Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impeddance-Based GPCR Assays

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt die Echtzeitaufzeichnung von volldosierten Reaktionsbeziehungen für die agonistisch-induzierte GPCR-Aktivierung von einer einzelnen Zellschicht, die auf einer einzelnen Mikroelektrode mit etikettenfreien Impedanzmessungen angebaut wird. Das neue Dosierschema erhöht den Durchsatz deutlich, ohne dass die Zeitauflösung verloren geht.

Zusammenfassung

Etikettenfreie Impedanz-basierte Assays werden zunehmend zur nicht-invasiven Untersuchung der ligaandinduzierten GPCR-Aktivierung in Zellkulturexperimenten eingesetzt. Der Ansatz bietet Echtzeit-Zellüberwachung mit einer geräteabhängigen Zeitauflösung bis zu mehreren Dutzend Millisekunden und ist hochautomatisiert. Wenn jedoch die Probenzahlen hoch werden (z. B. Dosis-Wirkungs-Studien für verschiedene Liganden), können die Kosten für die Einweg-Elektroden-Arrays sowie die verfügbare Zeitauflösung für sequenzielle Well-by-Well-Aufnahmen begrenzt werden. Daher stellen wir hier ein serielles Agonisten-Zusatzprotokoll vor, das das Potenzial hat, die Leistung von etikettenfreien GPCR-Assays deutlich zu erhöhen. Mit Hilfe des seriellen Agonisten-Additionsprotokolls wird ein GPCR-Agonist sequenziell bei der Erhöhung der Konzentrationen zu einer einzelnen Zellschicht hinzugefügt, während die Impedanz der Probe kontinuierlich überwacht wird (Agonistenmodus). Mit diesem seriellen Ansatz ist es nun möglich, eine vollständige Dosis-Wirkungs-Kurve für einen GPCR-Agonisten aus nur einer einzigen Zellschicht zu etablieren. Das serielle Agonisten-Zusatzprotokoll ist auf verschiedene GPCR-Kopplungstypen, G_q G_i/0 oder G_s, anwendbar und mit rekombinanten und endogene Expressionsniveaus des untersuchten Rezeptors kompatibel. Die Rezeptorblockierung durch GPCR-Antagonisten ist ebenfalls bewertbar (Antagonistenmodus).

Einleitung

Dieser Bericht enthält eine detaillierte Beschreibung eines seriellen Additionsprotokolls, das zur Quantifizierung der Liganden-induzierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoraktivierung (GPCR) in anhaftend angebauten Zellen durch etikettenfreie Impedanzmessungen entwickelt wurde. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind an einer Vielzahl physiologischer Funktionen und menschlicher Krankheiten beteiligt¹. Aufgrund dieser und ihrer guten Zugänglichkeit an der Zelloberfläche sind GPCRs eines der wichtigsten Wirkstoffziele. Diese Bewertung spiegelt sich in einer geschätzten Zahl von 700 zugelassenen Arzneimitteln wider, die auf DIE GPCR abzielen, was einem Anteil von 35 % an allen vermarkteten Arzneimitteln entspricht².

Die Entwicklung neuer Medikamente umfasst zwei zentrale Prozesse: (i) die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung biologischer Zielmoleküle und (ii) die Entdeckung neuer Bleisubstanzen und deren Entwicklung zu administrierbaren Arzneimitteln. In beiden Prozessen sind effiziente Methoden erforderlich, um Wirkstoff-Ziel-Wechselwirkungen und die anschließende biologische nachgeschaltete Reaktion quantitativ zu bewerten. Verschiedene Stadien des präklinischen Arzneimittelentwicklungsprozesses nutzen verschiedene Analysemethoden, die von biomolekularen Interaktionsstudien zwischen Medikament und Ziel, über funktionelle Studien an Zellen in der Kultur bis hin zu Experimenten an ausgeschnittenem Organmaterial oder ganzen Tieren reichen. Sowohl die physiologische Bedeutung als auch die biologische Komplexität nehmen von ersterer bis zu letzterer³zu. Obwohl es das übergeordnete Ziel ist, Tierversuche zu minimieren, werden pharmakologische Studien mit isolierten Organen von Labortieren oder sogar ganzen Tieren als unvermeidlich angesehen, um neue Wirkstoffkandidaten umfassend zu charakterisieren. In analytischer Auslesung bieten Organpharmakologiestudien eine distale, integrative "ganzheitliche" funktionelle Reaktion von höchster physiologischer Relevanz. Ein Nachteil solcher Experimente ist, dass sie aus technischen und ethischen Gründen nicht mit einem Hochdurchsatz-Screening kompatibel sind und weitgehend durch Studien auf der Grundlage der In-vitro-Zellkultur4 ersetzt wurden.

Methoden zur Quantifizierung der GPCR-Aktivierung in Zellkulturen umfassen verschiedene etikettenbasierte chemische Assays, die speziell zweite Botenstoffe, Phosphorylierungszustand von nachgeschalteten Signalproteinen, Transkriptionsaktivierung über bestimmte Transkriptionsfaktoren oder Liganden-induzierten intrazellulären Rezeptorenhandel^4,5. Ein Nachteil solcher etikettenbasierter Assays ist die Notwendigkeit, die Zellen mit potenziell schädlichen Farbstoffen oder radioaktiven Markern zu kennzeichnen. Dies erfordert häufig das Ausführen des Assays als Endpunktbestimmung für eine Expositionszeit, die a prioriangegeben werden muss. Die Verwendung von etikettenbasierten Endpunkt-Assays leidet unter diesem sehr begrenzten und voreingenommenen Timing des Experiments und dem Risiko, dass chemische Etiketten und Sonden die reguläre Zellphysiologie stören – möglicherweise unbemerkt vom Experimentator.

In den letzten Jahren sind etikettenfreie Assays zur Überwachung der GPCR-Aktivierung entstanden, wie Impedanz-basierte Techniken oder optische Methoden mit resonanten Wellenleitergittern^5,6. Die Kennzeichnung der Zellen ist bei diesen Ansätzen experimentell nicht erforderlich. Da diese physikalischen Auslesungen mit Signalen mit geringer Amplitude betrieben werden, gelten solche Methoden als nicht-invasiv, sie ermöglichen eine kontinuierliche Zellüberwachung potenziell in Echtzeit und die Beobachtungszeit wird nur durch die Zellkultur und nicht durch das Auslesen begrenzt. Ähnlich wie aus ganzen Organen berichten labelfreie Ansätze häufig über ganzheitliche Zellreaktionen, weit nach der Rezeptoraktivierung, wenn die Integration entlang des gesamten Signalnetzes zu zeitabhängigen, aber eher unspezifischen Veränderungen in der Zellmorphologie oder Massenumverteilung führt. Während impedanzbasierte Assays die dielektrische Signatur von Veränderungen in der Zellform^7,8messen, sind Messungen mit resonanzförmigen Wellenleitergittern empfindlich gegenüber Veränderungen des Brechungsindexes an der Zellsubstratschnittstelle, die sich aus der dynamischen Massenumverteilung (DMR)⁹ergeben. Der integrative Charakter macht etikettenfreie Methoden extrem empfindlich gegenüber Rezeptor-vermittelten Ereignissen, unabhängig von der Art(n) des G-Proteins (G_q, G_i/0, G_s, G_12/13) oder '-arrestin, die an der Signalkaskade⁶ beteiligt sind und sich gut für endogene Expressionsniveaus des Rezeptors eignen.

In einem standardlabelfreien Impedanz-basierten Assay werden die Zellen in Multi-Well-Platten mit koplanaren Goldfilmelektroden, die auf der Unterseite jedes Brunnens abgelagert^{sind, 10}anwachsen. Diese Elektroden-Arrays sind mit einem Impedanzanalysator verbunden und die Zellreaktionen auf einen experimentellen Reiz werden aus einzelnen Brunnen durch zeitaufgelöste Impedanzmessungen aufgezeichnet. In einem typischen GPCR-Test wird jedem einzelnen Brunnen ein Ligand in individuell unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt. Die Liganden-induzierten Veränderungen im Impedanz-Zeitverlauf werden dann in Bezug auf Merkmalskurvenmerkmale wie maximale Signaländerung, Fläche unter der Kurve, Signaländerung innerhalb eines bestimmten Zeitintervalls oder Steigung der Kurve zu einem bestimmten Zeitpunkt analysiert, um die Wirksamkeit und Wirksamkeit des Liganden zu quantifizieren¹¹.

Die Kosten für die Elektroden-Arrays können die Anwendung dieser Technik in HTS-Kampagnen (High Throughput Screening) einschränken. Darüber hinaus steigt die Anzahl der Einzelmessungen mit zunehmender Anzahl parallel zu befolgender Proben und reduziert damit die verfügbare Zeitauflösung für jeden Brunnen schrittweise - auch bei modernsten Mehrkanalaufnahmen. Unter solchen Bedingungen können schnelle und vorübergehende Zellreaktionen der Messung entgehen. Darüber hinaus setzt der konventionelle Brunnen – ein Konzentrationsansatz einen signifikanten Zeit- und Kostenfaktor für durchfundierte Organ-on-Chip- oder Body-on-Chip-Entwicklungen in Bezug auf ihre Eignung in der Liganden-GPCR-Interaktionsanalyse.

Aus diesem Grund haben wir ein stufenweises Dosierungsprotokoll entwickelt, das die Aufzeichnung von Volldosis-Wirkungskurven der Liganden-induzierten GPCR-Aktivierung in kultivierten Zellmonolayern ermöglicht, indem die Impedanz eines einzelnen Brunnens kontinuierlich überwacht wird, während die Agonistenkonzentration schrittweise erhöht wird. Das serielle Agonistenadditionsprotokoll erhöht den Durchsatz pro Brunnen signifikant von einer Konzentration auf 10 oder mehr Konzentrationen, wie am aktuellen Beispiel menschlicher U-373-MG-Zellen gezeigt wird, die den Histamin-1-Rezeptor (H1R) endogen ausdrücken. Somit hat die Methode das Potenzial, den Durchsatz in etikettenfreien Dosis-Wirkungs-Studien deutlich zu verbessern, während die Zeitauflösung am instrumentellen Maximum beibehalten wird.

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Protokoll

1. Zellaussaat auf Elektroden-Arrays

HINWEIS: Die Auswahl des Elektrodenlayouts ist ein Kompromiss zwischen Empfindlichkeit und Anzahl der untersuchten Zellen. Je kleiner die Elektrode, desto empfindlicher ist die Messung, aber je kleiner die Anzahl der untersuchten Zellen ist. Bei Zellen, die unter Basisbedingungen starke Impedanzschwankungen im Zeitverlauf aufweisen, sind größere oder interdigitierte Elektroden vorzuziehen.

1. Vorwärmung aller Lösungen für Standard-Zellpassaging und -saatierung in einem 37 °C-Wasserbad. Für Assays mit menschlichen U-373 MG-Zellen braucht es: Phosphat gepufferte Saline (PBS) ohne Calcium und Magnesium, 0,05% (w/v) Trypsin, Zellkulturmedium (Eagle es Minimum Essential Medium (EMEM) ergänzt mit 5% (v/v) fetalem Kalbsserum (FCS), 2 mM L-Glutamin und 100 g/mL Penicillin/Strepcin.
2. Spülen Sie die Zellschicht der Bestandskultur, die auf dem Boden herkömmlicher Zellkulturkolben oder Gerichte mit PBS zweimal angebaut wird.
3. Entfernen Sie die PBS, fügen Sie die Trypsin-Lösung (1 ml für 25 cm²) und lassen Sie die Zellen bei 37 °C für 5 min brüten (gilt für U-373 MG-Zellen).
4. Kontrolle zur vollständigen Ablösung der Zellen vom Boden des Wachstumssubstrats durch Mikroskopie.
5. Stoppen Sie die Trypsin-Reaktion, sobald die Zellen vollständig getrennt sind, indem sie der Zellsuspension 9 ml Zellkulturmedium pro 1 ml Trypsin hinzufügen. Spülen Sie die verbleibenden Zellen vorsichtig vom Boden des Zellkultursubstrats ab, indem Sie die Suspension über das Substrat pfeifen.
6. Sammeln Sie die Zellsuspension mit einer Pipette und übertragen Sie sie in ein Zentrifugationsrohr (15 ml oder 50 ml Rohr).
7. Drehen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 110 x g für 10 min bei Raumtemperatur nach unten.
8. Entfernen Sie den Überstand sorgfältig und setzen Sie das Zellpellet im Kulturmedium gründlich wieder auf, bevor Sie die Zellen zählen (z. B. durch Verwendung eines Hemacytometers für Phasenkontrastmikroskope und manuelles Zählen).
9. Passen Sie die Zellsuspension an die gewünschte Zelldichte an. Für Experimente mit U-373 MG-Zellen verwenden Sie 100 000 Zellen/cm^2, um eine konfluente Zellschicht innerhalb von 48 h zu züchten. Dies entspricht einer Zelldichte von 200 000 Zellen/ml für 8-Well-Elektroden-Arrays mit einer Wachstumsfläche von 0,8^cm2 und einem Wellvolumen von 400 l.
   HINWEIS: Für reproduzierbare GPCR-Aktivierungsexperimente sollten Zellen zu konfluenten Monolayern auf den Elektrodenarrays angebaut werden. Um eine korrekte Rezeptorexpression auf der Zelloberfläche zu gewährleisten, sollten Zellen vor dem Experiment mindestens 36 h gesät werden. Das Testen unterschiedlicher Zelldichten für die Zellaussaat ist oft sinnvoll, um die besten experimentellen Bedingungen zu identifizieren.
10. Fügen Sie die Zellsuspension in die Brunnen des Elektroden-Arrays und lassen Sie die Verkäufe bei Raumtemperatur für 10 – 15 min absetzen, um eine homogene Verteilung der Zellen auf dem Boden der Brunnen zu gewährleisten.
11. Wachsen Sie Zellen für mindestens 36 h in einem Standard-Zellkultur-Inkubator mit 5%_CO2 (abhängig vom mittleren Typ) bei 37 °C und befeuchteter Atmosphäre. Ändern Sie das Zellkulturmedium 24 h vor dem Experiment.
12. Am Tag des Experiments werden die Zellschichten auf den Elektrodenarrays durch (Phasenkontrast-)Mikroskopie untersucht, um eine vollständige Abdeckung von Elektroden mit Zellen zu gewährleisten.

2. Gleichgewichtierung von Zellen in serumfreiem Medium

1. Vorwarmes serumfreies Medium, in dieser Studie: Leibovitz es L15 medium.
2. Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus Zellen, die auf Elektrodenarrays angebaut werden, und ersetzen Sie sie durch vorgewärmtes serumfreies Medium. Verwenden Sie 200 l für Elektroden-Arrays im 8-Well-Format und 150 l für 96-Well-Elektroden-Arrays.
3. Lassen Sie die Zellen in serumfreiem Medium bei 37 °C für mindestens 2 h ausdemieren. Die Ausgleichszeit hängt stark vom Zelltyp ab. Zum Beispiel benötigen U-373 MG-Zellen 2 h, CHO-Zellen 4 h, BAEC kann eine Übernacht-Äquilibration in L-15 Medium erfordern.
   HINWEIS: L-15 Medium ist_{CO2-unabhängig} und erfordert eine_CO2-freieAtmosphäre. Für den Ausgleich in L-15 stellen Sie den Inkubator auf 0 %_CO2. Die Gleichgewichtszeit kann durch Impedanzmessungen überwacht werden, was wir für die ersten Experimente empfehlen.

3. Überwachung der Zelläquilibration mit Impedanzwerten

1. Legen Sie das Elektrodenarray in den Anschluss-Array-Halter des Impedanzanalysators.
2. Stellen Sie einen korrekten Kontakt mit niedriger Impedanz zwischen Elektroden und Impedanzanalysator sicher. Diese Prüfung unterscheidet sich individuell für verschiedene Instrumente.
   HINWEIS: Wenn das Gerät keine Verbindung zu den Elektroden herstellt, öffnen Sie die Kontaktklemme erneut, stellen Sie das Elektrodenarray für die richtige Positionierung im Halter wieder ein und wiederholen Sie es erneut.
3. Wählen Sie Elektrodentyp und/oder Multi-Well-Format aus der Benutzeroberfläche der Software.
4. Richten Sie die Messparameter ein. Es stehen verschiedene Optionen zur Verfügung.
   HINWEIS: Um die empfindlichste Wechselfrequenz auszuwählen, beziehen wir uns auf die Literatur und die Instrumentenhandbücher, da dies vom Elektrodenlayout und dem zu untersuchenden Zelltyp abhängt. Typischerweise liegt die Erfassungsfrequenz im Bereich von 4 kHz – 50 kHz. Hier wurden U-373 MG-Zellen auf kreisförmigen Arbeitselektroden mit einem Durchmesser von 250 m angebaut und mit einer Wechselfrequenz von 12 kHz überwacht.
   1. Wenn Einzel- und Mehrfachfrequenzdatenerfassungsmodi verfügbar sind, wählen Sie den Einzelfrequenzmodus aus, um eine maximale Zeitauflösung zu gewährleisten. Die Messung wird mit dieser einzigen Frequenz durchgeführt. Für die am weitesten verbreiteten Instrumente gibt es eine Reihe von voreingestellten Frequenzen entlang des verfügbaren Frequenzfensters.
   2. Wenn die Anzahl der untersuchten Brunnen gering ist oder die Zeitauflösung nicht entscheidend ist, wählen Sie stattdessen mehrere Frequenzaufzeichnungen aus. Impedanzmessungen an einer bestimmten Anzahl von Frequenzen werden für jeden Brunnen für eine spätere eingehende Analyse aufgezeichnet.
      HINWEIS: Die Zeitauflösung nimmt mit zunehmender Anzahl von Frequenzen, die pro Brunnen aufgezeichnet werden, und zunehmender Anzahl von Brunnen ab. Die Optionen für die Auswahl der Frequenz- und Datenerfassungsmodus variieren je nach Gerätetyp und -version.
5. Beginnen Sie mit der Erfassung von Zeitkursdaten.
6. Folgen Sie der Zellschichtimpedanz (mindestens 2 h), bis sich die Impedanz stabilisiert hat. In der Zwischenzeit bereiten Sie die agonistischen Lösungen vor.
7. Wenn die Zellschichten ein stabiles Impedanzniveau erreicht haben, gehen Sie entweder (i) mit der seriellen Agonistenaddition innerhalb desselben Experiments fort oder (ii) die Datenerfassung beenden und einen neuen Datensatz zur Überwachung der agonistisch-induzierten Rezeptoraktivierung starten.

4. Vorbereitung von agonistischen Lösungen für Experimente im Agonistenmodus

1. Berechnen Sie die Konzentration von agonistischen Lösungen nach Bedarf für jeden Schritt der seriellen Dosierung nach Gleichung (1). n reicht von 1 bis zur Gesamtzahl der seriellen Zusätze i. x bezeichnet Konzentration und Volumen im Brunnen bei Schritt n. y bezeichnet Konzentration und Volumen der "zu zu ergänzenden Lösung" in Schritt n.

HINWEIS: Berücksichtigen Sie die Anzahl der Replikationen und berechnen Sie das Gesamtvolumen der "zu zu zu addierenden Lösung" für jeden Konzentrationsschritt. Die Ergebnisse einer typischen Berechnung sind in den Tabellen 1-4aufgeführt. Es bedarf einer allgemeinen Vorstellung über den agonistischen Konzentrationsbereich, der untersucht werden muss, da der Bereich die Konzentrationen und die Anzahl der Portionen definiert, die während der seriellen Addition verabreicht werden sollen. Mit Dem seriellen agonistischen Additionsprotokoll wird die Agonistenkonzentration schrittweise erhöht. Daher muss die Menge an Agonisten bereits im Brunnen berücksichtigt werden, wenn die nächste Dosis hinzugefügt wird. Wenn die Anzahl der agonistischen Moleküle, die bereits im Brunnen vorhanden sind, n_x = c_x x x (mit der aktuellen Konzentration c_x und Volumen V_x) und die Anzahl der Moleküle im Brunnen nach der nächsten Zugabe n_x+ybeträgt, wird die Anzahl der zuzugesetzten Moleküle n_y durch die Konzentration c_y und das Volumen V _y der auf den Brunnen anzuwendenden Lösung bestimmt (n_y = c_y ). Nach dem Hinzufügen eines Teils des Agonisten, ist die neue Menge an AgonistenMolekülen im Brunnen: c_x+y , V_x+y = c_x x , V_x + c_y . Diese Berechnung gilt für jeden nachfolgenden Schritt. Aufgrund der Interdependenz der agonistischen Konzentration im Brunnen und der Menge an Agonisten in den Teilen, die bei jedem Schritt hinzugefügt werden sollen, ist es wichtig, die endgültigen Konzentrationen nach jedem Schritt im Voraus zu definieren.

Modus 1: Das Volumen im Brunnen wird mit jedem Schritt zunehmen, da Flüssigkeit kontinuierlich zugegeben wird.
Verwenden Sie diesen Modus und ein 8-Well-Format, verwenden Sie V_x1 = 200 l und V_{y1 ....} V_yi = 30 l.

Modus 2: Das Volume im Brunnen ist konstant, da das mit jedem Schritt hinzugefügte Volume kurz vor dem nachfolgenden Hinzufügen entfernt wird.
Verwenden Sie diesen Modus und ein 96-Well-Format, verwenden Sie V_x1 = 150 l und V_{y1 ....} V_yi = 75 .

2. Drucken Sie das Datenblatt mit dem Gesamtvolumen pro Konzentration und detaillierten Anweisungen zum Pipetieren.
3. Bereiten Sie alle Lösungen in der erforderlichen Menge vor. Machen Sie alle agonistischen Lösungen in demselben serumfreien Medium, wie sie für die Gleichdimierung der Zellen verwendet werden.
   VORSICHT: Histamindihydrochlorid wird durch den OSHA Hazard Communication Standard 2012 (29 CFR 1910.1200) als gefährlich eingestuft. Histamin verursacht Hautreizungen, schwere Augenreizungen, kann eine allergische Hautreaktion, Allergie, Asthmasymptome oder Atembeschwerden verursachen, wenn es eingeatmet wird und Atemwegsreizungen verursachen kann. Bitte beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt.
   HINWEIS: Machen Sie agonistische Lösungen so frisch wie möglich. Die Stabilität der Agonisten in lösungsweise kann erheblich variieren. Lagern Sie Lösungen bei 4 °C oder darunter, bis sie im Experiment verwendet werden. Für einige Moleküle können zusätzliche stabilisierende Additive, wie BSA bei der Verwendung von Peptid-basierten oder Lipid-basierten Molekülen, in Betracht gezogen werden, um Adsorption an den Wänden von Brunnen und Röhren zu verhindern.
4. Wenn Sie das Experiment im 96-Well-Format durchführen, übertragen Sie Lösungen auf eine herkömmliche 96-Well-Platte (keine Elektroden) und verwenden Sie eine 8- (oder 12-) Kanalpipette für eine schnelle Flüssigkeitsübertragung in das Elektroden-Array.

5. Vorbereitung von agonistischen Experimentierlösungen im Antagonistenmodus

HINWEIS: Bereiten Sie die Antagonistenlösung(n) mit der Konzentration vor, die durchgängig aufgebracht werden soll. Volumen und Konzentration der Antagonistenlösung hängen von der Art der agonistischen Addition ab (1 oder 2). Beispiele für Experimente im 8-Well- oder 96-Well-Format zusätzlich Modus 2: (A) 8-Well-Format (V_x1 = 200 l, V_Antagonist = 200 l); (B) 96-Well-Format (V_x1 = 150 l, V_Antagonist = 75 x L).

1. Berechnen Sie die Konzentration jeder Agonistenlösung, die für jeden Schritt der seriellen Bejegung benötigt wird, wie in Schritt 4.1 beschrieben.
2. Machen Sie alle agonistischen Lösungen in demselben serumfreien Medium, wie sie zur Gleichdrüse der Zellen verwendet werden, und fügen Sie den Antagonisten bei der gleichen Endkonzentration hinzu, wie für die jeweiligen Brunnen im Experiment geplant.
   HINWEIS: In diesem Fall wird die Histamin-Lagerlösung (10 mM) in L-15 Medium hergestellt. Wenn Agonisten in anderen Lösungsmitteln (z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO), Ethanol) gelöst werden, sollte eine Lösungsmittelkontrolle einbezogen werden, um die steigende Lösungsmittellast bei jedem Zusatzschritt zu berücksichtigen.

6. Ausführen des seriellen Additionsprotokolls im Agonistenmodus

1. Starten Sie die Datenerfassung, wie in den Schritten 3.1 – 3.5 beschrieben.
2. Die Agonistenlösungen vor dem Gebrauch vorwärmen, indem Sie sie vor der Zugabe ca. 10 – 15 min im Inkubator platzieren.
   HINWEIS: Bei verwendung thermolabiler Substanzen sollten die Lösungen nicht zu lange bei 37 °C gehalten werden. Wenn die Vorerwärmung für 10 – 15 min als kritisch angesehen wird, bringen Sie Lösungen kurz vor dem Zusatz in einem Wasserbad auf 37 °C.
3. Führen Sie die agonistische serielle Dosing abhängig vom ausgewählten Additionsmodus aus. Nach Modus 1 erhöht sich das Gesamtvolumen im Brunnen mit jeder Zugabe der nächsten Dosis. Im Modus 2 wird das gleiche Volumen, das mit jedem Schritt hinzugefügt wird, auch kurz vor dem Hinzufügen der nächsthöheren Dosis wieder entfernt.
   HINWEIS: Die Zeit, die für den Ausgleich der Zellschicht zwischen zwei nachfolgenden Agonistendosen benötigt wird, hängt von der Reaktionszeit der Zellen ab. Ein erstes Experiment im Parallelmodus (ein Brunnen – eine Konzentration) zeigt (i) Zellreaktionszeiten für verschiedene agonistische Konzentrationen und (ii) den empfindlichsten Kurvenparameter (z.B. Impedanzmaximum, Impedanz nach Zeit x).

A: Modus 1 / 8-Well-Format

1. Fügen Sie den Zellen, die in 200 l serumfreiem Medium ausgeglichen wurden, 30 l der ersten Lösung mit der niedrigsten Konzentration von Agonisten hinzu.
2. Lassen Sie die Zellen für den vordefinierten Zeitraum (z. B. 15 min) reagieren und ausdemieren.
3. Fügen Sie 30 l der zweiten Lösung mit der nächsthöheren Konzentration hinzu.
4. Wiederholen Sie die Schritte 6.3.1-6.3.3 mit der dritten, vierten und so weiter agonistischen Lösung.
   ANMERKUNG: Die Arbeit mit 10 Konzentrationsschritten führt am Ende des Experiments zu einem Gesamtvolumen von 500 l, was knapp unter dem maximal anwendbaren Volumen dieser Brunnen von 550 l liegt.

B: Modus 2 / 96-Well-Format

HINWEIS: Anhalten Sie die Datenerfassung während jedes Flüssigkeitsbehandlungsschritts (Addition/Entfernung) über die Software des Impedanzinstruments, wenn Experimente im 96-Well-Format ausgeführt werden. Die aufwendigere Handhabung von Flüssigkeiten kann die Datenerfassung beeinträchtigen. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette.

1. Unterbrechen Sie die Datenerfassung.
2. Fügen Sie den Zellen, die in 150 l serumfreiem Medium ausgeglichen wurden, 75 l der ersten Lösung mit der niedrigsten Konzentration von Agonisten hinzu.
3. Setzen Sie die Datenerfassung fort.
4. Lassen Sie die Zellen für den vordefinierten Zeitraum (z. B. 15 min) reagieren und ausdemieren.
5. Etwa 1 – 2 min, bevor die reguläre Ausgleichszeit endet, halten Sie die Messung an und entfernen Sie 75 l aus jedem Brunnen.
   HINWEIS: Der Zeitpunkt, zu dem die Lösung entfernt werden soll, hängt von der Anzahl der parallel überwachten Bohrungen und der Pipettiergeschwindigkeit ab. Die für die Entfernung der Lösungen benötigte Zeit sollte die Zeit zwischen den nachfolgenden Schritten nicht überschreiten.
6. Fügen Sie 75 l der zweiten Lösung mit der nächsthöheren Konzentration hinzu und nehmen Sie die Messung wieder auf.
7. Wiederholen Sie die Schritte 6.3.8-6.3.10 mit der dritten, vierten und so weiter agonistischen Lösung.

7. Ausführen des seriellen Additionsprotokolls im Antagonistenmodus

1. Starten Sie die Messung wie in den Schritten 3.1 – 3.5 beschrieben.
2. Während der Gleichgewichtsbehandlung der Zellschichten eine Antagonistenlösung (z. B. 200 L von 1,5 M Diphenhydraminhydrochlorid in L15-Medium) vorbereiten.
   VORSICHT: Diphenhydraminhydrochlorid hat potenzielle akute gesundheitliche Auswirkungen. Es ist schädlich, wenn geschluckt oder eingeatmet, kann Augen- und Hautreizungen verursachen. Es kann Zufall von Reizungen des Atmungs- und Verdauungstraktes verursachen. Bitte beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt.
3. Die antagonistischen und agonistischen Lösungen vorwärmen, indem man sie ca. 10 – 15 min im Inkubator platziert, bevor sie zusätzlich zu den Zellkulturen (vgl. 6.2) vorgewässt werden. Wenn auch antagonistischfreie Brunnen in den Test einbezogen sind, auch vorwarmes serumfreies Medium.
4. Fügen Sie die Antagonistenlösung zu den dafür vorgesehenen Brunnen hinzu. Lassen Sie die Zellen mit Antagonisten für 15 – 20 min aussetzen. Wenn antagonistischfreie Brunnen enthalten sind, fügen Sie das gleiche Volumen serumfreies Medium zu diesen Brunnen hinzu.
5. Nach Antagonistenzusatz in Modus 2,entfernen Sie die Lösung aus den Brunnen
   (A) 8-Well-Format (200 l)
   (B) 96-Well-Format (75 l)
6. Führen Sie die agonistische Additionssequenz wie in Schritt 6.3 beschrieben aus.

8. Datenexport und -analyse

1. Exportieren Sie Daten mit der Software des Impedanzinstruments, um alle aufgezeichneten Daten von proprietären in gängige Datenformate (z.B. csv) umzuwandeln. Dieser Schritt ermöglicht die Neuorganisation und Darstellung der Daten mit anderen Softwarepaketen.
2. Laden Sie die csv-formatierten Daten in eine wissenschaftliche Datenanalysesoftware.
3. Normalisieren Sie Impedanzwerte, indem Sie die Impedanz des letzten Datenpunkts vor der ersten Zugabe der Agonistenlösung subtrahieren und die Zeit des Hinzufügens auf t = 0 festlegen. Zeichnen Sie den Zeitverlauf der normalisierten Impedanz.
4. Zeichnen Sie die einzelnen Zeitkurse und identifizieren Sie die Maxima in Impedanz nach jedem Additionsschritt. Erstellen Sie ein Datenblatt mit diesen Werten.
5. Plotten Sie die Werte der maximalen (oder minimalen, falls zutreffend) Impedanzänderungen als Funktion der agonistischen Konzentration. Dies kann für einzelne Brunnen oder für die Mittelwerte (Mittelwert SD) erfolgen.
6. Verwenden Sie eine Datenanpassungsroutine, um halbmaximale effektive Konzentrationen (EC₅₀) und maximale Reaktionsgeschwindigkeit (E_Max) mithilfe des vier Parameter-Logistikmodells (Gleichung 2) zu bestimmen:

ANMERKUNG: c gibt die Agonistenkonzentration an, A₁ ist das Minimum und A2 ist das maximale Asymptote der sigmoidalen Dosis-Wirkungs-Kurve (A₂ = E_Max). EC₅₀ ist die Konzentration am Biegepunkt der Kurve und n entspricht der Hügelneigung.

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Ergebnisse

Ein typisches Schema zur Vorbereitung der verschiedenen agonistischen Lösungen wird für ein Experiment mit 8-Well-Elektroden-Arrays mit Histamin als Agonist in den Tabellen 1-4gezeigt. Tabelle 1 und Tabelle 2 zeigen Volumen und Konzentrationen für ein Experiment mit Additionsmodus 1 (vgl. Abbildung 1), während Tabelle 3 und Tabelle 4 Volumen und Konzentrationen für ein Experiment nach <...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für etikettenfreie Impedanzmessungen, um die Dosis-Wirkungs-Beziehung der agonistisch-induzierten GPCR-Aktivierung in Abwesenheit oder das Vorhandensein spezifischer Antagonisten für denselben Rezeptor zu bestimmen. Der Konzeptbeweis dieser Methode wurde kürzlich in einer Veröffentlichung^{vorgestellt 12}. Unserer Kenntnis nach ist es die erste Studie, die die Etablierung einer vollständigen Dosis-Wirkungs-Kurve der agonistisch vermittelten GPCR-Aktivier...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bürker counting chamber	Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany)	640210
cell culture flasks 25 cm2	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	690175
Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	\
Centrifuge (Heraeus 1S-R)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	\
Diphenhydramine hydrochloride	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	D3630
Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	D5671
Impedance Instrument (ECIS Zθ)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\
8-well electrode Arrays (8W1E PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)
96-well electrode arrays (96W1E+ PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom (Berlin, Germany)	S0615
Histamine dihydrochloride	Carl Roth (Karlsruhe, Germany)	4017.1
Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	51022515	class II safety cabinet
Leibovitz' L-15 medium	Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)	21083-027
L-glutamine	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	G7513
Micropipette large (100 - 1000 µL)	Brandt (Wertheim, Germany)	704780
Micropipette large (20 - 200 µL)	Brandt (Wertheim, Germany)	704778
Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)	Nikon (Düsseldorf, Germany)
Penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	P0781
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	D8537
Pipette, serological	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	607 180
Pipettor (accu-jet pro)	Brandt (Wertheim, Germany)	26300
Trypsin	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)	T4174	in PBS with 1 mM EDTA
Tube, 15 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	188 271
Tube, 50 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)	210 261
U-373 MG cells	ATCC (Rockville, MD, USA)	ATCC HTB-17
water bath (TW21)	Julabo (Seelbach, Germany)	\