit der Kolonie erstellt.
   3. In PCR-Streifenröhren zum Sieben und Pellet der Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 5 min. Wählen Sie 20 Kolonien pro gRNA.

6. Klon-Screening

1. Isolieren Sie die DNA, indem Sie Zellpellets in 20 L Proteinase-K-Puffer(Tabelle 5) (1 h bei 55 °C und 10 min bei 95 °C) und kräftig wirbeln. Zentrifuge bei 10.000 x g für 5 min und den Überstand sammeln.
2. Führen Sie die Screening-PCR (Abschnitt 2) in einem Gesamtvolumen von 20 l mit einem Master-Mix aus Primern durch, die den Interessenbereich verstärken sollen, und 5 l der Proteinase K-Digest. Verwenden Sie genomische DNA, die aus der Zelllinie isoliert wurde, die als Kontrolle bearbeitet wurde.
3. Bewerten Sie Größenänderungen von PCR-Produkten nach 1 h Elektrophorese bei 70-90 V auf einem 2,5% (w/v) Agaro-Gel (Abbildung 3B,C). Jeder Größenunterschied deutet auf Spaltung hin.

7. Präzise Genombearbeitung in pluripotenten Stammzellen mit einsträngiger Oligo-DNA (ssODNs)

1. Design 100 bp ssODNs zentriert um die effizienteste gRNA-Sequenz bestimmt, um die beste Schneideffizienz zu haben.
2. Verhindern Sie eine erneute Spaltung des rekombinierten ODN durch die Einführung von stillen Mutationen in der gRNA-Sequenz. Eine einzelne stille Mutation in der PAM-Sequenz ist ausreichend, aber wenn nicht möglich, funktionieren 3-4 stille Mutationen.
   ANMERKUNG: Um das Screening von gezielten Klonen zu erleichtern, ist die Einführung einer Restriktionsstelle innerhalb von 20 bp der gRNA-Sequenz ideal.
3. Entwerfen Sie ein ODN mit den gewünschten Basisänderungen, um die Mutation des Interesses zu erzeugen, und einen ODN ohne die Basisänderung(n).
   ANMERKUNG: Diese Änderungen sollten nicht mehr als 20 bp von der vorhergesagten CRISPR/CAS9-Schnittstelle sein, da die Rekombination in größeren Entfernungen erheblich abfällt.
4. Bestellen Sie die beiden ssODNs vom Anbieter der Wahl und suspendieren Sie in Wasser, um 1 g/ l Lagerzujer zu machen. Lagerbestände bei -20 °C.

8. Transfektions-Setup

1. Um die ssODN und die CRISPR-CAS9-Plasmide zu transfekten, verfestigen Sie die Zielzelllinie in einer 6-Well-Schale auf bestrahlten MEFs, um nach einer O/N-Inkubation eine Konfluenz von 70-80% zu erreichen.
2. Richten Sie die Transfektionsreaktion wie in Tabelle 6beschrieben ein. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und inkubieren Sie für 15 min bei RT. Fügen Sie das Transfektionsreaktionsgemisch tropfenweise zu den Zellen hinzu.
3. Bereiten Sie die Zellen nach 48 h auf die Zellensortierung vor, wie in Abschnitt 5.3 beschrieben.
4. Wählen Sie Kolonien 10 Tage nach der Beschichtung einzelner Zellen mit einer 200-L-Pipette. Übertragen Sie 100 l Zellen in einen Brunnen einer 24 oder 48 Wellplatte, die zuvor mit Gelatine und bestrahlten MEFs in hESC-Medium mit Y-27632-Dihydrochlorid beschichtet war. Verwenden Sie die verbleibenden 100 l für die DNA-Isolierung, wie in Abschnitt 6 beschrieben.

9. Überprüfung auf Mutationen in einzelnen Kolonien

1. Um die erfolgreiche Integration des ssODN zu überprüfen, nehmen Sie 5 l DNA, die aus jeder Kolonie isoliert ist, um PCR mit den in Abschnitt 2 entworfenen Screening-Primern durchzuführen. Reinigen Sie die PCR-Produkte (Materialtabelle) und bereiten Sie die Restriktionsenzymverdauung mit der einzigartigen Enzym-Site vor, die in der ssODN erstellt wurde.
   HINWEIS: Diese Verdauung umfasst auch den Restriktionsenzympuffer und die vom Hersteller empfohlene Konzentration des Restriktionsenzyms in einem Volumen von 40 l.
2. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und inkubieren Sie bei der vom Hersteller empfohlenen Temperatur für 1-3 h.
3. Visualisieren Sie die verdauten PCR-Produkte auf einem 1,5% (w/v) EtBr Agarose Gel elektrophoresed bei 80-100 V für 40 min. Wenn eine erfolgreiche Integration der ssODN stattgefunden hat, sequenziumen spezifische Mutationen mit einem verschachtelten Primer.

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Ergebnisse

Generierung von gRNAs und Screening für Indels

Jede gRNA wird in einen Plasmidvektor geklont und mit dem U6-Promotor exprimiert. Das AflII Restriktionsenzym wird zur Linearisierung des Plasmids (Addgen #41824) verwendet und befindet sich nach dem U6-Promotor. Das nach dem Glühen der beiden 60 bp Oligos erzeugte 100 bp-Band wird mit Hilfe der DNA-Assembly in den gRNA-Expressionsvektor geklont. Sobald die gRNA-Plasmide erzeugt sind, werden sie zusammen mit einem CRISP...

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Diskussion

In diesem Protokoll wird die Verwendung von CRISPR-CAS9 zusammen mit zwei ssODN-Reparaturvorlagen zur Erzeugung spezifischer heterozygoter oder homozygoter Genomveränderungen in menschlichen pluripotenten Stammzellen nachgewiesen. Diese Methode führte zur erfolgreichen Erzeugung isogener Zelllinien, die heterozygote genomische Veränderungen mit einer Effizienz von fast 10 % exdrücken. Dieses Protokoll wurde sowohl für menschliche ESCs als auch für iPSCs optimiert, die auf bestrahlten MEFs angebaut werden, die das Z...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Corning	352235
6-well polystyrene tissue culture dishes	Corning	353046
AflII restriction endonuclease	New England Biolabs	R0520
Agarose	VWR	N605
DMEM/F12 medium	ThermoFisher	11320033
dNTPs	Roche	11969064001
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus
Gel extraction kit	Macherey-Nagel	740609
Gibson Assembly Kit	New England Biolabs	E2611
gRNA_Cloning Vector	Addgene	41824
LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin
Lipofectamine Stem Reagent	ThermoFisher	(STEM00001)
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)	Corning	354230
Murine embryonic fibroblasts (MEFs)
Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609
Orbital shaking incubator
pCas9_GFP vector	Addgene	44719
PCR strip tubes	USA Scientific	1402-2900
Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer	New England Biolabs	M0530
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K210011
Proteinase K	Qiagen	Qiagen 19133
StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells	Takara	636763
SOC medium	New England Biolabs	B9020S
TrypLE Express Enzyme	ThermoFisher	12605036
Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)	Tocris	1254