Сравнение метастатической ясной клеточной почечной карциномы модели, созданной в мышиной почки и на куриные хориоаллантоический Membrane

Резюме

Метастатическая ясная клеточная карцинома является заболеванием без комплексной модели животных для тщательного доклинического исследования. Этот протокол иллюстрирует две новые модели животных для болезни: ортотопически имплантированной мыши модели и курица хориоаллантоической мембранной модели, оба из которых демонстрируют метастазирование легких, напоминающие клинические случаи.

Аннотация

Метастатическая ясная клеточная карцинома (ccRCC) является наиболее распространенным подтипом рака почек. Локализованный ccRCC имеет благоприятный хирургический исход. Тем не менее, одна треть пациентов CCRCC будет развиваться метастаза в легких, что связано с очень плохим исходом для пациентов. К сожалению, для этой смертельной стадии не предусмотрена терапия, так как молекулярный механизм метастазиса остается неизвестным. Уже 25 лет известно, что потеря функции гена супрессора опухоли фон Гиппель-Линдау (VHL) является патогномонической ccRCC. Однако не было создано клинически релевантных трансгенных мышей модели ccRCC. Цель юга этого протокола состоит в том, чтобы внедрить и сравнить две вновь созданные модели животных для метастатического ccRCC. Во-первых, почечная имплантация в модели мыши. В нашей лаборатории система редактирования генов CRISPR была использована для выбивания гена VHL в нескольких линиях клеток RCC. Ортотопическая имплантация неоднородных популяций ccRCC в почечную капсулу создала новые модели ccRCC, которые развивают надежные метастазы легких у иммунокомпетентных мышей. Вторая модель - система куриной хориоаллантоической мембраны (CAM). По сравнению с моделью мыши, эта модель больше времени, труда и экономически эффективным. Эта модель также поддерживала надежное образование опухоли и интравазацию. Из-за короткого 10-дневного периода роста опухоли в CAM, никаких явных метастаз не наблюдалось иммуногистохимией (IHC) в собранных тканях эмбриона. Однако, когда рост опухоли был продлен на две недели в вылупившихся курица, микрометатические поражения ccRCC наблюдались IHC в легких. Эти две новые доклинические модели будут полезны для дальнейшего изучения молекулярного механизма метастазов, а также для создания новых, полученных пациентом ксенотрансплантатов (PDXs) к разработке новых методов лечения метастатического ccRCC.

Введение

Карцинома почечных клеток (RCC) является^{7-м наиболее} распространенным раком в Соединенных Штатах. Ежегодно, 74000 американцев, по оценкам, вновь диагностируется, что составляет более 14000 смертей (Ясно-клеточный гистологический подтип, или ccRCC, является наиболее распространенным подтипом, на долю которого приходится около 80% случаев RCC. Пациенты с локализованной злокачественностью лечатся нефрэктомией и имеют благоприятную 5-летнюю выживаемость 73%^1. Тем не менее, 25%-30% пациентов развиваются отдаленные метастаза в жизненно важные органы, такие как легкие, в результате чего плохое среднее выживание 13 месяцев и 5-летняя выживаемость только 11%^1,2,3. Дальнейшее понимание метастатического механизма необходимо для улучшения смертельного исхода для метастатического ccRCC.

Потеря гена супрессора опухоли VHL является отличительной чертой генетического поражения наблюдается в большинстве случаев ccRCC человека^4,5,6,7. Однако точный онкогенный механизм потери ВХЛ в ccRCC неизвестен. Кроме того, статус выражения VHL не является предсказуемым исхода в ccRCC⁸. Примечательно, что, несмотря на многочисленные попытки почечно-эпителиальной целевой VHL нокаут, ученые не смогли создать почечной аномалии за пределами неопластических кистозных поражений наблюдается у мышей⁹, даже в сочетании с удалением других супрессоров опухоли, такие как PTEN и p53¹⁰. Эти выводы подтверждают идею о том, что потери ВХЛ сами по себе недостаточно для опухоли или последующего спонтанного метастаза.

Недавно наша лаборатория создала новую линию клеток VHL knockout (VHL-KO) с использованием CRISPR/Cas9 опосредованного удаления гена VHL в линии клеток MURINE VHL ' ccRCC (RENCA, или VHL-WT)^11,12. Мы показали, что VHL-KO является не только мезенхимальным, но и способствует эпителии к мезенхимального перехода (EMT) вВХЛ-WT клеток¹². ИЗВЕСТНО, что EMT играет важную роль в метастатическом процессе^13. Наша работа также показала, что отдаленные метастазирование легких происходит только при совместном имплантации в почках вВХЛ-КО и ВХЛ-ВТ, поддерживая кооперативный механизм метастазирования. Важно отметить, что наша ортотопически имплантированная модель VHL-KO и VHL-WT приводит к устойчивым метастазам легких, повторяя клинические случаи ccRCC. Эта спонтанная метастатическая модель ccRCC компенсирует отсутствие трансгенной метастатической мышиной модели, особенно при разработке новых противметастатов. Этот протокол демонстрирует имплантацию почечной капсулы неоднородных клеточных популяций генетически модифицированных клеток RENCA.

Куриные модели CAM имеют долгую историю в исследованиях ангиогенеза и биологии опухоли из-за их многочисленных преимуществ, как обобщено в таблице 1^{14,15,16,17,18}. Короче говоря, временное окно для роста опухоли CAM является коротким, что позволяет максимум 11 дней, пока CAM разрушается при вылуплении курицы¹⁶. Несмотря на короткое время роста, богатое питание и иммунодефицитное состояние куриного эмбриона позволяют очень эффективно привить опухоль^16,19,20,21. Наконец, стоимость каждой оплодотворенной яйцеклетки составляет 1 евро по сравнению с более чем 100 долларами за мышь SCID. Вместе модель CAM может служить ценной альтернативной моделью для животных в создании новых PDX при большой экономии времени и затрат по сравнению с мышью. В этом протоколе мы оценивали, удалось ли модели резюмировать биологию метастатического ccRCC, наблюдаемого в ортотопической модели мыши.

	(SCID) Мыши	Камера	Примечание
Стоимость	100 долларов США каждый	1$1 каждый	Выживаемость от 50-75%
Потребность в барьерном жилье	Да	Нет	Дальнейшее снижение затрат и упрощение последовательного мониторинга опухолей
Опухоль непосредственно видна	Нет	Да	Рисунок 3A
Время для первого прививоки (RENCA)	2 недели	2-4 дня	реф 14, 15
Конечная точка роста (RENCA)	3-6 недель	10 дней	реф 14, 15
Метастаз (RENCA) наблюдается	Да	Да у цыплят	Рисунок 3D
Серийные проходы	Да	Да	рефери 16-18
Проход к мышам (RENCA)	Да	Да	Hu, J., et al. в стадии рассмотрения (2019)
Поддержание неоднородности опухоли	Да	Да	Hu, J., et al. в стадии рассмотрения (2019)

Таблица 1: Преимущества и ограничения моделей мыши и CAM. В этой таблице сравниваются две модели по их преимуществам и ограничениям с точки зрения требуемого времени, затрат, труда, а также биологии. Модель CAM имеет преимущества в эффективности, но она также имеет свои собственные уникальные ограничения из-за различных морфологии между птицами и млекопитающими. Поэтому важно подтвердить, что модель может сохранить биологию ксенотрансвантов.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC), назначенным как Комитет по исследованиям животных канцлера UCLA (ARC) (ARC 2002-049-53 и ARC 2017-102-01A). Протокол 2002-049-53 оптимизирован для имплантации опухолевых клеток ccRCC в почечную капсулу мышей Nude или BALB/c. Эксперименты по имплантации опухоли в оплодотворенных куриных яйцах до вылупления не требуют одобрения IACUC. Чтобы продлить время для установления метастазиз легких, эмбрионы с опухолью CAM могут вылупляться и расти в кур. Протокол 2017-102-01A охватывает эти эксперименты на животных.

1. Ортотопические исследования опухоли у мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Хронология этого эксперимента показана на рисунке 1A. Эти процедуры были адаптированы из предыдущих^{публикаций 11,12}.

1. Подготовка одноклеточной подвески для прививки
   1. Отсоедините клетки RENCA VHL-WT и VHL-KO от культурных блюд с помощью трипсина/EDTA.
   2. Подсчитайте клетки гемоцитометром и повторно приготовьте в предварительно охлажденный 1:1 смесь PBS и внеклеточного матричного раствора в концентрации 1 х 10⁵ клеток/ Л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соотношение 1:4 клеток VHL-WT:VHL-KO для неоднородных имплантатов и только VHL-WT для однородных имплантатов.
   3. Перенесите переплетемые клетки в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл и держите на льду до имплантации.
2. Имплантация в почечную капсулу
   1. Анестезия: Разогреть теплую подушечку до 37 градусов по Цельсию и покрыть его куском толстой стерильной драпировки. Анестезия мыши либо изофлуран ингаляции через индукционную камеру или интраперитонеальной (IP) инъекции 1% пентобарбитального натрия в дозировке 10 мл/кг.
   2. Бритье волос из хирургического участка. Этот шаг можно пропустить для обнаженных мышей.
   3. Дезинфекция и хирургическая драпировка: Дезинфекция задней части мыши полностью с повид-йод 3x следуют 70% этанола 1x и протрите его сухим с стерильными ватными тампонами. Затем нанесите три стерильные медицинские повязки последовательно, покрывая всю спину, чтобы создать хирургическое поле, а также обездвижить мышь.
   4. Разрез и экстерьер из почек: Перед операцией продезинфицировать пальцы оператора поидон-йодом или использовать пару стерильных перчаток. Поместите мышь в положение лежа и использовать пальцы, чтобы найти левую почку прямо под левым флангом. Используйте пару тупых щипцы и ножницы, чтобы разрезать кожу открытой и мышечный слой под указанным местом. Используйте стерильные ватные тампоны и щипцы, чтобы частично экстерьеризировать левую почку из живота.
   5. Имплантация опухолевых клеток: Загрузите клеточную подвеску, подготовленную в шаге 1.1 в инсулиновых шприцах или настраиваемых шприцах Гамильтона (см. Таблицу Материалов для спецификаций). Вводят 20 л из подвесных клеток под капсулу почки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная инъекция определяется образованием полупрозрачного выпуклости на поверхности почки. Случайная инъекция в почечную паренхиму приводит к кровотечению и послеоперационной смертности выше 90% из-за смертельного кровоизлияния в месте инъекции.
   6. Медленно вытащите иглу, чтобы внеклеточный матричного раствора затвердеть и предотвратить кровоизлияние или утечку опухолевых клеток. Затем, используя стерильный ватный тампон, нажмите почки обратно в живот.
   7. Рана сшивание: Используйте 5-0 покрытием VICTRYL шов, чтобы сшить мышечный слой. Дезинфицировать кожу с помощью повид-йода один раз и закрыть кожу с раной автоклипов.
   8. Восстановление: Поместите мышь на теплую площадку, пока она не проснется. Если мышь была обезглавлена путем вдыхания, снять изофлуран и держать мышь на теплой площадке, пока он не проснулся.
3. Биолюминесценция (BLI) и сбор тканей
   1. Через шесть недель после имплантации опухоли, принимать светлячковых основе BLI изображений. Затем эвтаназии мышей с изофлуранинга ингаляции с последующим вывихом шейки матки.
   2. Сбор крови для циркулирующих опухолевых клеток (CTC) обнаружения потока цитометрии.
   3. Урожай опухоли и органов, представляющих интерес (почки, легкие, печень, кишечник и селезенку) с использованием стерильной ткани уборки техники²². Исправить их в 4% параформальдегида на ночь для парафина воска встраивания.

2. CAM опухоли ксенотрансвтат модель

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти процедуры были адаптированы и изменены из ранее опубликованных протоколов^23,24. Хронология этой процедуры показана на рисунке 1B. В этой статье представлен только обтекаемый протокол. Для получения подробных протоколов, пожалуйста, обратитесь к другой статье JoVE, опубликованной нашей группой²⁵.

1. Преинкубация: Инкубировать свежеотложенные, оплодотворенные куриные яйца в вращающемся яичном инкубаторе при 37 градусах Цельсия и влажности 55-65% в течение 7 дней.
2. Бросьте CAM и открытое окно (день развития 7):
   1. Найдите и пометьте воздушный мешок и вены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно 10-15% яйцеклеток удаляются, потому что они либо не оплодотворены, либо умирают в течение 7 дней после оплодотворения.
   2. Создайте новый воздушный мешок поверх отмеченной вены.
   3. Разграничить новый воздушный мешок, нанесите упаковочная ленту и положите яйца обратно в инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура может быть приостановлена здесь. Рекомендуется возобновить процедуры в течение того же дня, потому что воздушный мешок может двигаться.
   4. Откройте окно: Используя пару изогнутых микрорассечения ножницы и пару иглонононононов щипцы, вырезать 1,5 х 1,5 см круглое окно в оболочке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нарушение CAM указывается кровью и кусок CAM настоящее время на разрезе оболочки кусок.
   5. Запечатать отверстие прозрачной медицинской заправкой и поместить яйца в стационарный инкубатор при 37 градусах Цельсия и влажности 55%-65%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте тот же инкубатор яйца, что и в шаге 2.1. Выключите ротатор, чтобы сделать его неподвижным.
3. Проверка здоровья (день развития 9): Удалить мертвые яйца, а затем случайно группировать остальные яйца для имплантации опухолевых клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, выживаемость на данный момент составляет около 80% от развития день 0.
4. Прививка опухолевых клеток на недавно открытый CAM (день развития 10)
   1. Разбавить внеклеточный матричного раствора в два раза больше объема предварительно охлажденных RPMI 1640 (с L-глютамина). Отсоедините клетки RENCA и повторно приостановите в вышеуказанном растворе, чтобы достичь концентрации 2 х 10⁴ ячеек/Зл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соотношение 1:1 клеток VHL-WT:VHL-KO для неоднородных имплантатов и только VHL-WT для однородной имплантации.
   2. Чтобы предукрепить суспензию клеток, заполните 100 кЛ каждой клеточной смеси в 200 наконечниках пипетки и поместите их в клеточный инкубатор в течение 15 минут.
   3. Имплантировать 100 зл клеточной подвески для каждого яйца на поверхности CAM через окно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые протоколы требуют царапин CAM до имплантации²³. Это не обязательно для клеток RENCA, потому что они растут очень быстро.
5. Выращивайте клетки на CAM в течение 10 дней и фотографируйте каждые 2 дня.
6. Эвтанизировать и собирать опухоль, кровь и органы.
   1. В день развития 20 (опухолевый день 10), собирать кровь через хориоаллантоической вены с гепарина 10 мл шприца.
   2. Эвтанизировать эмбрионы, поставив их на лед в течение 15 минут.
   3. Урожай и взвешивание опухолей. Вскрыть легкие и печень с помощью стерильной ткани уборки техники, аналогичной той, которая используется для мышей²².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Куры печени имеют две доли, которые являются первыми органами видели в брюшной полости. Не путайте их с легкими. Куриные легкие расположены под сердцем и перегородкой²⁶. Успешная коллекция легких может быть подтверждена открытыми ребрами.
   4. Исправить опухоли и вскрытые органы в 4% параформальдегида ночь для парафина воска встраивания.
7. Выщелачить цыплят.
   1. Чтобы обеспечить длительный период роста опухоли, продолжайте инкубацию в течение 21 дня и позвольте цыплятам вылупиться при 37 градусах Цельсия и не менее 60% влажности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Куры естественно люк после 21-го дня в течение 24 ч период времени, но иногда возникают проблемы штриховки сами по себе. В этом случае, растрескивание яичной скорлупы некоторые помогает. Важно для цыплят, чтобы завершить процесс вылупления в течение 24 ч, потому что они умрут от недостатка питательных веществ после этого.
   2. Выращивайте кур на животноводческой ферме (2017-102-01A) в течение 2 недель.
   3. На развитие 34 (опухоль день 24), эвтаназии птенцов с изофлуранинга с последующим вывихом шейки матки.
   4. Вскрыть легкие с помощью стерильной ткани уборки техники, аналогичной тем, которые используются для мышей²². Затем, исправить их в 4% параформальдегида на ночь для парафина воска встраивания.

3. Иммуногистохимия

ПРИМЕЧАНИЕ: Все ткани секции и Н И E окрашивания было сделано в лаборатории translational патологии Core (TPCL) в Университете Калифорнии, Лос-Анджелес.

1. Выпекать слайды при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 20 минут и депарафинизировать 3x с помощью ксилена и регидратировать последовательно от 100% этанола до воды.
2. Извлекайте антигены в цитратном буфере, варящемся в овощном пароходе в течение 25 мин.
3. Применить 1% BSA для блокировки. Затем нанесите первичные антитела (анти-VHL, anti-HA, anti-flag) подготовленные на коэффициенте разбавления 1:200 в PBS. Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
4. После мытья 3x с TBST (7 мин каждый), инкубировать слайды со вторичным антителом в 1:200 разбавления. Вымойте 3x с TBST (7 мин каждый) и применять DAB реагентов следуют гематоксилин контрпотирования.

4. Цитометрия потока

1. Обработайте мышь или куриную кровь с помощью буфера лиза из красных кровяных телец (РБК) в соответствии с протоколом производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно елизирбкя РБК особенно важно при анализе крови CAM, потому что куриные РБК нуклеитные и не могут быть легко различимы в цитометрии потока с помощью переднего и бокового рассеяния.
2. Запустите цитометрию потока на лицей крови и проанализируйте данные для выражения mStrawberry и EGFP.
3. Установите основные ворота на основе переднего и бокового рассеяния, исключая мусор, мертвые клетки и неизлёзовые РБК.
4. Установите флуоресценцию ворота на основе неокрашенных образцов и одного окрашенных элементов управления. Используйте анализ крови, загрунтованный с VHL-WT, VHL-KO, или немаркированные клетки RENCA в качестве одного окрашенных элементов управления и неокрашенных элементов управления, соответственно.

Результаты

Каждый эксперимент был выполнен по крайней мере в 3 x, если не указано иное. Данные представлены в виде среднего стандартного отклонения (SD). Значение определялось парным, Студенческим Т-тестом, когда было две группы или односторонней ANOVA, когда было три или более групп. Д...

Обсуждение

Для многих пациентов с эпителиальными злокачественными новообразованиями метастазы в жизненно важные органы являются основной причиной смертности. Поэтому необходимо найти основной механизм и новый путь терапии метастатических заболеваний. К сожалению, не хватает соответствующих ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate	Corning	25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit	Dremel	8050-N/18
anti-VHL antibody	Abcam	ab135576
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	BD Biosciences	14-826-79
BD Pharm Lyse	BD Biosciences	555899
BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826-5D
DAB Chromogen Kit	Biocare Medical	DB801R
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Goldbio	LUCK-1G
DPBS without Calcium and Magnesium	Gibco	LS14190250
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)	eBioscience	14-6681-82
Ethanol 200 Proof	Cylinders Management	43196-11	Prepare 70% in water
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions	Fisher Scientific	10-437-028
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-940
Fisherbrand Sterile Cotton Balls	Fisher Scientific	22-456-885
FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122
FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129
Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology	MilliporeSigma	1.00496.5000
Hamilton customized syringe	Hamilton	80408	25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm
HA-probe Antibody (Y-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc805
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D
Isothesia (Isoflurane) solution	Henry Schein Animal Health	1169567762
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System	Perkin Elmer
Matrigel GFR Membrane Matrix	Corning	C354230
Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18"	Medex Supply	MED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation	MilliporeSigma	2910-25GM
Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin	Fisher Scientific	MT-30-002-CI
Pentobarbital Sodium	Sigma Aldrich	57-33-0	Prepare 1% in saline
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	115-035-062
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-035-045
Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use	Ricca Chemical	395516
pSicoR	Addgene	11579
Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics	Fisher Scientific	AC227420500
Renca	ATCC	CRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine	Corning	10040CV
Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile	Fisher Scientific	AB-0700
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96)	Thomas Scientific	1159M40
Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls	Office Depot	220717
Suture	Ethicon	J385H
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	1634
Thermo-Chicken Heated Pad	K&H manufacturing	1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet)	Tygon	AACUN017
VHL-KO			CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase
VHL-WT			Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase
World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR	Fisher Scientific	50-822-331
Wound autoclips kit	Braintree scientific, inc.	ACS KIT
Xylenes (Histological), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X3S-4