JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Böcek dokularında begomovirüslerin lokalizasyonu ve nicelemesi için immünoresans ve nicel PCR yöntemini tanımladık. İmmünofloresan protokolü viral ve vektör proteinleri kolokalize etmek için kullanılabilir. Kantitatif PCR protokolü tüm whitefly organları ve virüs bulaşmış bitkilerde virüsleri ölçmek için uzatılabilir.

Özet

Begomoviruses (cins Begomovirus, aile İkizler )kalıcı, dolaşımcı bir şekilde Bemisia tabaci kompleksinin whiteflies tarafından iletilir. Begomovirüslerin dünya çapında üretime verdiği büyük hasar göz önüne alındığında, begomovirüsler ve onların whitefly vektörü arasındaki etkileşimi anlamak zorunludur. Bunu yapmak için, vektör dokularında virüsün lokalizasyonu ve nicelleştirilmesi çok önemlidir. Burada, örnek olarak domates sarı yaprak kıvırcık virüs (TYLCV) kullanarak, biz whitefly midguts begomoviruses lokalize etmek için ayrıntılı bir protokol tarif, primer tükürük bezleri, ve immünororesans ile yumurtalıklar. Yöntem, bir virüs kat protein, boya etiketli ikincil antikorlar ve konfokal mikroskop karşı spesifik antikorların kullanımına dayanmaktadır. Protokol aynı zamanda begomoviral ve whitefly proteinleri colocalize için kullanılabilir. Ayrıca whitefly midguts, primer tükürük bezleri, hemolenf ve yumurtalıklarda tylcv sayısallaştırılması için bir protokol açıklar kantitatif PCR (qPCR). TYLCV için özel olarak tasarlanmış astarlar kullanılarak, nicelleştirme protokolleri, whitefly'ın farklı dokularında TYLCV miktarının karşılaştırılmasına olanak sağlar. Açıklanan protokol, bir beyaz sinek ve virüs bulaşmış bir bitkinin vücudundaki begomovirüslerin sayısallaştırılması için potansiyel olarak yararlıdır. Bu protokoller whitefly begomoviruses dolaşım yolunu analiz etmek için veya whitefly-begomovirus etkileşimleri çalışma için diğer yöntemlerin bir tamamlayıcısı olarak kullanılabilir.

Giriş

Son yıllarda, begomoviruses (cins Begomovirus, aile İkizler )birçok sebze üretimine ciddi zarar neden oldu, lif, ve süs bitkileri dünya çapında1. Begomoviruses whitefly Bemisia tabaci tarafından kalıcı bir şekilde iletilir (Hemiptera: Aleyrodidae), hangi üzerinde içeren karmaşık bir tür 35 şifreli türler2,3. Begomoviruses doğrudan veya dolaylı olarak whitefly fizyolojisi ve davranış etkileyebilir, fecundity4gibi , uzun ömür4, ve konaktercihi 5,6. Ayrıca, belirli bir begomovirüs türlerinin iletim verimliliği / zorlanma farklı whitefly şifreli türler için bile aynı deneysel koşullar altında değişir7,8,9,10, begomovirüsler ve beyaz sinekler arasında karmaşık bir etkileşim olduğunu gösteren. Whitefly-begomovirus etkileşimlerinin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak için, whitefly dokularında virüsün lokalizasyonu ve nicelemesi esastır.

Domates sarı yaprak kıvırcık virüs (TYLCV) ilk İsrail'de bildirilen bir begomovirus ama günümüzde domates üretimi dünya çapında ciddi hasara neden olur11,12. Ekonomik önemi nedeniyle, en iyi çalışılan begomoviruses13biridir. Diğer monopartite begomoviruses gibi, TYLCV yaklaşık bir genom boyutu ile tek iplikli dairesel DNA virüsü14. Hala tartışma altında iken, kanıt çeşitli satırları whiteflies15,16,17TYLCV çoğaltılması destek . Ayrıca, TYLCV parçacıkları ve whitefly proteinlerin etkileşimi bildirilmiştir6,18,19,20. Virüs bulaşması için, beyaz sinekler virüs bulaşmış bitkilerle beslenerek TYLCV elde, virions yemek borusuna ulaşmak için besin kanalı boyunca geçmek, hemolenf ulaşmak için midgut duvar nüfuz, ve daha sonra birincil tükürük bezleri içine translocates (PSGs). Son olarak, virions bitki phloem içine tükürük kanalı boyunca tükürük ile egestedvardır 21. Ayrıca, çeşitli çalışmalar TYLCV transovarial dişi beyaz sinekler kendi yavrularına22,23iletilir mümkün olduğunu göstermektedir. Başka bir deyişle, verimli iletim elde etmek için, virüs bir dokudan diğerine translocate için whitefly içinde hücresel engelleri aşmak zorundadır. Bu engellerin aşılması sırasında, whitefly ve virüs proteinleri arasındaki etkileşimler muhtemelen virüslerin bulaşma verimliliğini belirleyen oluşabilir.

İmmünofloresans protein dağılım analizi nde yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Antikorların antijenlerine bağlanan özgüllüğü immünfloresansın temelini oluşturur. TYLCV'nin ekonomik önemi nedeniyle, TYLCV kat proteinine karşı monoklonal antikorlar geliştirilmiştir ve virüsün lokalize edilmesi için son derece hassas bir yol24geliştirilmiştir. Kantitatif PCR (qPCR) nükleik asitlerin hassas ve spesifik nicelemasını sağlar. Bu teknik en sık hidroliz probu (örneğin, TaqMan) veya floresan boya (örneğin, SYBR Green) tespiti kullanımına dayanır. Hidroliz prob tabanlı qPCR için, belirli problar gereklidir, bu da dolayısıyla maliyeti artırır. Floresan boya bazlı qPCR daha basit ve daha uygun maliyetlidir, çünkü etiketli amplicon spesifik hibridizasyon probları25. Şimdiye kadar, çeşitli çalışmalarda karmaşık begomovirus-whitefly etkileşimleri araştırmak için diğer yöntemlerle birlikte immünoresans ve qPCR kullandık. Örneğin, Pan ve ark. whitefly dokularda virüsün qPCR ve immünoforeskence analizi yapıldı ve beyaz sinek türleri AsiaII 1 ve Orta Doğu Asya Küçük 1 (MEAM1) arasında tütün kıvırcık ateş virüsü (TbCSV) iletmek için yeteneği farkı etkili AsiaII1 ama MEAM1 8 midgut duvar çapraz edememek için virüs nedeniyle bulundu8. Benzer şekilde, Akdeniz (MED) beyaz sinekler kolayca TYLCV iletebilirsiniz iken, onlar domates sarı yaprak kıvırmak Çin virüsü (TYLCCNV) iletmek için başarısız. Seçici iletim, TYLCCNV'nin MED whiteflies26'nınPSG'lerini kolayca geçmediğini gösteren PSG'lerde immünororesans virüsü nisbi tespiti kullanılarak araştırıldı. TYLCV CP ve whitefly midguts otofaji marker protein ATG8-II immünofloresan kolokalizasyonu otofin whitefly27TYLCV enfeksiyonu baskı kritik bir rol oynadığını göstermektedir.

Burada, örnek olarak TYLCV kullanarak, bir immünofloresan tekniği ile whitefly midguts, PSGs ve yumurtalıklarda begomovirüslerin lokalizasyonu için bir protokol açıklar. Bu teknik, primer ve boya etiketli ikincil antikorlarla diseksiyon, fiksasyon ve kuluçkayı içerir. Floresan sinyalleri daha sonra bir konfokal mikroskop altında tespit edilebilir whitefly dokularda viral proteinlerin yerini gösteren. Daha da önemlisi, bu protokol begomoviral ve whitefly proteinleri colocalize için kullanılabilir. Ayrıca, farklı whitefly doku örneklerinde virüs miktarını karşılaştırmak için kullanılabilecek whitefly midguts, PSGs, hemolenf ve yumurtalıklarda SYBR Yeşil tabanlı qPCR kullanılarak TYLCV'nin sayısallaştırılması için bir protokol tanımlayın.

Protokol

1. Whitefly, Virüs, Bitkiler ve Virüs Edinimi

  1. Arka beyaz sinekler (MEAM1) pamuk(Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) 14:10 ışık: karanlık döngüsü ve 60 ± % 10 bağıl nem ile 26 ± 1 °C bir serada böcek geçirmez kafeslerde.
  2. Whitefly popülasyonunun saflığını belirlemek için whitefly mitokondriyal sitokrom oksidaz I genine dayalı geleneksel PCR gerçekleştirin.
    1. 20 yetişkin beyaz sinek toplayın ve 30 μL lysis tampon (10 mM Tris, pH = 8.4, 50 mM KCl, 0.45% [wt/vol] Tween-20, 0.2% [wt/vol] jelatin, 0.45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Proteinase K).
    2. Her PCR tüpüne 5-7 seramik boncuk (2 mm çapında) ekleyin ve doku lysis gerçekleştirmek için örnekleri eziyet.
    3. Tüm numuneleri 65 °C'de 1 saat, ardından 10 00 dakika 100 °C'de kuluçkaya yatırın ve kısa bir süre santrifüj edin. PCR amplifikasyon için şablon olarak bu supernatant kullanın.
      NOT: 65 °C'de kuluçka süresi gerekirse artırılabilir.
    4. PCR reaksiyonu aşağıdaki gibi hazırlayın: 1 U Taq DNA polimeraz, 2 μL 10x tampon (Mg2+ile), 1.6 μL dNTP karışımı (2.5 mM), 0.5 μL her astar (her biri 10 μM), 2 μL whitefly doku lysate supernatant ve çift distile su 20 μL reaksiyon başına toplam hacmine. İleri astar dizisi 5'-TTGATTTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3' ve ters astar dizisi 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'.
      NOT: DNA'nın nükleaz içermeyen su ile değiştirildiği negatif kontrol ve daha önce doğrulanmış MEAM1 whitefly DNA ile pozitif kontrol eklenmelidir.
    5. Aşağıdaki bisiklet parametrelerini kullanarak PCR'yi gerçekleştirin: 95 °C'de 3 dk için ilk denatürasyon, ardından 95 °C'de 30 s için 35 döngü denatürasyon, 30 s için 50-55 °C'de annelik, 72 °C'de 1 dk boyunca uzatma, ardından 10 dk için 72 °C.
    6. Restriksiyon enzimi Taq I ile güçlendirilmiş ürünü sindirin. Bunu yapmak için, 0.1 μL (1 U) enzim, 1 μL 10x Taq I Tampon, 1 μL BSA, 5 μL amplifiye ürün ve çift distile su ile 10 μL toplam hacmine sindirim karışımı hazırlayın. 65 °C'de bir termocycler içinde 1 saat kuluçka.
    7. Her sindirilen ürünün 5-7 μL'sini ve %1'lik bir agarose jelin kuyularına bir DNA merdiveni (100-2.000 bp) yükleyerek numunelerin agarose jel elektroforezini gerçekleştirin. Daha sonra, UV ışığı kullanarak jel dokümantasyon makinesinde jel-kırmızı boyama ile DNA bant boyutları gözlemleyin. Whitefly popülasyonunun saflığını belirlemek için sindirilmiş ürünlerin bant boyutlarını pozitif kontrolle karşılaştırın.
  3. TYLCV'nin (GenBank katılım numarası AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4A) 3-4 gerçek yaprak evre domates bitkisi(Solanum lycopersicum L. cv. Hezuo 903) enfeksiyöz klonunu tarıma bağla.
    1. 10 mL Luria-Bertani (LB) orta kanamisin (50 g/mL) ve rifampisin (50 μg/mL) içeren tek bir koloni ile inoculate. 28 °C'de 200 rpm'de od600 ~1.5'e ulaşana kadar sallayarak kuluçkaya yatırın.
    2. 10 dk. için 4.000 x g santrifüj ile hasat agrobacteria.
    3. 200 μM asetozeringon, 10 mM 2-(N-morphololno) etan sülfonik asit (MES) ve 10 mM MgCl2'denoluşan 10 mL infiltrasyon tamponundaki resuspend peletleri. 1-2 saat oda sıcaklığında (RT) inkübat.
    4. 1 mL iğnesiz şırınga ile adım 1.3.3 karışımı kullanarak 2-3 bitki yaprakları sızın. 26 ± 1 °C'de bir serada bitkileri koruyun.
  4. Yaklaşık 1 ay sonra, görsel bir inceleme yapmak ve sarı kıvırcık yaprak ve dublör belirtileri gösteren bitkiler seçin.
  5. Virüs edinimi için 48 saat boyunca TYLCV enfekte domates bitkileri üzerine non-viruliferous whitefly yetişkin aktarın.

2. Kadın Beyaz Sineklerin Midguts, Primer Tükürük Bezleri (PSG), Yumurtalıkları ve Hemolenflerinin Diseksiyonu ve Toplanması

  1. Aspirasyon kullanarak beyaz sinekler toplamak ve sonra komaya koymak için buz üzerine yerleştirin. Bir mikroskop slayt üzerine 1x PBS (fosfat tamponlu salin) tampon ekleyin ve sonra bir stereo mikroskop altında diseksiyon için 1x PBS tampon beyaz sinekler yerleştirin.
    1. Midgut diseksiyonu için, whitefly'ın karnını kırın ve ince bir akupunktur iğnesi (0,25 mm çapında) kullanarak midgut'u çekin. Orta bağırsağı temize aktarın, 1x PBS.
    2. PSG diseksiyonu için, dorsal taraftan baş ın yanında toraks içinde whitefly vücut kırmak. Sonra, whitefly düzeltmek için toraks içine bir iğne takın ve iki tükürük bezleri vücuttan ayrılana kadar whitefly sallamak için başka bir iğne kullanın. Sonra, temizlemek için PSGs aktarın, 1x PBS.
    3. Yumurtalık diseksiyonu için, tamamen whitefly karın kırmak, ve diğer dokulardan yumurtalıkları ayırmak için bir iğne kullanın. Daha sonra, pipetleme tarafından fazla dokuları çıkarın.
    4. Hemolenf koleksiyonu için, bir mikroskop slayt üzerine 10 μL 1x PBS tampon ekleyin ve sonra tampon bir whitefly yerleştirin. Hemolenf elde etmek için, yavaşça ince bir akupunktur iğnesi kullanarak karın bir delik gözyaşı, ve hafifçe tampon içine hemolenf serbest bırakmak için karın basın. Hemolenf örneği olarak sıvının 8 μL'sini toplayın.

3. Whitefly Midgut, Primer Tükürük Bezleri ve Yumurtalıklarda TYLCV Lokalizasyonu

NOT: TYLCV'nin midgutlarda lokalizasyonu için yapılan prosedür örnek olarak sunulmuştur. Bu yöntem PSG'ler ve yumurtalıklar için kullanılabilir.

  1. Adım 2.2.1'de açıklandığı gibi TBS tamponundaki midgutları (10 mM Tris-HCl, 150 mM sodyum klorür, pH = 7,5) inceleyin. 15-20 whitefly midguts toplamak, bir cam Petri çanak (çapı 3,5 cm) içine aktarın ve sonra fazla TBS tampon kaldırın.
  2. Orta gutları oda sıcaklığında 2 saat sabitlemek için %4 paraformaldehit in 1 mL'sini ekleyin ve fiksatif çözeltiyi çıkarın. Pipet yavaş yavaş 2 dakika her biri için TBS midguts 3x yıkamak için.
  3. 30 dk permeabilize için% 0.5 Triton X-100 1 mL midguts inkübül. Daha sonra permeabilizasyon çözeltisini çıkarın ve 3.2 adımda açıklandığı gibi midguts 3x'i TBST (%0,05 Ara 20 ile 1x TBS) ile yıkayın.
  4. Midguts engellemek için% 1 BSA (Sığır serum albumin TBST hazırlanan) 1 mL ekleyin. 2 saat boyunca RT'de engelleme adımını atın ve ardından engelleme çözeltisini çıkarın ve TBST'de midguts 3x yıkayın.
  5. TBST24 ile 1:400'de birincil antikorları (TYLCV kat proteinine karşı MAb 1C4) seyreltin ve orta bağırsakları batırmak için çözeltiyi Petri kabına ekleyin. Karanlıkta bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Birincil antikor çözeltisini atın ve TBST'de 3x yıkayın.
  6. TBST ile 1:400 ikincil antikorlar (anti-fare) seyreltin ve midguts batırmak için Petri kabına çözelti ekleyin. Karanlıkta RT'de 2 saat boyunca çanak kuluçkaya yatırın. İkincil antikor solüsyonu atın ve midguts 3x TBST'de yıkayın.
  7. Midgutları net bir mikroskop slaytına aktarın. Slayttan mümkün olduğunca çok TBST aspire edin. Çekirdeği lekelemek için 1 damla DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindole, dihidroklorür) ekleyin ve sonra kapak kaymasını ve contayı oje ile yerleştirin. Konfokal mikroskop altında inceleyin.

4. QPCR ile Whitefly Midgut, Primer Tükürük Bezleri, Hemolenf ve Yumurtalıklarda TYLCV'nin Ölçülmesi

  1. Yukarıda açıklandığı gibi 1x PBS whitefly midguts, PSGs, hemolenf ve yumurtalıklar diseksiyon.
  2. Midguts, PSGs, hemolenf ve yumurtalıkların DNA ayıklayın.
    1. Diseksiyondan sonra, midguts, PSGs ve yumurtalıkları temiz, 1x PBS tampon 2-3x yıkayın.
    2. 1x PBS'nin 5 μL'sinde 20 midgut veya 20 PSG toplayın ve 25 μL lysis çözeltisine aktarın. Her yumurtalığı 5 μL 1x PBS'ye aktarın ve ardından ayrı ayrı 25 μL lysis çözeltisine aktarın.
    3. Adım 1.2.2'de açıklandığı gibi orta gut, PSG ve yumurtalık örneklerini öğütün.
    4. PCR tüpüne 1x PBS ile 8 μL hemolenf toplayın ve 10 μL likis çözeltisi ekleyin. Iyice karıştırın.
  3. 1.2.3'te açıklandığı gibi tüm örneklerden DNA çıkar.
  4. TYLCV için iki ayrı qPCR ana karışımı (her biri 18 μL) ve iç kontrol(β-aktin geni) aşağıdaki gibi hazırlayın: 10 μL SYBR Green karışımı, her astarDan 0,8 μL (her biri 10 μM) ve reaksiyon başına 6,4 μL çift distile su. TYLCV için, ileri astar dizisi 5'-GAAGCGACCAGGCGATATAA-3′ ve ters astar dizisi 5′-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3′. β-aktiniçin, ileri astar dizisi 5′-TCTTCCAGCCATCCTTTCTTG-3′ ve ters astar dizisi 5′-CGGTGATTTCCTTCTGCATT-3′.
  5. 18 μL ana karışımıqPCR şerit tüpler veya 96 kuyu plaka şişeleri içine dağıtın. Daha sonra, her şişeye 2 μL DNA örneği ekleyin. Tüm reaksiyonları en az üç teknik kopya ve üç biyolojik kopya ile gerçekleştirin.
    NOT: Adım 4.5 buz üzerinde yapılmalıdır.
  6. QPCR tüplerini kapatın veya 96 kuyu plakasını yapışkan plakalı mühürle kapatın.
  7. Santrifüj qPCR tüpler veya 96 iyi plaka altında sıvı toplamak için.
  8. Tüpleri veya plakayı gerçek zamanlı termal döngüye yerleştirin ve qPCR'ı gerçekleştirin.
    1. QPCR'ı aşağıdaki bisiklet parametrelerini kullanarak gerçekleştirin: 30 s için 95 °C, ardından 5 s için 95 °C 40 döngü ve 34 s için 60 °C, 1 5 s için 95 °C'de 1 döngü, 60 °C ile 95 °C arasında erime eğrisi basamağa son vererek 15 s başına 0,5 °C'lik bir artış.
    2. Florofor boya sı yatvesi olarak SYBR'yi seçin ve örnek türü olarak bilinmiyor.
  9. Nicel verileri elektronik tablo biçimine aktarın ve 2−ΔΔCT yöntemi28ile viral DNA'nın göreli miktarını analiz edin.

Sonuçlar

B. tabaci kompleksi ve TYLCV MEAM1 whiteflies burada prosedürleri tanımlamak için bir örnek olarak kullanılmıştır. Bu el yazmasında açıklanan immünoresans ve viral nicelleştirme prosedürlerine genel bakış Şekil 1'degösterilmiştir. Şekil 2, PSGs, midguts ve yumurtalıklarda TYLCV ve DAPI boyama immünofloresan tespiti temsili sonuçları gösterir, TYLCV PSGs ve midguts daha fazla birikmiş olduğunu gösteren, ve yumurtalıklarda dah...

Tartışmalar

Burada immünororeskence ve qPCR ile whitefly vektördokularında bir begomovirüs lokalizasyonu ve nicelleştirme için bir protokol açıklar. Diseksiyon, whitefly dokularında virüsün lokalize ve ölçülmesiiçin ilk adımı temsil eder. Whitefly vücut dokuların son derece küçük olduğu anlamına gelir uzunluğu yaklaşık 1 mm, ve onları incelemek zordur. Ayrıca, dokular arasında güçlü bağlantılar vardır. Örneğin, yumurtalıklar sıkıca bakteriyofitler ile bağlı, onları izole etmek zor hale. Bu...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (Hibe numarası: 2017YFD0200600), Çin Tarım Araştırma Sistemi (hibe numarası: CARS-23-D07) ve Bill & Melinda Gates Vakfı (Yatırım Kimliği OPP1149777) için ayrılmış fon tarafından desteklenmiştir ). Prof. Jian-Xiang Wu'ya TYLCV CP antikorları sağladığı için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
4% ParaformaldehydeMultiSciencesF0001
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)Abcamab104139
Bovine Serum Albumin (BSA)MultiSciencesA3828
CFX Connect Real-Time PCR Detection SystemBio-RAD185-5201
Confocal microscopyZeissLSM800
Dylight 549-goat anti-mouseEarthoxE032310-02Secondary antibody
Monoclonal antibody (MAb 1C4)Primary antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sangon BiotechB548119-0500
Stereo microscopeZeissStemi 2000-C
TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)TaKaRaRR820AqPCR master mix
ThermocyclerThermofisherA41182
TissuelyzerShaghai jingxinTissuelyser-48
Triton-X-100BBI life sciences9002-93-1
Tween 20BBI life sciences9005-64-5

Referanslar

  1. Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
  2. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
  3. Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
  4. Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
  5. Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
  6. Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
  7. Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
  8. Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
  9. Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
  10. Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
  11. Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
  12. Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
  13. Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
  14. Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
  15. Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
  16. Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
  17. Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
  18. Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
  19. Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
  20. Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
  21. Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
  22. Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
  23. Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
  24. Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
  25. Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
  26. Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
  27. Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
  28. Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
  29. Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 156imm noresanskantitatif PCRBemisia tabaciDomates sar yaprak k v rc k vir sdiseksiyonprimer t k r k bezimidgut

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır