Confrontando il modello di carcinoma a cellule renali a celle chiare metastatico stabilito nel rene del topo e sulla membrana coroallantoica del pollo

Riepilogo

Il carcinoma a cellule renali a cellule chiare metastatiche è una malattia senza un modello animale completo per un'indagine preclinica approfondita. Questo protocollo illustra due nuovi modelli animali per la malattia: il modello di topo ortotopicamente impiantato e il modello a membrana corioallantoica del pollo, che dimostrano entrambe metastasi polmonari simili a casi clinici.

Abstract

Il carcinoma a cellule renali a cellule chiare metastatiche (ccRCC) è il sottotipo più comune di cancro renale. CcRCC localizzato ha un esito chirurgico favorevole. Tuttavia, un terzo dei pazienti ccRCC svilupperà metastasi al polmone, che è legato a un esito molto negativo per i pazienti. Sfortunatamente, nessuna terapia è disponibile per questa fase mortale, perché il meccanismo molecolare della metastasi rimane sconosciuto. È noto da 25 anni che la perdita di funzione del gene soppressore del tumore von Hippel-Lindau (VHL) è patognomonica di ccRCC. Tuttavia, non è stato generato alcun modello di topo transgenico clinicamente rilevante di ccRCC. Lo scopo di questo protocollo è quello di introdurre e confrontare due modelli animali di nuova costituzione per il ccRCC metastatico. Il primo è l'impianto renale nel modello murino. Nel nostro laboratorio, il sistema di editing del gene CRISPR è stato utilizzato per eliminare il gene VHL in diverse linee cellulari RCC. L'impianto ortotopico di popolazioni di ccRCC eterogenee nella capsula renale ha creato nuovi modelli di ccRCC che sviluppano robuste metastasi polmonari in topi immunocompetenti. Il secondo modello è il sistema a membrana corioallantoica di pollo (CAM). Rispetto al modello di mouse, questo modello è più tempo, lavoro ed efficiente in termini di costi. Questo modello supportava anche la formazione robusta del tumore e l'intravasation. A causa del breve periodo di 10 giorni di crescita del tumore nella CAM, nessuna metastasi overt è stata osservata dall'immunohistochimica (IHC) nei tessuti embrionali raccolti. Tuttavia, quando la crescita del tumore è stata estesa di due settimane nel pollo tratteggiato, le lesioni micrometastatiche ccRCC sono state osservate dall'IHC nei polmoni. Questi due nuovi modelli preclinici saranno utili per studiare ulteriormente il meccanismo molecolare alla base della metastasi, nonché per stabilire nuovi xenografi (PDX) derivati dal paziente verso lo sviluppo di nuovi trattamenti per il ccRCC metastatico.

Introduzione

Il carcinoma a cellule renali (RCC) è il^7esimo cancro più comune negli Stati Uniti. Ogni anno, 74.000 americani sono stimati essere di nuova diagnosi, che rappresentano più di 14.000 morti (sottotipo istologico a cellule chiare, o ccRCC, è il sottotipo più comune, che rappresenta circa l'80% dei casi di RCC. I pazienti con malignità localizzata sono trattati con nefrectomia e hanno un tasso di sopravvivenza a 5 anni favorevole del 73%¹. Tuttavia, 25%-30% dei pazienti sviluppano metastasi distanti ad organi vitali come i polmoni, con conseguente una scarsa sopravvivenza media di 13 mesi e 5 anni tasso di sopravvivenza di solo 11%^1,2,3. È necessaria un'ulteriore comprensione del meccanismo metastatico per migliorare l'esito mortale per il ccRCC metastatico.

La perdita del gene del soppressore del tumore VHL è una lesione genetica distintiva osservata nella maggior parte dei casi umani di ccRCC^4,5,6,7. Tuttavia, il meccanismo oncogenico preciso della perdita di VHL nel ccRCC è sconosciuto. Inoltre, lo stato dell'espressione VHL non è predittivo del risultato in ccRCC⁸. In particolare, nonostante i numerosi tentativi di abbattimento della VHL mirata a^rene,gli scienziati non sono riusciti a generare anomalie renali oltre le lesioni cistiche preneoplastiche osservate nei topi 9 , anche se combinate con la delezione di altri soppressori tumorali come PTEN e p53¹⁰. Questi risultati supportano l'idea che la perdita di VHL da sola è insufficiente per la tumorigenesi o la successiva metastasi spontanea.

Recentemente, il nostro laboratorio ha creato una nuova linea cellulare vHL (VHL-KO) utilizzando CRISPR/Cas9 ha mediato la delezione del gene VHL nella linea cellulare murine VHL ccRCC (RENCA, o VHL-WT)^11,12. Abbiamo dimostrato che VHL-KO non è solo mesenchymal, ma promuove anche la transizione epiteliale a mesenchymica (EMT) delle cellule VHL-WT¹². EMT è noto per svolgere un ruolo importante nel processo metastatico¹³. Il nostro lavoro ha inoltre dimostrato che la metastasi polmonare distante si verifica solo con la co-impianto di cellule VHL-KO e VHL-WT nel rene, sostenendo un meccanismo cooperativo di metastasi. È importante sottolineare che il nostro modello VHL-KO e VHL-WT impiantato ortotopicamente porta a robuste metastasi polmonari, ricapitolando i casi clinici di ccRCC. Questo modello di ccRCC metastatico spontaneo compensa la mancanza di un modello murino metastatico transgenico, specialmente nello sviluppo di nuovi farmaci anti-metastasi. Questo protocollo dimostra l'impianto di capsule renali delle popolazioni cellulari eterogenee di cellule RENCA genetiche.

I modelli di pollo CAM hanno una lunga storia nella ricerca per l'angiogenesi e la biologia tumorale a causa dei loro numerosi vantaggi, come riassunto nella Tabella 1^{14,15,16,17,18}. In breve, la finestra temporale per la crescita del tumore della CAM è breve, consentendo un massimo di 11 giorni fino a quando il CAM viene distrutto al momento della schiusa del pollo¹⁶. Nonostante il breve tempo di crescita, l'apporto nutritivo ricco e lo stato immunodeficiente dell'embrione di pollo consentono un innesto tumorale molto efficiente^16,19,20^,21. Infine, il costo di ogni uovo fecondato è di 1 dollaro, rispetto a oltre 100 dollari per un topo SCID. Insieme, il modello CAM può servire come un prezioso modello animale alternativo per stabilire nuove PDX con un grande risparmio di tempo e di costi rispetto al mouse. In questo protocollo, abbiamo valutato se il modello era in grado di ricapitolare la biologia del ccRCC metastatico osservato nel modello ortotopico del topo.

	(SCID) Mouse	Cam	Nota
Costo	> 100 dollari ciascuno	1 DOLLARO ciascuno	Viabilità che vanno dal 50 al 75%
Necessità di alloggiamenti per barriere	Sì	No	Riduce ulteriormente i costi e semplifica il monitoraggio seriale dei tumori
Tumore direttamente visibile	No	Sì	Figura 3A
Tempo per la prima innesto (RENCA)	2 settimane	2-4 giorni	rifm 14, 15
Endpoint di crescita (RENCA)	3-6 settimane	10 giorni	rifm 14, 15
Metastasi (RENCA) osservata	Sì	Sì nei pulcini	Figura 3D
Passaggi seriali	Sì	Sì	ref 16-18
Passaggio ai topi (RENCA)	Sì	Sì	Hu, J., et al. in esame (2019)
Mantenere l'eterogeneità tumorale	Sì	Sì	Hu, J., et al. in esame (2019)

Tabella 1: Vantaggi e limitazioni dei modelli mouse e CAM. Questa tabella confronta i due modelli per i loro vantaggi e limitazioni in termini di tempo richiesto, costo, manodopera, così come la biologia. Il modello CAM ha vantaggi in termini di efficienza, ma ha anche i suoi limiti unici a causa della diversa morfologia tra uccelli e mammiferi. Pertanto, è importante confermare che il modello può mantenere la biologia degli xenografi.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), designato come Comitato di Ricerca Animale del Cancelliere UCLA (ARC) (ARC 2002-049-53 e ARC 2017-102-01A). Il protocollo 2002-049-53 è ottimizzato per l'impianto di cellule tumorali ccRCC nella capsula renale di topi Nude o BALB/c. Gli esperimenti di impianto tumorale in uova di gallina fecondate prima della schiusa non richiedono l'approvazione di IACUC. Per prolungare il tempo per la creazione di metastasi polmonari, gli embrioni con tumore DELLA CAM sono autorizzati a schiudersi e crescere in polli. Il protocollo 2017-102-01A copre questi esperimenti sugli animali.

1. Studi ortotopici sul tumore nei topi

NOTA: la sequenza temporale per questo esperimento è illustrata nella Figura 1A. Queste procedure sono state adattate dalle pubblicazioni precedenti^11,12.

1. Preparazione della sospensione a singola cella per l'innesto
   1. Staccare le cellule RENCA VHL-WT e VHL-KO dai piatti di coltura utilizzando trypsin/EDTA.
   2. Contare le cellule con un emocitometro e risospendere in una miscela preraffreddata 1:1 di PBS e soluzione di matrice extracellulare ad una concentrazione di 1 x 10⁵ cellule/ .
      NOTA: Utilizzare un rapporto 1:4 delle cellule VHL-WT:VHL-KO per impianti eterogenei e VHL-WT da soli per impianti omogenei.
   3. Trasferire le cellule risospese in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e tenerle su ghiaccio fino all'impianto.
2. Impianto in capsula renale
   1. Anestesia: Preriscaldare un cuscinetto caldo a 37 gradi centigradi e coprirlo con un pezzo di drappeggio sterile spesso. Anestesizzare il topo per inalazione isoflurane tramite una camera di induzione o iniezione intraperitoneale (IP) di sodio pentobarbital 1% al dosaggio di 10 mL/kg.
   2. Rasare i capelli dal sito chirurgico. Questo passaggio può essere saltato per topi nudi.
   3. Disinfezione e drappeggio chirurgico: Disinfettare completamente la parte posteriore del topo con povidone-iodino 3x seguito da 70% etanolo 1x e pulirlo asciutto con tamponi di cotone sterile. Quindi applicare tre medicazioni mediche sterili in sequenza, coprendo il tutto indietro al fine di creare un campo chirurgico e per immobilizzare il topo.
   4. Incisione e esternalizzazione renale: Prima dell'operazione, disinfettare le dita dell'operatore con povidone-iodine o utilizzare un paio di guanti sterili. Posizionare il mouse in posizione prona e utilizzare le dita per individuare il rene sinistro destra sotto il fianco sinistro. Utilizzare un paio di pinze e forbici smussate per tagliare la pelle aperta e lo strato muscolare sotto la posizione specificata. Utilizzare tamponi sterili di cotone e pinze per esternare parzialmente il rene sinistro fuori dall'addome.
   5. Impianto delle cellule tumorali: Caricare la sospensione cellulare preparata nel passaggio 1.1 in siringhe di insulina o siringhe Hamilton personalizzate (vedere Tabella dei materiali per le specifiche). Iniettare 20 - di cellule risospese sotto la capsula renale.
      NOTA: L'iniezione riuscita è determinata dalla formazione di un rigonfiamento traslucido sulla superficie del rene. L'iniezione accidentale nel parenchyma renale provoca sanguinamento e un tasso di mortalità post-operatorio fino al 90% a causa di emorragia fatale nel sito di iniezione.
   6. Estrarre lentamente l'ago per consentire alla soluzione a matrice extracellulare di solidificare e prevenire emorragie o perdite di cellule tumorali. Quindi, usando un tampone sterile di cotone, spingere il rene di nuovo nell'addome.
   7. Cuciture della ferita: utilizzare una sutura VICTRYL rivestita 5-0 per cucire lo strato muscolare. Disinfettare la pelle con povidone-iodio una volta e chiudere la pelle con autoclip della ferita.
   8. Recupero: Posizionare il mouse sul pad caldo fino a quando non si sveglia. Se il topo è stato anetizzato per inalazione, ritirare l'isoflurane e tenere il mouse sul pad caldo fino a quando non è sveglio.
3. Bioluminescenza imaging (BLI) e raccolta di tessuti
   1. Sei settimane dopo l'impianto del tumore, prendi le immagini BLI basate sulla lucciola-luciferasi. Poi eutanasia topi con inalazione di isoflurane seguita da lussazione cervicale.
   2. Raccogliere il sangue per il rilevamento delle cellule tumorali circolanti (CTC) per citometria di flusso.
   3. Raccogliere tumore e organi di interesse (reni, polmoni, fegato, intestino, e milza) utilizzando una tecnica di raccolta dei tessuti sterili²². Fissarli in 4% paraformaldeide durante la notte per l'incorporamento di cera di paraffina.

2. Modello di xenotrapianto tumorale CAM

NOTA: queste procedure sono state adattate e modificate dai protocolli pubblicati in precedenza^23,24. La sequenza temporale per questa procedura è illustrata nella Figura 1B. Questo articolo presenta solo il protocollo semplificato. Per protocolli dettagliati, si prega di fare riferimento a un altro articolo JoVE pubblicato dal nostro gruppo²⁵.

1. Preincubazione: Incubare uova di gallina appena deposta e fecondate in un'incubatrice rotante di ovuli a 37 gradi centigradi e 55-65% di umidità per 7 giorni.
2. Rilasciare il CAM e aprire la finestra (giorno di sviluppo 7):
   1. Individuare e contrassegnare il sacco d'aria e le vene.
      NOTA: Di solito il 10-15% delle uova viene rimosso perché non sono fecondati o muoiono entro 7 giorni dalla fecondazione.
   2. Creare un nuovo sacco d'aria sopra una vena marcata.
   3. Delineare il nuovo sacco d'aria, applicare il nastro di imballaggio, e rimettere le uova per l'incubatrice.
      NOTA: la procedura può essere sospesa qui. Si consiglia di riprendere le procedure entro lo stesso giorno perché il sacco d'aria può muoversi.
   4. Aprire una finestra: utilizzando un paio di forbici microcondici curve e un paio di pinze a ago-naso, tagliare una finestra circolare di 1,5 x 1,5 cm nel guscio.
      NOTA: L'interruzione della CAM è indicata dal sangue e da un pezzo di CAM presente sul pezzo del guscio tagliato.
   5. Sigillare il foro con una medicazione medica trasparente e posizionare le uova in un'incubatrice stazionaria a 37 gradi centigradi e 55%-65% di umidità.
      NOTA: Utilizzare la stessa incubatrice di uova del punto 2.1. Spegnere il rotatore per renderlo fermo.
3. Controllo dello stato (giorno di sviluppo 9): Rimuovere le uova morte e quindi raggruppare casualmente il resto delle uova per l'impianto delle cellule tumorali.
   NOTA: Idealmente, il tasso di sopravvivenza a questo punto è di circa l'80% del giorno di sviluppo 0.
4. Innesto delle cellule tumorali sulla CAM appena esposta (giorno dello sviluppo 10)
   1. Diluire la soluzione a matrice extracellulare nel doppio del volume di RPMI 1640 preraffreddato (con L-glutamine). Staccare le cellule RENCA e risospendere nella soluzione di cui sopra per raggiungere una concentrazione di 2 x 10⁴ cellule/ .
      NOTA: Utilizzare un rapporto 1:1 delle cellule VHL-WT:VHL-KO per impianti eterogenei e VHL-WT da soli per l'impianto omogeneo.
   2. Per presolidificare la sospensione cellulare, riempire 100 lof ciascuno di ogni miscela cellulare in 200 punte di pipetta e metterle in un'incubatrice cellulare per 15 minuti.
   3. Impianto 100 L di sospensione cellulare per ogni uovo sulla superficie CAM attraverso la finestra.
      NOTA: Alcuni protocolli richiedono il graffio del CAM prima dell'impianto²³. Questo non è necessario per le cellule RENCA, perché crescono molto rapidamente.
5. Coltiva le cellule sul CAM per 10 giorni e fotografa ogni 2 giorni.
6. Eutanasia e raccogliere il tumore, il sangue e gli organi.
   1. Il giorno dello sviluppo 20 (giorno del tumore 10), raccogliere il sangue attraverso la vena corioallantoica con una siringa eparinizzata 10 mL.
   2. Eutanasia gli embrioni mettendoli sul ghiaccio per 15 min.
   3. Raccogliere e pesare i tumori. Disintocimi di polmoni e fegati utilizzando una tecnica di raccolta dei tessuti sterili simile a quella utilizzata per i topi²².
      NOTA: I fegati di pollo hanno due lobi, che sono i primi organi osservati nella cavità addominale. Non confonderli con i polmoni. I polmoni di pollo si trovano sotto il cuore e il setto²⁶. La corretta raccolta dei polmoni può essere confermata dalle costole esposte.
   4. Fissare i tumori e gli organi sezionati in 4% paraformaldeide durante la notte per l'incorporamento di cera di paraffina.
7. Cova i polli.
   1. Per consentire un lungo periodo di crescita del tumore, continuare l'incubazione fino al giorno 21 e lasciare che i polli si schiudano a 37 gradi centigradi e almeno 60% di umidità.
      NOTA: I polli si schiudono naturalmente dopo il giorno 21 per un periodo di tempo di 24 ore, ma occasionalmente hanno difficoltà a schiudersi da soli. In questo caso, rompere i gusci d'uovo alcuni aiuta. È importante che i polli completino il processo di schiusa entro 24 ore perché moriranno per mancanza di nutrienti dopo di allora.
   2. Coltivare i polli in un impianto per animali (2017-102-01A) per 2 settimane.
   3. Il giorno dello sviluppo 34 (giorno del tumore 24), eutanasia i pulcini con inalazione isoflurana seguita da lussazione cervicale.
   4. Dissezionare i polmoni utilizzando una tecnica di raccolta dei tessuti sterili simile a quelli utilizzati per i topi²². Quindi, fissarli in 4% paraformaldeide durante la notte per l'incorporamento di cera paraffina.

3. Immunoistochimica

NOTA: tutte le sezionazioni e le colorazioni H&E sono state eseguite dal Translational Pathology Core Laboratory (TPCL) dell'Università della California, Los Angeles.

1. Cuocere i vetrini a 65 gradi centigradi per 20 min e deparaffinare 3 volte con xilene e reidratare in serie dal 100% di etanolo all'acqua.
2. Recuperare gli antigeni in un tampone di citrati bollito in un piroscafo vegetale per 25 min.
3. Applicare 1% BSA per il blocco. Quindi applicare gli anticorpi primari (anti-VHL, anti-HA, anti-bandiera) preparati con un rapporto di diluizione 1:200 in PBS. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.
4. Dopo aver lavato 3x con TBST (7 min ciascuno), incubare i vetrini con l'anticorpo secondario a 1:200 didiluizione. Lavare 3x con TBST (7 min ciascuno) e applicare reagenti DAB seguiti da controtendenza dell'ematossino.

4. Citometria di flusso

1. Elaborare il buffer di lisi di topo o di pollo con i globuli rossi (RBC) in base al protocollo del produttore.
   NOTA: Una lisi RBC sufficiente è particolarmente importante quando si analizza il sangue CAM perché gli RBC di pollo sono nucleati e non possono essere facilmente distinti nella citometria di flusso utilizzando la dispersione in avanti e laterale.
2. Eseguire citometria di flusso sul lisaritmo di sangue e analizzare i dati per mStrawberry ed EGFP espressione.
3. Impostare i cancelli primari in base alla dispersione in avanti e laterale escludendo detriti, cellule morte e RBC non a limeggiate.
4. Impostare i cancelli di fluorescenza in base ai campioni incontaminati e ai singoli controlli macchiati. Utilizzare il lisigio di sangue innescato con VHL-WT, VHL-KO, o cellule RENCA senza etichetta come i singoli controlli macchiati e controlli non statuati, rispettivamente.

Risultati

Ogni esperimento è stato eseguito almeno 3 volte, salvo diversa indicazione. I dati sono presentati come media : deviazione standard (SD). Il significato è stato determinato da un abbinato, test T di Student quando c'erano due gruppi o da un ANOVA di sola andata quando c'erano tre o più gruppi. Per stabilire il significato è stato utilizzato un taglio a valore p pari a 0,05.

Le cellule RENCA impiantate ortotopicamente sono c...

Discussione

Per molti pazienti con malignità epiteliale, la metastasi agli organi vitali è la causa primaria della mortalità. Pertanto, è essenziale trovare il meccanismo sottostante e una nuova via di terapia per la malattia metastatica. Purtroppo, mancano modelli animali metastatici ccRCC. La sfida in gran parte è dovuta all'incapacità di ricreare ccRCC nei topi nonostante la generazione di numerosi modelli di topo da knockout VHL mirati a i reni transgenici^9,10. Qui...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate	Corning	25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit	Dremel	8050-N/18
anti-VHL antibody	Abcam	ab135576
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	BD Biosciences	14-826-79
BD Pharm Lyse	BD Biosciences	555899
BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826-5D
DAB Chromogen Kit	Biocare Medical	DB801R
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Goldbio	LUCK-1G
DPBS without Calcium and Magnesium	Gibco	LS14190250
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)	eBioscience	14-6681-82
Ethanol 200 Proof	Cylinders Management	43196-11	Prepare 70% in water
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions	Fisher Scientific	10-437-028
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-940
Fisherbrand Sterile Cotton Balls	Fisher Scientific	22-456-885
FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122
FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129
Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology	MilliporeSigma	1.00496.5000
Hamilton customized syringe	Hamilton	80408	25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm
HA-probe Antibody (Y-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc805
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D
Isothesia (Isoflurane) solution	Henry Schein Animal Health	1169567762
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System	Perkin Elmer
Matrigel GFR Membrane Matrix	Corning	C354230
Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18"	Medex Supply	MED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation	MilliporeSigma	2910-25GM
Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin	Fisher Scientific	MT-30-002-CI
Pentobarbital Sodium	Sigma Aldrich	57-33-0	Prepare 1% in saline
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	115-035-062
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-035-045
Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use	Ricca Chemical	395516
pSicoR	Addgene	11579
Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics	Fisher Scientific	AC227420500
Renca	ATCC	CRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine	Corning	10040CV
Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile	Fisher Scientific	AB-0700
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96)	Thomas Scientific	1159M40
Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls	Office Depot	220717
Suture	Ethicon	J385H
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	1634
Thermo-Chicken Heated Pad	K&H manufacturing	1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet)	Tygon	AACUN017
VHL-KO			CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase
VHL-WT			Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase
World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR	Fisher Scientific	50-822-331
Wound autoclips kit	Braintree scientific, inc.	ACS KIT
Xylenes (Histological), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X3S-4