Fare Böbreği ve Tavuk Koryoallantoik Membranda Kurulan Metastatik Berrak Hücreli Renal Hücreli Karsinom Modelinin Karşılaştırılması

Özet

Metastatik berrak hücreli renal hücreli karsinom kapsamlı bir klinik öncesi araştırma için kapsamlı bir hayvan modeli olmayan bir hastalıktır. Bu protokol hastalık için iki yeni hayvan modelini göstermektedir: ortonik olarak implante edilmiş fare modeli ve tavuk koryoallantoik membran modeli, her ikisi de klinik olgulara benzeyen akciğer metastazı göstermektedir.

Özet

Metastatik berrak hücreli renal hücreli karsinom (ccRCC) böbrek kanserinin en sık görülen alt tipidir. Lokalize ccRCC olumlu bir cerrahi sonuç vardır. Ancak CCRCC hastalarının üçte birinde akciğerde metastaz gelişir ve bu da hastalar için çok kötü bir sonuçla ilişkilidir. Metastazın moleküler mekanizması bilinmediği için ne yazık ki, bu ölümcül evre için hiçbir tedavi mevcut değildir. Von Hippel-Lindau (VHL) tümör baskılayıcı genin fonksiyon kaybının ccRCC'nin pathognomonic olduğu 25 yıldır bilinmektedir. Ancak ccRCC'nin klinik olarak ilgili transgenik fare modeli oluşturulmamamıştır. Bu protokolün amacı, metastatik ccRCC için yeni kurulan iki hayvan modelini tanıtmak ve karşılaştırmaktır. Bunlardan ilki fare modeline böbrek implantasyonu. Laboratuvarımızda CRISPR gen düzenleme sistemi çeşitli RCC hücre hatlarında VHL genini devre dışı bıraktı. Heterojen ccRCC popülasyonlarının renal kapsüle ortotopik implantasyonu, immünyonlu farelerde sağlam akciğer metastazları geliştiren yeni ccRCC modellerini oluşturmıştır. İkinci model tavuk koryoallantoik membran (CAM) sistemidir. Fare modeliile karşılaştırıldığında, bu model daha fazla zaman, işçilik ve maliyet-etkin. Bu model aynı zamanda sağlam tümör oluşumunu ve intravazasyonunu da destekledi. CAM'de tümörün 10 günlük kısa büyümesi nedeniyle toplanan embriyo dokularında immünohistokimya (IHC) tarafından hiçbir metastaz gözlenmedi. Ancak yumurtadan çıkan tavukta tümör büyümesi iki hafta uzadığında akciğerlerde IHC tarafından mikrometastatik ccRCC lezyonları gözlendi. Bu iki yeni preklinik model metastazın arkasındaki moleküler mekanizmayı daha fazla incelemek ve metastatik ccRCC için yeni tedavilerin geliştirilmesine yönelik yeni, hasta kaynaklı ksenogreftler (PDXs) oluşturmak için yararlı olacaktır.

Giriş

Renal hücreli karsinom (RCC) Amerika Birleşik Devletleri'nde⁷ en sık görülen kanser. Her yıl, 74.000 Amerikalılar yeni teşhis olduğu tahmin edilmektedir, 14.000 'den fazla ölüm ler için muhasebe (Clear-cell histolojik alt tip, veya ccRCC, en yaygın alt tip, RCC olguların yaklaşık% 80'ini oluşturan. Lokalize maligniteli hastalar nefrektomi ile tedavi edilir ve 5 yıllıksağkalım oranı %73'tür 1. Ancak hastaların %25-30'u akciğerler gibi hayati organlara uzak metastazlar gelişir ve bu da ortalama 13 ay ve 5 yıllık sağkalım oranının sadece %11 ile sonuçlanmasına^nedenolur. Metastatik ccRCC için ölümcül sonucu iyileştirmek için metastatik mekanizmanın daha iyi anlaşılması gerekir.

VHL tümör baskılayıcı genin in kaybı insan ccRCC olgularının çoğunda gözlenen bir ayırt edici genetik lezyondur^4,5,6,7. Ancak ccRCC'de VHL kaybının kesin onkojenik mekanizması bilinmemektedir. Ayrıca, VHL ifade durumu ccRCC⁸sonucu tahmin değildir. Özellikle, renal-epitel hedefli VHL nakavt sayısız girişimlere rağmen, bilim adamları farelerde gözlenen preneoplastik kistik lezyonlar ötesinde böbrek anormalliği oluşturmak için başarısız oldu⁹, PTEN ve p53¹⁰gibi diğer tümör baskılayıcıların silinmesi ile kombine bile . Bu bulgular, VHL kaybının tek başına tümörigenez veya sonraki spontan metastaz için yetersiz olduğu fikrini desteklemez.

Son zamanlarda, laboratuvarımız yeni bir VHL knockout (VHL-KO) hücre hattı murine VHL + ccRCC hücre hattında VHL geninin CRISPR / Cas9 aracılı silme kullanarak oluşturulan^11,12. Biz VHL-KO sadece mezenkimal olduğunu gösterdi, ama aynı zamanda mezenkimal geçiş epitel teşvik (EMT) VHL-WT hücrelerinin¹². EMT metastatik süreçte önemli bir rol oynadığı bilinmektedir¹³. Çalışmalarımız ayrıca uzak akciğer metastazının sadece böbrekteki VHL-KO ve VHL-WT hücrelerinin birlikte implantasyonu ile oluştuğunu ve metastazın ortak mekanizmasını desteklediğini göstermiştir. Daha da önemlisi, ortotokik olarak implante edilen VHL-KO ve VHL-WT modelimiz, klinik ccRCC olgularını özetleyerek sağlam akciğer metastazlarına yol açabilmiştir. Bu spontan metastatik ccRCC modeli, özellikle yeni anti-metastaz ilaçlarının geliştirilmesinde transgenik metastatik fare modelinin eksikliğini telafi eder. Bu protokol, genetik mühendisliği renca hücrelerinin heterojen hücre popülasyonlarının renal kapsül implantasyonunu göstermektedir.

Tavuk CAM modelleri, Tablo 1^14,15,^16,17^,18'deözetlendiği gibi, çok sayıda avantajı nedeniyle anjiyogenez ve tümör biyolojisi araştırmalarında uzun bir geçmişe sahiptir. Kısaca, CAM tümör büyümesi için zaman penceresi kısa, CAM tavuk¹⁶kuluçka üzerine yok olana kadar 11 gün maksimum izin . Kısa büyüme süresine rağmen, tavuk embriyosu zengin beslenme kaynağı ve immünoeksik devlet çok verimli tümör engraftment 16 ,^19,20,21sağlar. Son olarak, her döllenmiş yumurta maliyeti ~ $ 1, üzerinde 100 $ bir SCID fare için karşılaştırıldığında. Birlikte, CAM modeli fare ile karşılaştırıldığında zaman ve maliyet büyük bir tasarruf yeni PDXs kurulmasında değerli bir alternatif hayvan modeli olarak hizmet verebilir. Bu protokolde, modelin fare ortotopik modelinde gözlenen metastatik ccRCC'nin biyolojisini özetleyip özetleyemeyeceğini değerlendirdik.

	(SCID) Fare	CAM	Not
Maliyet	>Her biri 100$	~$1'er	%50-75 arasında değişen canlılık
Bariyer muhafazaihtiyacı	Evet	№	Daha fazla maliyet azaltır ve tümörlerin seri izleme kolaylaştırır
Tümör doğrudan görünür	№	Evet	Şekil 3A
İlk engraftment zamanı (RENCA)	2 hafta	2-4 gün	hakem 14, 15
Büyümenin bitiş noktası (RENCA)	3-6 hafta	10 gün	hakem 14, 15
Metastaz (RENCA) gözlendi	Evet	Evet civciv	Şekil 3D
Seri pasajlar	Evet	Evet	ref 16-18
Farelere Geçiş (RENCA)	Evet	Evet	Hu, J., ve diğerleri gözden geçiriliyor (2019)
Tümör heterojenliğini koruyun	Evet	Evet	Hu, J., ve diğerleri gözden geçiriliyor (2019)

Tablo 1: Fare ve CAM modellerinin avantajları ve sınırlamaları. Bu tablo, iki modeli, gerekli zaman, maliyet, işçilik ve biyoloji açısından avantajları ve sınırlamaları açısından karşılaştırmaktadır. CAM modeli verimlilik avantajları vardır, ama aynı zamanda kuşlar ve memeliler arasındaki farklı morfolojinedeniyle kendi benzersiz sınırlamaları vardır. Bu nedenle, modelkenogreftlerin biyolojisini koruyabileceğini doğrulamak önemlidir.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler, UCLA Şansölyehayvan Araştırma Komitesi (ARC) (ARC 2002-049-53 ve ARC 2017-102-01A) olarak belirlenen Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 2002-049-53 protokolü, ccRCC tümör hücrelerinin Nude veya BALB/c farelerin böbrek kapsülüne yerleştirilmesi için optimize edilebiyi optimize edeildi. Yumurtadan çıkmadan önce döllenmiş tavuk yumurtalarında tümör implantasyonu deneyleri IACUC onayı gerektirmez. Akciğer metastazı kurulması için süre uzatmak için, CAM tümörlü embriyolar yumurtadan ve tavuk içine büyümeye izin verilir. 2017-102-01A protokolü bu hayvan deneylerini kapsamaktadır.

1. Farelerde ortotopik tümör çalışmaları

NOT: Bu denemenin zaman çizelgesi Şekil 1A'dagösterilmiştir. Bu yordamlar önceki yayınlardan uyarlanmıştır^11,12.

1. Aşılama için tek hücreli süspansiyon un hazırlanması
   1. RENCA VHL-WT ve VHL-KO hücrelerini tripsin/EDTA kullanarak kültür yemeklerinden ayırın.
   2. Hücreleri hemositometre ile sayın ve önceden soğutulmuş 1:1 PBS ve hücre dışı matriks çözeltisi karışımında 1 x 10⁵ hücre/μL konsantrasyonda yeniden askıya alın.
      NOT: Heterojen implantlar için 1:4 vhl-WT:VHL-KO hücreleri ve homojen implantlar için tek başına VHL-WT kullanın.
   3. Yeniden askıya alınan hücreleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın ve implantasyona kadar buzda tutun.
2. Böbrek kapsülüne implantasyon
   1. Anestezi: Sıcak bir pedi 37 °C'ye ısıtın ve üzerini kalın steril bir perde ile kapatın. Fareyi indüksiyon odası veya intraperitoneal (IP) enjeksiyonu ile 10 mL/kg dozajında %1 pentobarbital sodyum ile anestezi edin.
   2. Cerrahi alandaki saçı tıraş edin. Bu adım çıplak fareler için atlanabilir.
   3. Dezenfeksiyon ve cerrahi draping: Povidone-iyot 3x ile tamamen farenin arka dezenfekte 70% etanol 1x takip ve steril pamuk bezleri ile kuru silin. Daha sonra bir cerrahi alan oluşturmak ve fareim immobilize etmek için tüm geri kapsayan, sırayla üç steril tıbbi pansuman uygulayın.
   4. Kesi ve böbrek dışlaşması: Operasyondan önce operatörün parmaklarını povison-iyot ile dezenfekte edin veya steril eldiven kullanın. Fareyi yatkın konuma getirin ve sol kanadın altında sol böbreği bulmak için parmakları kullanın. Belirtilen yerin altındaki cildi ve kas tabakasını kesmek için bir çift künt çözgü ve makas kullanın. Kısmen karın dışında sol böbrek dışlaştırmak için steril pamuk lu bezler ve forceps kullanın.
   5. Tümör hücre implantasyonu: Adım 1.1'de hazırlanan hücre süspansiyonunu insülin şırıngalarına veya özelleştirilmiş Hamilton şırıngalarına yükleyin (spesifikasyonlar için Malzeme Tablosu'na bakın). Böbrek kapsülünün altına 20 μL'lik resuspended hücreleri enjekte edin.
      NOT: Başarılı enjeksiyon böbrek yüzeyinde yarı saydam bir şişkinlik oluşumu ile belirlenir. Böbrek parankimine kazara enjeksiyon, enjeksiyon yerinde ölümcül kanamaya bağlı olarak kanama ve ameliyat sonrası mortalite oranının %90'a varan oranda düşmesi ile sonuçlanır.
   6. Hücre dışı matriks çözeltisinin kanama yı veya tümör hücre sızıntısını sağlamlaştırması ve önlemesi için iğneyi yavaşça çekin. Sonra, steril bir pamuklu bez kullanarak, geri karın içine böbrek itin.
   7. Yara dikiş: Kas tabakası dikiş için 5-0 kaplı VICTRYL sütür kullanın. Bir kez povidone-iyot ile cildi dezenfekte ve yara autoclips ile cildi kapatın.
   8. Kurtarma: Fareyi uyanana kadar sıcak pedin üzerine yerleştirin. Fare teneffüs ile anestezi edildiyse, isoflurane'yi geri çekin ve uyanana kadar fareyi sıcak pedüzerinde tutun.
3. Biyolüminesans görüntüleme (BLI) ve doku toplama
   1. Tümör implantasyonundan altı hafta sonra, ateş böceği-luciferase tabanlı BLI görüntüleri alın. Sonra izofluran inhalasyonu ile fare ötenazi ve servikal çıkış takip.
   2. Akan sitometri ile dolaşımdaki tümör hücresi (CTC) tespiti için kan toplayın.
   3. Hasat tümör ve ilgi organları (böbrekler, akciğerler, karaciğer, bağırsak, ve dalak) steril doku hasat tekniği kullanılarak²². Parafin-balmumu gömme için bir gecede% 4 paraformaldehit onları düzeltin.

2. CAM tümör ksenogreft modeli

NOT: Bu yordamlar uyarlanmış ve daha önce yayımlanmış protokolleri^23,24değiştirilmiştir. Bu yordamın zaman çizelgesi Şekil 1B'degösterilmiştir. Bu makalede yalnızca kolaylaştırılandırılan protokolü sunar. Ayrıntılı protokoller için, lütfen^25.

1. Preincubaation: 7 gün boyunca 37 °C ve%55-65 nem de dönen bir yumurta kuluçka içinde taze döşenmiş, döllenmiş tavuk yumurtası kuluçka.
2. CAM ve açık pencere (gelişim gün 7) bırakın:
   1. Hava kesesini ve damarları bulun ve işaretleyin.
      NOT: Genellikle yumurtaların %10-15'i döllenmeden sonra 7 gün içinde döllenmedikleri veya öldükleri için çıkarılır.
   2. İşaretli bir damarın üzerine yeni bir hava kesesi oluşturun.
   3. Yeni hava kesesini ölçün, paketleme bandı uygulayın ve yumurtaları kuvöze geri koyun.
      NOT: Yordam burada duraklatılmış olabilir. Hava kesesinin hareket edebileceğinden, aynı gün içinde işlemlere devam etmesi önerilir.
   4. Bir pencere açın: Kavisli mikrodissecting makası ve iğne burun lu bir çift forceps kullanarak, kabuk içinde 1,5 x 1,5 cm dairesel bir pencere kesti.
      NOT: CAM bozulması kan ve kesilmiş kabuk parçası üzerinde CAM mevcut bir parça ile gösterilir.
   5. Deliği şeffaf tıbbi pansumanla kapatın ve yumurtaları 37 °C ve %55-65 nemde sabit bir kuluçka makinesine yerleştirin.
      NOT: Adım 2.1'deki gibi aynı yumurta kuluçka makinesini kullanın. Sabit olması için rotator'u kapatın.
3. Sağlık kontrolü (gelişimsel gün 9): Ölü yumurtaları çıkarın ve sonra tümör hücresi implantasyonu için yumurtaların geri kalanını rastgele gruplayın.
   NOT: İdeal olarak, bu noktada sağkalım oranı gelişim sel gün 0 yaklaşık% 80'dir.
4. Tümör hücrelerinin yeni maruz kalan CAM'e aşılanması (gelişimsel gün 10)
   1. Ekstrasellüler matriks çözeltisini önceden soğutulmuş RPMI 1640 hacminin iki katı (L-glutamin ile) seyreltin. 2 x 10⁴ hücre/l konsantrasyonuna ulaşmak için RENCA hücrelerini ayırın ve yukarıdaki çözeltide yeniden askıya alın.
      NOT: Heterojen implantlar için 1:1 vhl-WT:VHL-KO hücreleri ve homojen implantasyon için tek başına VHL-WT kullanın.
   2. Hücre süspansiyonuna üstünlük sağlamak için, her hücre karışımının 100 μL'sini 200°L pipet uçlarında doldurun ve 15 dakika boyunca bir hücre kuluçka makinesine yerleştirin.
   3. Cam yüzeyindeki her yumurta için pencereden 100 μL hücre süspansiyonu yerleştirin.
      NOT: Bazı protokoller implantasyon dan önce CAM çizilme gerektirir²³. Bu RENCA hücreleri için gerekli değildir, çünkü çok hızlı büyürler.
5. CAM'deki hücreleri 10 gün boyunca büyütün ve 2 günde bir fotoğraf çekin.
6. Ötenazi ve tümör, kan ve organları hasat.
   1. Gelişim günü 20 (tümör gün 10), bir heparinize 10 mL şırınga ile korallantotik ven yoluyla kan toplamak.
   2. 15 dakika buz üzerine koyarak embriyolar ötenazi.
   3. Tümörleri hasat edin ve tartar. Fareler için kullanılan benzer steril doku hasat tekniği kullanarak akciğer ve karaciğerleri diseksiyon²².
      NOT: Tavuk karaciğerlerinde karın boşluğunda görülen ilk organlar olan iki lob vardır. Bunları akciğerlerle karıştırmayın. Tavuk akciğerlerkalp ve septum altında yer almaktadır^26. Akciğerlerin başarılı toplama maruz kaburga ile teyit edilebilir.
   4. Parafin-balmumu katıştırma için bir gecede% 4 paraformaldehit tümörler ve parçalanmış organları düzeltmek.
7. Tavukları yumurtadan çıkar.
   1. Uzun süreli tümör büyümesi için kuluçkaya 21 gün boyunca devam edin ve tavukların 37 °C'de ve en az %60 nemde yumurtadan çıkmasını bekleyin.
      NOT: Tavuklar 21. Bu durumda, yumurta kabukları çatlama bazı yardımcı olur. Tavukların kuluçka işlemini 24 saat içinde tamamlamaları önemlidir, çünkü o andan sonra besin yetersizliğinden ölürler.
   2. Bir hayvan tesisinde (2017-102-01A) 2 hafta boyunca tavuk yetiştirin.
   3. Gelişim günü 34 (tümör gün 24), izofluran inhalasyonu ile civciv ötanazi servikal dislokasyon takip.
   4. Fareler için kullanılan benzer steril doku hasat tekniği kullanarak akciğerleri incelemek²². Sonra, parafin-balmumu gömme için bir gecede% 4 paraformaldehit onları düzeltmek.

3. İmmünohistokimya

NOT: Tüm doku kesitleri ve H&E boyama, Los Angeles California Üniversitesi'ndeki Translational Patoloji Çekirdek Laboratuvarı (TPCL) tarafından yapılmıştır.

1. 20 dakika boyunca 65 °C'de kızakları pişirin ve ksilen kullanarak 3x deparafinize edin ve %100 etanolten suya seri olarak rehidrat.
2. 25 dakika boyunca bir sebze buharlı haşlanmış bir sitrat tampon antijenleri alın.
3. Engelleme için %1 BSA uygulayın. Daha sonra PBS'de 1:200 seyreltme oranında hazırlanan birincil antikorları (anti-VHL, anti-HA, anti-flag) uygulayın. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
4. TBST (her biri 7 dk) ile 3x yıkadıktan sonra, 1:200 seyreltme de ikincil antikor ile slaytlar inkübat. TBST ile 3x yıkayın (her biri 7 dk) ve hematoksilin karşı boyama ardından DAB reaktifleri uygulayın.

4. Akış Sitometri

1. Fare veya tavuk kanını üreticinin protokolüne göre kırmızı kan hücresi (RBC) lisis tamponu ile işleyin.
   NOT: Cam kanını analiz ederken yeterli RBC lysis özellikle önemlidir çünkü tavuk RBC'leri çekirdeklidir ve ileri ve yan dağılım kullanılarak akış sitometrisinde kolayca ayırt edilemez.
2. Kan dolaşımında akış sitometrisi çalıştırın ve mStrawberry ve EGFP ekspresyonuna ait verileri analiz edin.
3. Birincil kapıları enkaz, ölü hücreler ve unlysed RBC'ler hariç ileri ve yan dağılıma göre ayarlayın.
4. Floresan kapılarını lekesiz numunelere ve tek lekeli kontrollere göre ayarlayın. VHL-WT, VHL-KO veya etiketlenmemiş RENCA hücreleri ile astarlanmış kan lysate kullanın tek lekeli kontroller ve lekesiz kontroller sırasıyla.

Sonuçlar

Aksi belirtilmedikçe her deneme en az 3x gerçekleştirildi. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. Önemi, iki grup varken eşleştirilmiş, Öğrencinin T-testi veya üç veya daha fazla grup varken tek yönlü bir ANOVA ile belirlenmiştir. Önemi belirlemek için 0,05 p değeri kesintisi kullanıldı.

Ortonik implante RENCA hücreleri başarıyla fare böbreklerinde büyüdü, BLI ve H & E boyama tarafında...

Tartışmalar

Epitel maligniteleri olan birçok hastada, hayati organlara metastaz mortalitenin birincil nedenidir. Bu nedenle, altta yatan mekanizma ve metastatik hastalık için tedavi yeni bir yol bulmak esastır. Ne yazık ki, ilgili metastatik ccRCC hayvan modellerinin eksikliği vardır. Büyük ölçüde sorun çok sayıda transgenik böbrek epitel hedefli VHL nakavt fare^modelleri9,¹⁰nesil rağmen farelerde ccRCC yeniden eksikliği kaynaklanmaktadır. Burada, fare ve ta...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate	Corning	25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit	Dremel	8050-N/18
anti-VHL antibody	Abcam	ab135576
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	BD Biosciences	14-826-79
BD Pharm Lyse	BD Biosciences	555899
BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826-5D
DAB Chromogen Kit	Biocare Medical	DB801R
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Goldbio	LUCK-1G
DPBS without Calcium and Magnesium	Gibco	LS14190250
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)	eBioscience	14-6681-82
Ethanol 200 Proof	Cylinders Management	43196-11	Prepare 70% in water
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions	Fisher Scientific	10-437-028
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-940
Fisherbrand Sterile Cotton Balls	Fisher Scientific	22-456-885
FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122
FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129
Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology	MilliporeSigma	1.00496.5000
Hamilton customized syringe	Hamilton	80408	25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm
HA-probe Antibody (Y-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc805
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D
Isothesia (Isoflurane) solution	Henry Schein Animal Health	1169567762
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System	Perkin Elmer
Matrigel GFR Membrane Matrix	Corning	C354230
Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18"	Medex Supply	MED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation	MilliporeSigma	2910-25GM
Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin	Fisher Scientific	MT-30-002-CI
Pentobarbital Sodium	Sigma Aldrich	57-33-0	Prepare 1% in saline
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	115-035-062
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-035-045
Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use	Ricca Chemical	395516
pSicoR	Addgene	11579
Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics	Fisher Scientific	AC227420500
Renca	ATCC	CRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine	Corning	10040CV
Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile	Fisher Scientific	AB-0700
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96)	Thomas Scientific	1159M40
Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls	Office Depot	220717
Suture	Ethicon	J385H
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	1634
Thermo-Chicken Heated Pad	K&H manufacturing	1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet)	Tygon	AACUN017
VHL-KO			CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase
VHL-WT			Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase
World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR	Fisher Scientific	50-822-331
Wound autoclips kit	Braintree scientific, inc.	ACS KIT
Xylenes (Histological), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X3S-4