Membran Olgun Adiposit Agrega Kültürleri (MAAC) Kullanarak İnsan Olgun Adipositlerin İzolasyon ve Kültürü

Özet

Membran olgun adiposit agrega kültürü (MAAC) kültür olgun insan adipositler için yeni bir yöntemdir. Burada insan yağlarından adipositleri nasıl izole edebileceğimizi ve MAAC'ı nasıl kurabileceğimizi ayrıntılarıyla anlatıyoruz.

Özet

Beyaz yağ dokusu (WAT) disregülasyonu insülin direnci ve tip 2 diyabet (T2D) gelişiminde merkezi bir rol oynar. T2D için yeni tedaviler geliştirmek için, daha fizyolojik olarak ilgili in vitro adiposit modelleri gereklidir. Bu çalışma, insan adipositlerini izole etmek ve kültür emzetmek için yeni bir tekniği tanımlar. Bu yöntem MAAC (membran olgun adiposit agrega kültürü) olarak adlandırılır ve diğer adiposit in vitro modelleri ile karşılaştırıldığında, MAAC taze izole olgun adipositlere en yakın adipojenik gen imzasına sahiptir. MAAC kullanılarak, adipositler yalın ve obez hastalardan, farklı yağ depolarından, farklı hücre tipleriyle birlikte kültüre alınabilir ve daha da önemlisi 2 hafta boyunca kültürde tutulabilir. Fonksiyonel deneyler de glikoz alımı, lipogenez ve lipoliz de dahil olmak üzere MAAC yapılabilir. Ayrıca, MAAC çeşitli farmakolojik agonizme sağlam yanıt ve kahverengi gibi yağ hücrelerine beyaz adipositlerin transdifferentiation dahil olmak üzere adiposit fenotipik değişiklikleri incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Obezite ve obeziteile ilgili eşlik eden hastalıklardaki dünya çapındaki artış yeni tedavi olanaklarının geliştirilmesini gerektirmektedir. Beyaz yağ dokusu (WAT) tüm vücut metabolizmasının önemli bir düzenleyici, enerji homeostaz, ve insülin direnci ve tip 2 diyabet gelişiminde merkezi bir oyuncu (T2D)^1,2. Kronik aşırı kalori tüketimi sırasında, adipositler enerji fazlalığı işlemek için büyütmek. Ancak, adiposit lipid depolama kapasitesi aşılabilir, yağ asitleri dolaşım düzeylerinin bir yükseklik ve periferik non-adipoz dokularda artan depolama ve lipotoksite yol açan^3,4.

Yüksek çevirisel alaka ile adiposit in vitro modellerin eksikliği obezite ve T2D için yeni tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir sorundur. Ex vivo eksplant modeli, yağ dokusunun küçük parçaları kültürlü olduğu, hipoksi ve inflamasyon tarafından yönlendirilen adipojenik gen ekspresyonunda hızlı değişiklikler ile ilişkilidir^5,6. Tavan kültürleri (CCs) olgun adipositler yüzer ve medya dolu şişelerin üst yapışır, hızla lipid^eksikliğifibroblast benzeri hücrelere farklılaşmak^{7 ,8,9,10}. En sık kullanılan model, in vitro olarak işlenen öncüllerden ayırt edilen adipositlerdir. Ayırt edici hücreler, ancak, morfolojik olarak erişkin olgun adipositlerden farklıdır, çünkü boyutları çok daha küçüktür ve tekiloküler lipid damlacığı ndan yoksundur. Bu model ile diğer sınırlamalar farklılaşma sürücü için bir kimyasal kokteyl fizyolojik ihtiyacı yanı sıra faktörlerin bir dizi etkilenebilir farklılaşma verimliliği değişkenlik içerir^11,12,13,14.

Biz son zamanlarda membran olgun adiposit agrega kültür geliştirdik (MAAC), taze izole olgun adipositler uzun vadeli kültür için bir yöntem, adipositler geçirimli membranlar altında kültürlü¹⁰. RNA dizilimi verilerinin tarafsız analizi, yağ dokusu eksektiflerine ve in vitro-didipositlere göre MAAC'ın yeni izole edilmiş adipositlere en çok benzediğini göstermiştir. MAAC hem deri altı hem de visseral yağ dokusundan izole edilmiş olgun adipositlerin yanı sıra hem obez hem de yağsız deneklerin adipositlerini kültüre almak için kullanılabilir. Bu metodoloji uzun vadeli adiposit fenotipik değişikliklerin incelenmesine izin verir ve diğer hücre tipleri ile adipositlerin ortak kültürünü kolaylaştırır. Burada insan yağ dokusundan olgun adipositlerin izolasyonu ve MAAC sisteminin nasıl kurulması için ayrıntılı bir protokol salıyoruz.

   

Protokol

İsveç'in Göteborg kentindeki Sahlgrenska Üniversitesi Hastanesi'nde elektif cerrahi uygulanan kadın hastaların karın bölgesinden isimsiz yağ dokusu örnekleri alındı. Tüm çalışma konuları doku kullanımı için yazılı bilgi vermeden önce yazılı ve sözlü bilgi aldı. Çalışmalar Göteborg, İsveç Bölgesel Etik İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır.

NOT: Yöntemegenel bir bakış Şekil 1'de verilmiştir.

1. Tamponların Hazırlanması, Doku Kültürü Medyası ve Kültür Plakaları

1. 35,1 g NaCl, 1,75 g KCl, 0,82 g KH₂PO₄ve 900 mL suda 1,48 g MgSO₄·7H₂O çözünerek 5x Krebbs Ringer (KR) stoğunu hazırlayın. 1,84 g CaCl₂·2H₂O ekleyin ve su ekleyerek hacmi 1 L'ye ayarlayın. Steril filtre 0,22 μm filtre ile ve 4 °C'de saklayın.
2. 5x KR stoğundan, 1x KR, 25 mM HEPES, 2 mM glukoz ve %2 büyükbaş serum albumin (BSA) içeren 1 L tampon hazırlayın (bundan sonra yıkama tamponu olarak anılacaktır). pH'ı 7.4 olarak ayarlayın.
3. 1x HBSS + CaCl₂ + MgCl₂, %2 BSA ve 450 mL su içeren 500 mL kollajenaz tampon hazırlayın (bundan sonra sindirim tamponu olarak anılacaktır).
   NOT: Kollajenaz, yağ dokusu adım 2.2 tartıldıktan sonra sindirim tamponuna eklenmemelidir.
4. Orta 199'un pH'ını 7,4'e ayarlayın.
5. Steril filtre hem tamponlar hem de orta 199 0,22 μm filtre şişesi ve 37 °C sıcak.
   NOT: Zaman kazanmak için doku kültürü ortamı hazırlanabilir ve yağ dokusu işlemeden önce plakalara eklenebilir. 24 kuyulu plaka formatı için(Şekil 1A),0.5−1 mL/iyi Dulbecco's modifiye Eagle's orta / Ham besin karışımı F12 (DMEM / F12), 10% fetal sığır serumu (FBS), 1% penisilin-streptomisin (penn / strep) ve 20 nM insülin kullanın. Küçük moleküller ve diğer kararlı farmakolojik ajanlar da istenilen düzende medyaya şu anda eklenebilir. Plakaları bir doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin (37 °C, %5 CO_2).

2. İnsan Subkutan Yağ DokusuDisedi

NOT: Biyolojik bir güvenlik kabini içinde çalışın ve izolasyon süreci boyunca steril tekniğin yanı sıra otoklavlı ve steril ekipmanların özel kullanımını kullanın.

1. 15 cm petri çanak insan yağ dokusu yerleştirin ve diseksiyon sırasında nemlendirilmiş tutmak için orta 199 küçük bir hacim ekleyin.
2. Yaklaşık bir golf topu büyüklüğünde yağ parçaları ile çalışma, cımbız ile büyük fibrotik kapları kavramak ve yavaşça kapalı makas arka ile yağ kazıyarak adipositler serbest. Fibrotik doku büyük parçaları atın. Kesilmiş yağı tartın.

3. Kollajenaz Tedavisi

1. 1 mg/mL konsantrasyonunda sindirim tamponuna kollajenaz ekleyin (bkz. adım 1.3). Çözeltiyi 0,22 m steril filtre kullanarak steril filtreleyin.
   NOT: Yağ gram başına sindirim tampon üç mL tavsiye edilir (yani, yağ 100 g için, tip 300 mg ile sindirim tampon 300 mL hazırlamak 2 kollajenaz).
   DİkKAT: Tip 2 Kollajenaz gözler, cilt için tehlikelidir ve solunum tahrişine neden olabilir. Eldiven, göz koruması ve kollajenaz ile çalışırken havalandırılan bir başlık içinde çalışmak giyin.
2. Yaklaşık 10 g yağ dokusunu 15 cm petri kabına taşıyın ve yumuşak homojen bir karışım alanıncaya kadar bir çift kavisli makas kullanarak yağı dikkatlice dolayın ve büyük yağ parçaları kalmadan elde edin. Tüm yağ işlenene kadar işlemi tekrarlayın.
   NOT: Her tur yaklaşık 2 dakika sürmelidir ve yağ parçaları geniş delikli pipet ucu kullanılarak boru haline ülecek kadar küçük olmalıdır. Bu adım yüksek kaliteli adipositler verim için çok önemlidir. Parçalar çok büyükse, sindirim süreleri uzatılmalı ve hücre viabilty'den ödün vermek gerekir.
3. Bir kaşık kullanarak 50 mL konik tüpler içine kıyılmış yağ aktarın. Her tüpe 10 mL kıyma ve 30 mL sindirim tamponu ekleyin. 10 mL'den az kıyılmış yağ varsa uygun hacimlere küçültün.
4. 30−45 dakika boyunca 150 rpm sürekli ajitasyon ile sallayarak bir inkübatör 37 °C'de doku sindirin. 30 dk sonra, aşırı sindirim önlemek için her 5 dakikada bir süreci kontrol edin.
   NOT: Yağ çözeltisi büyük parçalar olmadan homojen olduğunda ve kayısı rengine sahip olduğunda sindirim tamamlanır.

4. Hücre Süspansiyonunun Filtrasyonu ve Olgun Adipositlerin Saflaştırılması

1. 1 L steril şişenin üzerine bir huni yerleştirin ve huninin içine steril 250 m mesh filtresi yerleştirin. Sindirilmemiş doku kaldırmak için filtre içine sindirilmiş yağ çözeltisi dökün.
2. Tüm adiposit süspansiyon filtre geçti, yavaşça adipositlerin verimini artırmak için kafes filtresi sıkmak. Yaklaşık 50−100 mL yıkama tamponu dökün, durulayıp filtreyi tekrar sıkın.
3. Bir ayırma hunisi içine şişeden izole adiposit süspansiyon dökün ve huni neredeyse tamamen dolana kadar yıkama tampon ekleyin. Adiposit süspansiyonu tamponla karıştırmak için huniyi birkaç kez hafifçe ters çevirin.
4. Olgun adipositler ve serbest lipid ve tampon ve yağ stroma vasküler fraksiyonu (SVF) içeren bir alt tabaka içeren bir üst sarı tabaka ile 2 kat(Şekil 1B)ayrı bir ayrım olana kadar süspansiyon 2−3 dk bekletin.
5. Ayırma hunisi üzerindeki nozulu açın ve alt çözeltiyi steril bir şişeye yavaşça verin (SVF'den hücreler 200 x g'de 7 dk için santrifüjden sonra peletlenebilir ve toplanabilir). Ayırma hunisi olgun adipositler ile üst tabaka tutun.
6. Olgun adipositleri iyice yıkamak ve kollajenazın tamamını çıkarmak için yıkama işlemini 4.3−4.5 adımlarında üç kez tekrarlayın.

5. Olgun Adipositlerin Paketlenmesi

1. Nozulu açın ve saflaştırılmış olgun adiposit süspansiyonu 50 mL konik tüpler halinde toplayın.
2. 3 dakika boyunca 50 x g tüpleri döndürerek olgun adipositleri hafifçe paketleyin.
3. Adiposit süspansiyonunun altındaki kalan yıkama tamponu çıkarmak için 18 G iğne ve şırınga kullanın.
4. Bir pipet kullanarak olgun adipositlerin üzerine yüzen serbest lipid tabakasını (izolasyon işlemi sırasında kırıyan adipositlerin küçük bir kısmından yağ) çıkarın.
   NOT: Adipositlerin 6.5 adımda membranlardan damlama riskini azaltmak için, olgun adipositler membranlara tohumlandığında lipid tabakasının ve tüm yıkama tamponlarının çıkarılması önemlidir. Bu nedenle 3 tüp halinde adiposittoplamak. En son toplanan numuneler en fazla taşıma lipidine sahip olacak ve bu nedenle en düşük kalitede olacaktır. Ancak dikkatli pipetleme ile bu numuneler kullanılabilir.

6. Olgun Adipositlerin Tohumlanması

1. Geçirimli membran kesici uçlar(Malzeme Tablosu)içeren paketi açın ve membran bileşenini çıkarın. Ters çevirin ve steril bir yüzeye yerleştirin, böylece membranlar tavana bak.
2. Pipet 30 μL paketlenmiş olgun adipositlerin her bir membranüzerine(Şekil 1C). Ucu ile membran dokunmadan kaçının. Hücreleri tohumlamak için geniş delikli pipet uçları kullanın veya daha geniş yapmak için pipet ucu küçük bir parça kesmek için makas kullanın.
3. Farklı boyutlarda ki adipositlerin eşit dağılımını sağlamak için, tohumlama işlemi boyunca paketlenmiş adipositlerle birlikte 50 mL'lik tüpleri yavaşça ters çevirin.
4. Kuvözden ortam içeren hazırlanmış çok kuyulu plakaları biyogüvenlik kabinine getirin ve kapakları çıkarın. Adipositlerle tohumlanmış zarları alın ve 6.5 adımda ters çevrilebilsin diye alttan tutun.
5. Bir düzgün hareketle, tohumlu adipositlerin aşağı bakacak şekilde üstteki adipositlerle membranları ters çevirin(Şekil 1D). Adipositlerle plakayı ortam içeren kuyulara indirin (Şekil 1E).
6. Plaka kapağını koyun ve dikkatlice bir doku kültürü kuluçka içine plaka aktarın. Adipositler başlangıçta kolayca yerinden çıkarılabilir, çünkü plakanın hızlı hareket kaçının.
   NOT: Hücrelerin zara daha sıkı yapışması birkaç gün sürer.

7. Analiz için Adipositlerin Bakımı ve Hasat

1. En az 7 günde bir medyayı değiştirin. Her membran kesici uçtaki kesme deliği aracılığıyla ortamı çıkarın ve ekleyin. Ortamı çıkarmak için şırınga ve iğne, aspire değnek veya p200 uçlu bir pipet kullanın. Medya eklemek için, adipositleri rahatsız etmemek için duvarın kenarındaki kuyulara bir pipet ve yavaş yavaş pipet yeni ortam kullanın.
   NOT: Adipositler 7 gün sonra bir medya değişikliği ile 2 hafta boyunca kültürlü edilmiştir. Ancak, farklı yağ kökeni ve deneysel sorular artan medya değişikliklerinden yararlanabilir.
2. RNA hasat etmek için, adım 7.1'de açıklandığı gibi ortamı çıkarın ve hücreleri lyse lemek için doğrudan kuyulara 500 μL likis tamponu(Malzeme Tablosu)ekleyin. Görüntüleme için hücreleri düzeltmek için, % 1'lik son konsantrasyonla doğrudan kuyuya formaldehit ekleyin.
   NOT: Hücreler daha sonra 4 °C'de saklanabilir.

Sonuçlar

MAAC olarak kültürlü olgun adipositler işlevlerini korur, fenotip, ve çeşitli farmakolojik tedavilere adiposit yanıtları çalışma için kullanılabilir. Deri altı yağ dokusundan izole edilen 1 haftalık kültürden sonra sadece olgun adipositlerde bulunan karakteristik tekloküler lipid damlacıklarını korurlar (Şekil 2A). MAAC 1 hafta boyunca ya PPARγ agonistleri rosiglitazone (Rosi) ve pioglitazone (Pio) veya glukokortikoid reseptörü (GR) agonist deksametazon (Dex) ile tedavi edilirken farklı nükleer hormon reseptörü (NHR) agonistleri sürücü MAAC hedef genlerde değişiklikler tahmin belirlemek için kültürlü oldu. Rosi ve Pio PPARγ duyarlı genlerin ekspresyonunu sırasıyla 4 ve 2−3 kat artırmış, deksametazon ise hiçbir etkisi olmamıştır(Şekil 2B). Benzer şekilde, deksametazon gr hedef genleri APOD ve FKBP5 genekspresyonunu sırasıyla 13 ve 55 kat yönlendirirken, PPARγ agonistlerinin önemli bir etkisi olmadı. Daha önce taze izole insan olgun beyaz adipositler Rosi¹⁰ile tedavi edildiğinde MAAC bir kahverengi benzeri fenotip içine transfarklılık olduğunu göstermiştir. Rosi veya Pio ile 7 günlük bir tedavi güçlü kahverengi yağ özgü gen UCP1 gen ekspresyonunu indüklenen 44-65 kat, yanı sıra kahverengi yağ marker PDK4 12-18 kat ekspresyonu arttı(Şekil 2C).

Şekil 1: MAAC kurulumunun görsel diyagramı. (A) Orta hazırlanması. (B) Olgun adipositlerin izolasyonu ve ambalajı. (C) Olgun adipositleri membranlara tohumlamak. (D) Adipositleri bağlı tutarken membranları ters çevirin. (E) Membranları ortama indirgin ve ortayı değiştirerek. Bu rakam Harms ve ark.^10'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: MAAC bir hafta boyunca tekloküler görünümü korur ve çeşitli farmakolojik agonizme yanıt verir. (A) Temsili 4x ve 10x parlak alan görüntüleri MAAC kültür bir hafta sonra. Büyük tekiloküler lipid damlacıkları ile ortalama çapı 100 μm olan adipositler kolayca ayırt edilebilir. (B) PPARγ hedef genlerinin mRNA düzeyleri ve glukokortikoid reseptörü (GR) araç (Vehc), rosiglitazone (Rosi), pioglitazone (Pio) veya deksametazon (Deks) ile tedavi 7 gün sonra MAAC hedef genleri. Rosi, Pio ve Dex, araç (Vehc), rosiglitazone (Rosi), pioglitazone (Pio) veya deksametazon (Deks) ile 7 günlük tedaviden sonra MAAC'de kahverengi yağla zenginleştirilmiş genlerin 10 μM. (C)mRNA seviyelerinde son konsantrasyonda kullanıldı. Rosi, Pio ve Dex 10 μM'lik son konsantrasyonda kullanıldı. Tüm gen ekspresyonu verileri için, TATA bağlayıcı protein (TBP) iç normalleştirme kontrolü olarak kullanılmıştır. İstatistikler Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak hesaplanmıştır. (ortalama ± SD, n = 3, *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

   

Tartışmalar

Membran olgun adiposit agrega kültürü (MAAC) taze izole olgun adipositlerin uzun vadeli kültür için yeni bir yöntemdir. MAAC'ın kurulmasında, protokolde olgun adipositlerin verimini, kalitesini ve uygulanabilirliğini büyük ölçüde etkileyen birkaç kritik adım vardır. Bu adım doğrudan adipositler kollajenaz maruz kalan zaman miktarını etkiler beri çok çaba adım 3.2 yağ kıyma koymak gerekir. Yağ parçaları çok büyükse, sindirim süresi nin uzatılması gerekir ve bu da hücrelerin canlılığını olumsuz etkiler. Tersine, doku makasla çok ince işlenirse, canlılık da etkilenebilir. MAAC olarak olgun adipositlerin başarılı bir kültür için, aşağıdaki adımlara özel dikkat vermelidir: membranlar üzerine adipositlerin başarılı tohumlanması için, serbest lipid ve taşıma yıkama tampon olgun adipositler kaldırılır çok önemlidir adım 5.3 ve 5.4. Kalan lipid veya yıkama tamponu adipositlerin yüzey gerilimini azaltacak ve adipositlerin ters çevrildiğinde membranlardan damlama riskini artıracaktır. Adipositler tohumlu ve ortamda olduğunda, hücreler öncelikle yüzdürme yoluyla membran ile temas halinde kalır, böylece hücreleri kaybetmemek için ortam değiştirirken yavaş ve nazik bir teknik önerilir. Adım 7.1'de açıklandığı gibi kuyuların altındaki ortamı çıkarın ve medyayı duvarların kenarlarından yavaşça borulayarak ortam ekleyin. Son olarak, zaman tasarrufu önerisi adiposit izolasyon işlemi önce medya ve tedaviler ile plakaları hazırlamaktır. Özellikle karmaşık deneysel tasarımlar için, plakaların önceden hazırlanması çok zaman kazandırır ve adipositlerin izole edilir yayılmaz tedavileri ile ortama yerleştirilmesini sağlar.

Maac kullanarak preadipocytes ayırt karşılaştırıldığında bir yararı kullanılan MAAC medya çok basit ve fizyolojik olmayan bir hormon kokteyl gerektirmez. Burada glikoz açısından zengin medya (DMEM/F12), %10 FBS, %1 penn/strep ve 20 nM insülin ile kültürlenmiş MAAC'a sahibiz. Daha da önemlisi, insülin kesinlikle UCP1¹⁰rosiglitazone / pioglitazone tahrik indüksiyon için gerekli olduğunu bulduk. İnsülin, ancak, hücrelerin adipojenik fenotip korumak için gerekli değildir. Böylece, deneysel soruya bağlı olarak, insülin dahil edilebilir veya atlanabilir.

Yukarıda ayrıntılı prosedür izolasyon ve insan adipositkültürü için optimize edilmiştir. Ancak, fare, ve muhtemelen diğer organizmanın adipositler, aynı zamanda MAAC olarak kültürlü olabilir. Fare adipositleri MAAC olarak kültürlenecekse, akılda tutulması gereken ek hususlar ve önlemler vardır. Farelerden gelen olgun adipositlerin insanlardan çok daha kırılgan olduğunu bulduk. Sonuç olarak, sindirim süresi hücre canlılığını artırmak için mutlak bir minimumkısaltılmalıdır. Ayrıca genç farelerden gelen adipositlerin (8 haftalık ve genç) en sağlam ve tekrarlanabilir sonuçları sağladığını bulduk. Son olarak, fare MAAC bir haftaya kadar kültürlenebilir, ancak adipojenik fenotiplerinin insanlardan daha az kararlı göründüğü göz önüne alındığında (en az iki hafta boyunca kültürlenebilir) fare MAAC'ı ele almak için gereken en az süre için kültüre almanızı öneririz. deneysel sorular.

MAAC modeli geçirimli membranlar kullanılarak dayandığıiçin, bu tekniğin bir avantajı diğer hücre tipleri ile birlikte olgun adipositler kültüre olasılığıdır. Daha önce maac¹⁰kullanımı ile crosstalk olgun adipositler ve makrofajlar yeteneğini göstermiştir. Bu daha fazla obezite arasındaki bağlantıyı keşfetmek için fırsatlar açılır, insülin direnci, ve bağışıklık yanıtları^15,16,17. Gelecekteki deneyler, MAAC modelinin karmaşıklığını ve çevirisel alaka düzeyini daha da artırmak ve birden fazla hücre tipi arasındaki çapraz konuşmayı araştırmak için hepatositler, preadipocytes, endotel hücreleri veya pankreas hücreleri gibi diğer hücre türlerini de dahil edebilir.

MAAC'ın diğer adiposit in vitro modellere göre adipositlerin işlevselliğini ve kimliğini korumada üstün olduğu gösterilmiş olsa da, dikkate alınması gereken sınırlamalar da vardır. Öncül hücrelerden farklı olan adipositlerin kullanılmasıyla karşılaştırıldığında, MAAC daha zahmetli ve zaman alan bir modeldir. Membranlı plakalar da normal hücre kültürü plakalarına göre daha pahalıdır. Daha da önemlisi, olgun adipositler tohumlama üzerine her zaman taze izole edilmesi gerekir ve genişletilemez veya öncül hücreler gibi stoklar içine dondurulmuş. Böylece, bu taze beyaz yağ dokusu örnekleri ne erişim gerektirir, ama aynı zamanda donör varyasyonları donör kaynaklanan karmaşıklık düzeyi ekler.

Burada insan olgun adipositler izole ve MAAC kurma için ayrıntılı bir protokol sunduk. MAAC olarak kültürlenmiş adipositlerin iki hafta boyunca canlı kaldıklarını, adipojenik gen izlerinin korunduğunu ve çeşitli farmakolojik agonizme yanıt verdiklerini gösterdik. MAAC kullanarak çapraz konuşma betweeen adipositler ve diğer hücre tipleri çalışma ve farklı uyaranlara yanıt olarak olgun adipositlerin uzun vadeli fenotibik değişikliklerin değerlendirilmesi için izin verir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclaved scissors
Autoclaved spoons
Autoclaved tweezers
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A6003
Buffer RLT	QIAGEN	79216	Lysis buffer
CaCl2*2H2O	Sigma-Aldrich	C7902
Conical tubes, 50 mL
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
DMEM/F-12	Gibco	31331-028
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10270-106
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm	Thermo Scientific	156-4020	500 mL
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm	Thermo Scientific	158-0020	1000 mL
HBSS+CaCl2+MgCl2	Gibco	14065-49
HEPES buffer solution (1M)	Gibco	15630-056
High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit	Applied Biosystems	4368814
Insulin (Actrapid Penfill)	Novo Nordisk A/S
KCl	Merck	104936
KH2PO4	Merck	104873
Medium 199	Gibco	10012-011
Mesh filter (250 µM)	Sintab AB	6111-025043
MgSO4*7H2O	Sigma-Aldrich	M1880
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Needles, 18 G, 1.20 mm x 40 mm	Sterican	613-2948
Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep)	Gibco	15140
Petri dishes, 150 mm x 21 mm	Thermo Scientific	168381
Power SYBR Green PCR master mix	Applied Biosystems	4367659
Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine	Applied Biosystems
RNeasy Mini kits	QIAGEN	74106
Separation funnel	VWR	527-0008	For large scale preparation
Separation funnel	VWR	527-0005	For small scale preparation
Shaking incubator (37 °C)
Syringes, 5 mL	Omnifix	612-2892	100 st
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2)
Transwells, 24-well (6.5 mm)	Costar	3397	Permeable membrane inserts
TRIzol reagent	Invitrogen	10296010	Lysis buffer
Type 2 Collagenase	Worthington	LS004177