Label-Free Empedans Tabanlı GPCR Denemelerinde Artırılmış İş İlerletme Protokolü

Özet

Bu protokol, etiketsiz empedans ölçümleri kullanılarak tek bir mikroelektrot üzerinde yetiştirilen tek bir hücre tabakasından agonist kaynaklı GPCR aktivasyonu için tam doz-yanıt ilişkilerinin gerçek zamanlı kaydını göstermektedir. Yeni dosing şeması, zaman çözümlü zaman kaybı olmadan iş buzunu önemli ölçüde artırır.

Özet

Etiketsiz empedans bazlı tahliller, hücre kültürü deneylerinde ligand kaynaklı GPCR aktivasyonunu invaziv olmayan olarak incelemek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu yaklaşım, aygıta bağlı zaman çözünürlüğü yle gerçek zamanlı hücre izleme sağlar ve bu durum çok yüksek derecede otomatiktir. Ancak, örnek sayıları nidik aldığında (örneğin, çeşitli ligandlar için doz-yanıt çalışmaları), tek kullanımlık elektrot dizilerinin maliyeti ve sıralı iyi kuyu kayıtları için kullanılabilir zaman çözünürlüğü sınırlayıcı hale gelebilir. Bu nedenle, burada önemli ölçüde etiket içermeyen GPCR tahlilçıktısını artırmak için potansiyele sahip bir seri agonist ek protokolü sıyoruz. Seri agonist ekleme protokolü kullanılarak, bir GPCR agonist sürekli örnek empedans (agonist modu) izlerken tek bir hücre katmanına artan konsantrasyonları artarda eklenir. Bu seri yaklaşım ile, artık sadece tek bir hücre tabakasından bir GPCR agonist için tam doz-yanıt eğrisi kurmak mümkündür. Seri agonist ekleme protokolü farklı GPCR kaplin tipleri, G_q G_i/0 veya G_s için geçerlidir ve çalışma altındaki reseptörün rekombinant ve endojen ekspresyon düzeyleri ile uyumludur. GPCR antagonistleri tarafından reseptör blokesi de değerlendirilebilir (antagonist mod).

Giriş

Bu rapor, bağlı olarak yetiştirilen hücrelerde ligand kaynaklı G protein-çiftreseptör (GPCR) aktivasyonunun etiketsiz empedans ölçümleri ile ölçülmesi için geliştirilmiş seri ek protokolünün ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır. G protein-coupled reseptörleri (PcF) fizyolojik fonksiyonlar ve insan hastalıkları¹çok sayıda yer almaktadır. Bu ve hücre yüzeyinde ki iyi erişilebilirlik nedeniyle, GPCR en önemli uyuşturucu hedeflerinden biridir. Bu değerlendirme, tüm pazarlanan ilaçlar²~% 35 paya eşdeğer, GPCR hedefleyen ~ 700 onaylı ilaçların tahmini sayısı yansıtılır.

Yeni ilaçların geliştirilmesi iki merkezi süreçten oluşur: (i) biyolojik hedef moleküllerin tanımlanması ve fonksiyonel karakterizasyonu ve (ii) yeni kurşun maddelerin keşfi ve bunların yönetilebilir ilaçlara dönüştürülmesi. Her iki süreçte de, ilaç hedef etkileşimlerini ve sonraki biyolojik aşağı tepkiyi nicel olarak değerlendirmek için etkin yöntemler gereklidir. Klinik öncesi ilaç geliştirme sürecinin farklı aşamalarında, ilaç ve hedef arasındaki biyomoleküler etkileşim çalışmalarından kültürdeki hücreler üzerinde yapılan fonksiyonel çalışmalara, eksise organ materyali veya bütün hayvanlar üzerinde deneylere kadar farklı analiz yöntemlerini kullanmaktadır. Her ikisi de, fizyolojik önemi ve biyolojik karmaşıklığı eski den ikinci³artış . Hayvan deneylerini en aza indirmek genel hedef olsa da, laboratuvar hayvanlarından ve hatta bütün hayvanlardan izole edilmiş organları kullanan farmakolojik çalışmalar, yeni ilaç adaylarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için kaçınılmaz kabul edilmektedir. Analitik okuma açısından, organ farmakolojisi çalışmaları en yüksek fizyolojik alaka distal, bütünleştirici "bütünleştirici" fonksiyonel yanıt sağlar. Bu tür deneylerin bir dezavantajı, teknik yanı sıra etik nedenlerle yüksek iş elde tarama ile uyumlu değildir ve büyük ölçüde in vitro hücre kültürü⁴dayalı çalışmalar ile ikame edilmiştir.

Hücre kültürlerinde GPCR aktivasyonunu ölçmek için kullanılan yöntemler arasında, özellikle ikinci habercileri tespit eden farklı etiket tabanlı kimyasal tahliller, aşağı akım sinyal proteinlerinin fosforilasyon durumu, belirli transkripsiyon faktörleri veya ligand kaynaklı hücre içi reseptör ticareti ile transkripsiyonel aktivasyon^4,5sayılabilir. Bu tür etiket tabanlı tahlillerin bir dezavantajı, hücreleri zararlı boyalar veya radyoaktif belirteçlerle etiketleme zorunluluğudur. Bu genellikle bir prioribelirtilmesi gereken bir pozlama süresi için bir bitiş noktası belirleme olarak tayini çalıştırmayı gerektirir. Etiket tabanlı uç nokta testlerinin kullanılması, deneyin bu çok sınırlı ve önyargılı zamanlamasından ve kimyasal etiketlerin ve probların normal hücre fizyolojisini etkileyebilecek riskten muzdaripdir – deneyci tarafından fark edilmeden.

Son yıllarda, GPCR aktivasyon izlemek için etiketsiz tahliller ortaya çıkmıştır, empedans tabanlı teknikler veya rezonans dalga kılavuzu ızgaraları uygulayan optik yöntemler gibi^5,6. Bu yaklaşımlarla hücrelerin etiketlenmesi deneysel olarak gerekli değildir. Bu fiziksel okumalar düşük genlikli sinyaller üzerinde çalıştığından, bu tür yöntemler invaziv olmayan olarak kabul edilir, onlar potansiyel olarak gerçek zamanlı olarak sürekli hücre izleme için izin ve gözlem süresi sadece hücre kültürü ile sınırlıdır okuma ile değil. Tüm organlardan gelen okumalara benzer şekilde, etiketsiz yaklaşımlar genellikle bütünsel hücre yanıtları hakkında rapor, tüm sinyal ağı boyunca entegrasyon zamana bağlı ama hücre morfolojisi veya kitle yeniden dağıtımında zamana bağlı olmayan değişikliklere yol açtığında reseptör aktivasyonunun çok aşağısında. Empedans tabanlı tahliller hücre şekli⁷,⁸, rezonans dalga kılavuzu ızgaraları kullanarak ölçümler istatiksel imza ölçmek ise dinamik kütle yeniden dağılımı (DMR)⁹kaynaklanan hücre-substrat arabiriminde kırılma indisi değişikliklere duyarlıdır . İntegratif karakter, G proteininin (G_q, G_i/0, G_s, G_12/13)veya β-arrestin in sinyalizasyon basamak⁶ dahil ve reseptörün endojen ekspresyon düzeyleri için uygun ne olursa olsun reseptör aracılı olaylara son derece duyarlı etiketsiz yöntemler yapar.

Standart etiketsiz empedans tabanlı bir teşbimizde hücreler, her kuyunun^10'ununaltına biriken koplanar altın film elektrotlarla çok kuyulu plakalarda yapışkan bir şekilde yetiştirilir. Bu elektrot dizileri bir empedans analizörüne bağlanır ve deneysel bir uyarıcıya hücre tepkileri zaman çözümlü empedans okumaları ile bireysel kuyulardan kaydedilir. Tipik bir GPCR tsay bir ligand her bir eye ayrı ayrı farklı konsantrasyonlarda iyi eklenir. Empedans zaman dilimindeki ligand indüklenen değişiklikler daha sonra maksimum sinyal değişimi, eğrinin altındaki alan, belirli bir zaman aralığında ki sinyal değişimi veya eğrinin eğimi gibi karakteristik eğri özelliklerine göre analiz edilir, ligand'ın gücünü ve etkinliğini ölçmek için¹¹.

Elektrot dizilerinin maliyeti, bu tekniğin yüksek iş yapma tarama (HTS) kampanyalarında uygulanmasını sınırlayabilir. Dahası, paralel olarak takip edilecek örnek sayısının artmasıyla, bireysel ölçümlerin sayısı artar ve böylece her bir kuyu için kullanılabilir zaman çözünürlüğünü kademeli olarak azaltır - en son teknoloji deki çok kanallı kayıtlar için bile. Bu koşullar altında hızlı ve geçici hücre yanıtları ölçümden kaçabilir. Buna ek olarak, konvansiyonel bir iyi - bir konsantrasyon yaklaşımı ligand-GPCR etkileşim analizi onların uygunluk açısından perfüzyon organ-on-chip veya vücut-on-chip gelişmeler önemli bir zaman ve maliyet faktörü empoze.

Bu nedenle, agonist konsantrasyonu kademeli olarak artarken tek bir kuyunun empedansını sürekli izleyerek, kültürlü hücre monokatmanlarında ligand kaynaklı GPCR aktivasyonunun tam doz-yanıt eğrilerinin kaydedilmesini sağlayan adım sallayan bir protokol geliştirdik. Seri agonist ekleme protokolü, histamin 1 reseptörünü (H1R) endojen bir şekilde ifade eden insan U-373 MG hücrelerinin mevcut örneğinde gösterildiği gibi, bir konsantrasyondan 10 veya daha fazla konsantrasyona kadar kuyu başına verimin önemli ölçüde arttırıldığı gibi. Böylece, yöntem önemli ölçüde etiketsiz doz-yanıt çalışmalarda iş bilgililik geliştirmek için potansiyele sahiptir, zaman çözünürlüğü enstrümantal maksimum korunur iken.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Elektrot dizileri üzerinde hücre tohumlama

NOT: Elektrot düzeninin seçimi, hassaslık ve çalışıldaki hücre sayısı arasında bir dengedir. Elektrot ne kadar küçükse, ölçüm o kadar hassastır, ancak çalışıldaki hücre sayısı da o kadar küçüktür. Temel koşullar altında zaman içinde güçlü empedans dalgalanmaları gösteren hücreler için, daha büyük veya interdigitated elektrotlar tercih edilir.

1. 37 °C'lik bir su banyosunda standart hücre geçişi ve tohumlama için gerekli tüm çözeltiler önceden ısıtın. İnsan U-373 MG hücreleri ile tahliller için alır: kalsiyum ve magnezyum olmadan fosfat tamponlu salin (PBS), %0.05 (w/v) tripsin, hücre kültürü ortamı (Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) %5 (v/v) fetal baldır serumu (FCS), 2 mM L-glutamin ve 100 μg/mL penisilin/streptomisin ile desteklenmiştir.
2. Geleneksel hücre kültürü şişelerinin veya PBS'li tabakların altında yetişen stok kültürünün hücre tabakasını iki kez durulayın.
3. PBS'yi çıkarın, tripsin çözeltisini ekleyin (25 cm²için 1 mL) ve hücrelerin 37 °C'de 5 dk (U-373 MG hücreleri için geçerlidir) kuluçkaya yatmasına izin verin.
4. Mikroskop ile büyüme substrat altından hücrelerin tam ayrılması için kontrol.
5. Hücreler tamamen ayrılır ayrılmaz trypsin reaksiyonu durdurun hücre süspansiyonuna 1 mL'lik trypsin başına 9 mL hücre kültürü ortamı ekleyin. Kalan hücreleri hücre kültürünün alt tabakasının altından süspansiyonu substrat üzerine borulayarak dikkatlice durulayın.
6. Bir pipet ile hücre süspansiyon toplamak ve bir santrifüj tüpü (15 mL veya 50 mL tüp) aktarın.
7. Oda sıcaklığında 10 dk için 110 x g santrifüj ile hücreleri aşağı spin.
8. Hücreleri saymadan önce (örneğin faz kontrastmikroskopları ve manuel sayma için bir hemacytometre kullanarak) süpernatant'ı dikkatlice çıkarın ve kültür ortamındaki hücre peletini iyice askıya alın.
9. Hücre süspansiyonuna istenilen hücre yoğunluğuna ayarlayın. U-373 MG hücreleri ile deneyler için, 48 saat içinde bir eşzamanlı hücre tabakası büyümek için 100 000 hücre/ cm² kullanın. Bu~ 0.8 cm² büyüme alanı ve 400 μL bir kuyu hacmi ile 8-iyi elektrot dizileri için 200 000 hücre / mL hücre yoğunluğu anlamına gelir.
   NOT: Tekrarlanabilir GPCR aktivasyon deneyleri için hücreler elektrot dizileri üzerinde enfluent monolayers yetiştirilmelidir. Hücre yüzeyinde uygun reseptör ekspresyonu sağlamak için, hücreler deneyi gerçekleştirmeden önce en az 36 saat tohumlanmalıdır. Hücre tohumlama için farklı hücre yoğunluklarını test etmek genellikle en iyi deneysel koşulları belirlemek için anlamlıdır.
10. Hücre süspansiyonu elektrot dizisinin kuyularına ekleyin ve kuyuların altındaki hücrelerin homojen dağılımını sağlamak için 10 - 15 dk oda sıcaklığında satAmasına izin verin.
11. Standart hücre kültürü kuvözlerinde 37 °C'de %5 CO₂ (orta tipe bağlı) ve nemli atmosferde en az 36 saat hücre yetiştirin. Hücre kültürünü denemeden önce 24 saat önce değiştirin.
12. Deney günü, elektrot dizileri üzerindeki hücre katmanlarını (faz kontrastı) mikroskobu yla inceleyerek elektrotların hücrelerle tam kapsama alanını sağlayın.

2. Serumsuz ortamda hücrelerin denkliği

1. Pre-sıcak serum içermeyen orta, Bu çalışmada: Leibovitz's L15 orta.
2. Elektrot dizileri üzerinde yetişen hücrelerden hücre kültürü ortamını çıkarın ve önceden ısıtılmış serumsuz ortamla değiştirin. 8-iyi formatlı elektrot dizileri için 200 μL ve 96 kuyulu elektrot dizileri için 150 l kullanın.
3. Hücreler serumsuz ortamda 37 °C'de en az 2 saat eve gelsin. Denge süresi güçlü hücre türüne bağlıdır. Örneğin, U-373 MG hücreleri 2 saat, CHO hücreleri 4 saat, BAEC L-15 ortamda geceleme equilibration gerektirebilir gerekir.
   NOT: L-15 orta CO₂ bağımsız ve CO₂-serbest bir atmosfer gerektirir. L-15'te denge için kuvöz % 0 CO₂olarak ayarlayın. Denge empedans okumaları ile izlenebilir, ilk deneyler için yapmanızı öneririz.

3. Empedans okumaları ile hücre dengesinin izlenmesi

1. Elektrot dizisini empedans analizörün bağlantı dizisi tutucuya yerleştirin.
2. Elektrotlar ve empedans analizörü arasında uygun düşük empedans temasını sağlayın. Bu kontrol farklı enstrümanlar için ayrı ayrı farklıdır.
   NOT: Cihaz elektrotlara bağlantı kuramazsa, kontak kıskacını tekrar açın, tutucunun içinde doğru konumlandırma için elektrot dizisini yeniden düzene sokun ve yeniden deneyin.
3. Yazılımın kullanıcı arabiriminden elektrot türünü ve/veya çok iyi biçimini seçin.
4. Ölçüm parametrelerini ayarlayın. Farklı seçenekler mevcuttur.
   NOT: En hassas AC frekansını seçmek için, çalışma aşamasındaki elektrot düzenine ve hücre tipine bağlı olarak literatür ve enstrüman kılavuzlarına başvururuz. Genellikle algılama frekansı 4 kHz – 50 kHz aralığındadır. Burada U-373 MG hücreleri 250 m çapında dairesel çalışan elektrotlar üzerinde yetiştirildi ve 12 kHz'lik AC frekansında izlendi.
   1. Tek ve birden çok frekanslı veri toplama modları varsa, maksimum zaman çözünürlüğü sağlamak için tek frekans modunu seçin. Ölçüm bu tek frekansta yapılacaktır. En yaygın olarak yayılan araçlar için, kullanılabilir frekans penceresi boyunca önceden ayarlanmış frekanslar vardır.
   2. İncelenen kuyu sayısı düşükse veya zaman çözünürlüğü kritik değilse, bunun yerine birden çok frekans kaydı seçin. Daha sonra derinlemesine analiz için her kuyu için belirli sayıda frekansta empedans okumaları kaydedilecektir.
      NOT: Kuyu başına kaydedilen frekans sayısının artması ve kuyu sayısının artmasıyla zaman çözünürlüğü azalır. Sıklık ve veri toplama modu seçimi seçenekleri enstrüman türüne ve sürümüne göre değişir.
5. Zaman ders verilerinin edinimi başlatın.
6. Empedans stabilize olana kadar hücre tabakası empedansını (en az 2 saat) takip edin. Bu arada agonist çözümleri hazırlayın.
7. Hücre katmanları kararlı bir empedans düzeyine ulaştığında, (i) aynı deneydeki seri agonist eklemeye devam edin veya (ii) veri toplamayı sonlandırın ve agonist kaynaklı reseptör aktivasyonunu izlemek için yeni bir veri kümesi başlatın.

4. Agonist modda deneyler için agonist çözeltilerin hazırlanması

1. (1) denklemine göre seri dosingin her adımı için gerektiği gibi agonist çözeltilerin konsantrasyonu hesaplayın. n, 1'den seri eklemelerin toplam sayısına kadar değişmektedir i. x, n. y adımdaki kuyudaki konsantrasyon ve hacim, adım n'deki "eklenecek çözeltinin" konsantrasyonu ve hacmini gösterir.

NOT: Çoğaltma sayısını göz önünde bulundurun ve her konsantrasyon adımı için "eklenecek çözüm" toplam hacmini hesaplayın. Tipik bir hesaplamanın sonuçları Tablo 1-4'teverilmiştir. Seri ekleme sırasında uygulanacak porsiyon konsantrasyonlarını ve sayısını tanımladığı için, agonist konsantrasyon aralığı hakkında genel bir fikir gerekir. Seri agonist ekleme protokolü kullanılarak agonist konsantrasyonu adım adım artar. Bu nedenle, bir sonraki doz eklendiğinde kuyuda zaten agonist miktarı dikkate alınmalıdır. Kuyuda zaten mevcut olan agonist moleküllerin sayısı n_x = c_x (akım konsantrasyonu c_x ve hacim V_x)ve bir sonraki ilaveden sonra kuyudaki molekül sayısı n_x+yolduğunda, n_y eklenecek molekül sayısı, çözeltinin c_y ve hacim V_y konsantrasyonu ile belirlenir (n_y = c_y » V_y). Agonistin bir kısmını ekledikten sonra, kuyudaki agonist moleküllerin yeni miktarı: c_x+y • V_x+y = c_x • V x + c y • V_x + c_y • V_y. Bu hesaplama sonraki her adım için geçerlidir. Kuyudaki agonist konsantrasyonun karşılıklı bağımlılığı ve her adımda eklenecek porsiyonlarda agonist miktarı nedeniyle, her adımdan sonra nihai konsantrasyonları önceden tanımlamak önemlidir.

Mod 1: Sıvı sürekli olarak eklendikçe kuyudaki hacim her adımda artacaktır.
Bu modu ve 8-iyi formatı kullanarak V_x1 = 200 μL ve V_{y1 ....} V_yi = 30 μL kullanın.

Mod 2: Her adımla eklenen hacim sonraki eklemeden hemen önce kaldırıldığından, kuyudaki hacim sabittir.
Bu modu ve 96-iyi formatı kullanarak V_x1 = 150 μL ve V_{y1 ....} V_yi = 75 μL kullanın.

2. Veri sayfasını konsantrasyon başına toplam hacim ve pipetleme için ayrıntılı talimatlar içeren yazdırın.
3. Tüm çözümleri istenilen miktarda hazırlayın. Hücrelerin dengeiçin kullanılan aynı serum içermeyen ortamda tüm agonist çözümler olun.
   DİkKAT: Histamin dihidroklorür 2012 OSHA Tehlike İletişim Standardı (29 CFR 1910.1200) tarafından tehlikeli kabul edilir. Histamin cilt tahrişine, ciddi göz tahrişine neden olur, alerjik bir cilt reaksiyonuna, alerjiye, astım semptomlarına veya solunduğunda solunum güçlüğüne neden olabilir ve solunum tahrişine neden olabilir. Lütfen güvenlik veri sayfasını göz önünde bulundurun.
   NOT: Agonist çözümleri mümkün olduğunca taze yapın. Çözümde agonistlerin kararlılığı önemli ölçüde değişebilir. Deneyde kullanıma kadar çözümleri 4 °C veya altında saklayın. Bazı moleküller için ek stabilizasyon katkı maddeleri, Peptit bazlı veya lipid bazlı moleküller kullanırken BSA gibi, kuyu ve tüplerin duvarlarına adsorpsiyon önlemek için düşünülebilir.
4. Deneyi 96 iyi formatta gerçekleştirecekseniz, çözümleri geleneksel 96 kuyulu bir plakaya (elektrot yok) aktarın ve elektrot dizisine hızlı sıvı transferi için 8(veya 12-) kanallı pipet kullanın.

5. Antagonist modda deney için agonist çözümlerin hazırlanması

NOT: Antagonist çözeltiyi(ler) boyunca uygulanacak konsantrasyonla hazırlayın. Antagonist çözeltinin hacmi ve konsantrasyonu agonist ekleme nin moduna bağlıdır (1 veya 2). Ek mod 2'de 8 kuyulu veya 96 iyi formattaki deneylere örnekler: (A) 8-iyi format (V_x1 = 200 μL, V_Antagonist = 200 μL); (B) 96-iyi format (V_x1 = 150 μL, V_Antagonist = 75 μL).

1. 4.1 adımda açıklandığı gibi seri dosingin her adımı için gereken her agonist çözeltinin konsantrasyonunun hesaplanacağını hesaplayın.
2. Hücrelerin dengede kullanılan aynı serum içermeyen ortamda tüm agonist çözümleri yapın ve antagonisti deneydeki ilgili kuyular için planlandığı gibi aynı son konsantrasyonda ekleyin.
   NOT: Bu durumda histamin stok çözeltisi (10 mM) L-15 ortamda hazırlanır. Agonistler diğer çözücülerde (örneğin, dimetil sülfoxid (DMSO) çözündüğünde, her bir ilave adımda artan çözücü yükünü hesaba katmak için bir çözücü kontrolü eklenmelidir.

6. Seri ekleme protokolünü agonist modda gerçekleştirmek

1. 3.1 - 3.5 adımlarında açıklandığı gibi veri toplamayı başlatın.
2. Eklemeden önce yaklaşık 10 -15 dk kala kuvöze yerleştirerek agonist çözümleri kullanmadan önce ısıtın.
   NOT: Termo-labile maddeler kullanılırken çözeltiler 37 °C'de çok uzun süre tutulmamalıdır. 10 - 15 dk için ön ısınma kritik kabul edilirse, bir su banyosuna ilave edilmeden kısa bir süre önce 37 °C'ye çözeltiler getirin.
3. Seçili ekleme moduna bağlı olarak agonist seri dosing çalıştırın. Aşağıdaki mod 1 kuyudaki toplam hacim bir sonraki dozun her eklenmesiyle artar. Mod2'de her adımla eklenen aynı hacim de bir sonraki yüksek dozu eklemeden hemen önce tekrar kaldırılır.
   NOT: Hücre tabakasının sonraki iki agonist dozda dengelemi için gereken süre, hücrelerin yanıt süresine bağlıdır. Paralel modda yapılan bir ilk deney (bir kuyu – bir konsantrasyon) (i) hücre yanıt sürelerini farklı agonist konsantrasyonlar için ve (ii) en hassas eğri parametresini (örn. empedans maksimum, zaman x'ten sonra empedans) ortaya çıkarır.

C: Mod 1 / 8-iyi biçim

1. Serumsuz ortamda 200 μL'lik bir ortamda dengelendirilen hücrelere en düşük agonist konsantrasyonuna sahip ilk çözeltinin 30 μL'sini ekleyin.
2. Hücrelerin yanıt vermesine ve önceden tanımlanmış bir süre için dengede durmasına izin verin (örn. 15 dk).
3. Bir sonraki yüksek konsantrasyonla ikinci çözeltinin 30 000'ini ekleyin.
4. Üçüncü, dördüncü ve benzeri agonist çözümle 6.3.1-6.3.3 adımlarını tekrarlayın.
   NOT: 10 konsantrasyon adımı ile çalışmak, deney sonunda toplam 500 μL hacim sağlayacaktır, bu da ~ 550 μL'lik bu kuyuların maksimum geçerli hacminin hemen altındadır.

B: Mod 2 / 96-iyi format

NOT: 96-iyi formatta denemeler çalıştırırken empedans aletinin yazılımı aracılığıyla her sıvı işleme adımında veri toplamayı duraklatın (ekleme/kaldırma). Daha ayrıntılı sıvı işleme veri toplama engelleyebilir. Çok kanallı pipet kullanın.

1. Veri toplamayı duraklatın.
2. Serumsuz ortamda 150 μL'lik bir ortamda dengelendirilen hücrelere en düşük agonist konsantrasyonuna sahip ilk çözeltinin 75 μL'sini ekleyin.
3. Veri toplamayı devam ettirin.
4. Hücrelerin yanıt vermesine ve önceden tanımlanmış bir süre için dengede durmasına izin verin (örn. 15 dk).
5. Normal denge süresi nin sona ermeden yaklaşık 1 – 2 dakika önce, ölçümü duraklatın ve her kuyudan 75°L çıkarın.
   NOT: Çözeltinin çıkarılması gereken zaman noktası paralel olarak izlenen kuyu sayısına ve borulama hızına bağlıdır. Çözümlerin kaldırılması için gereken süre sonraki adımlar arasındaki süreyi aşmamalıdır.
6. Bir sonraki yüksek konsantrasyonla ikinci çözeltinin 75 0L'sini ekleyin ve ölçüme devam edin.
7. Üçüncü, dördüncü ve benzeri agonist çözümle 6.3.8-6.3.10 adımlarını tekrarlayın.

7. Antagonest modda seri ekleme protokolünün gerçekleştirilmesi

1. 3.1 - 3.5 adımlarında açıklandığı gibi ölçümü başlatın.
2. Hücre tabakalarının dengelenirken, antagonist çözelti (örneğin, 200 μL 1.5 μM difenhidramin hidroklorür L15 ortamda) hazırlayın.
   DİkKAT: Difenhidramin hidroklorür potansiyel akut sağlık etkileri vardır. Yutulması veya solunması zararlıdır, göz ve cilt tahrişine neden olabilir. Solunum ve sindirim sistemi tahrişine neden olabilir. Lütfen güvenlik veri sayfasını göz önünde bulundurun.
3. Hücre kültürleri (cf. 6.2) eklemeden önce yaklaşık 10 - 15 dakika kuvözde yerleştirerek antagonist ve agonist çözeltileri önceden ısıtın. Antagonist içermeyen kuyular da tahtta yer alıyorsa, önceden ısınan serumsuz ortam da.
4. Belirlenen kuyulara antagonist çözümü ekleyin. Hücreler 15 - 20 dakika boyunca antagonist ile dengeleyelim. Antagonist içermeyen kuyular da dahil sayılsa, bu kuyulara aynı miktarda serumsuz ortam ekleyin.
5. Mod 2'dekiantagonist eklemeye göre, kuyulardan çözelti kaldırın
   (A) 8 kuyu formatı (200 μL)
   (B) 96-iyi format (75 μL)
6. Adım 6.3'te açıklandığı gibi agonist ekleme sırasını çalıştırın.

8. Veri ihracatı ve analizi

1. Empedans aracının yazılımını kullanarak, kayıtlı tüm verileri ortak veri biçimlerine (örn. csv) dönüştürmek için veri aktarın. Bu adım, diğer yazılım paketleriyle verilerin yeniden düzenlenmesine ve sunulmasına olanak tanır.
2. CSV biçimli verileri bilimsel veri analizi yazılımına yükleyin.
3. Agonist çözeltinin ilk eklenmesinden önce son veri noktasının empedansını çıkararak ve t = 0'a ekleme süresini ayarlayarak empedans değerlerini normalleştirin. Normalleştirilmiş empedanszaman rotasını çizin.
4. Her zaman derslerini çizin ve her ekleme adımından sonra empedansta maxima'yı tanımlayın. Bu değerlerle bir veri sayfası oluşturun.
5. Agonist konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak maksimum (veya varsa minimum) empedans değişikliklerinin değerlerini çizin. Bu bireysel kuyular veya ortalamalar (ortalama ± SD) için yapılabilir.
6. Dört parametreli lojistik modeli (denklem 2) kullanarak yarı maksimal etkin konsantrasyonları (EC₅₀₎ve maksimum yanıt (E_Max)belirlemek için veri uydurma yordamı kullanın:

NOT: c agonist konsantrasyonu gösterir, A₁ minimum ve A₂ sigmoidal doz-yanıt eğrisi maksimum asimptot olduğunu (A₂ = E_Max). EC₅₀ eğrinin dönüm noktasındaki konsantrasyondur ve n Tepe eğimine karşılık gelir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Çeşitli agonist çözümleri hazırlamak için tipik bir şema Tablolar 1-4agonist olarak histamin ile 8-iyi elektrot dizileri kullanarak bir deney için gösterilir. Tablo 1 ve Tablo 2, ek modu 1 (cf., Şekil 1)kullanılarak bir deney için mevcut hacimleri ve konsantrasyonları bulunurken, Tablo 3 ve Tablo 4 ek modu 2'yi izleyen bir deney için hacimleri ve konsantrasyon...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, aynı reseptör için özel antagonistlerin yokluğunda veya varlığında agonist indüklenen GPCR aktivasyonunun doz-yanıt ilişkisini belirlemek için etiketsiz empedans ölçümleri için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yöntemin kavramının kanıtı yeni bir yayında^{sunulmuştur 12}. Bilgimiz için in vitro tek bir hücre tabakası kullanarak agonist aracılı GPCR aktivasyonu tam doz-yanıt eğrisi kurulması açıklayan ilk çalışmadır. Bu yaklaşım kaçınılmaz olarak ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bürker counting chamber	Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany)	640210
cell culture flasks 25 cm2	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	690175
Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	\
Centrifuge (Heraeus 1S-R)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	\
Diphenhydramine hydrochloride	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	D3630
Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	D5671
Impedance Instrument (ECIS Zθ)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\
8-well electrode Arrays (8W1E PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)
96-well electrode arrays (96W1E+ PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom (Berlin, Germany)	S0615
Histamine dihydrochloride	Carl Roth (Karlsruhe, Germany)	4017.1
Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	51022515	class II safety cabinet
Leibovitz' L-15 medium	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	21083-027
L-glutamine	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	G7513
Micropipette large (100 - 1000 µL)	Brandt (Wertheim, Germany)	704780
Micropipette large (20 - 200 µL)	Brandt (Wertheim, Germany)	704778
Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)	Nikon (Düsseldorf, Germany)
Penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	P0781
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	D8537
Pipette, serological	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	607 180
Pipettor (accu-jet pro)	Brandt (Wertheim, Germany)	26300
Trypsin	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	T4174	in PBS with 1 mM EDTA
Tube, 15 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	188 271
Tube, 50 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	210 261
U-373 MG cells	ATCC (Rockville, MD, USA)	ATCC HTB-17
water bath (TW21)	Julabo (Seelbach, Germany)	\