면역형광 및 정량적 PCR에 의한 화이트플라이 조직에서 베고모바이러스의 국소화 및 정량화

요약

우리는 곤충 조직에서 베고모바이러스의 국소화 및 정량화를 위한 면역형광 및 정량적 PCR 방법을 기술한다. 면역형광 프로토콜은 바이러스 및 벡터 단백질을 국소화하는데 사용될 수 있다. 정량적 PCR 프로토콜은 전체 화이트플라이 바디 및 바이러스 감염 식물에서 바이러스를 정량화하기 위해 확장될 수 있다.

초록

베고모바이러스(베고모바이러스,가족 쌍둥이자리)는 베미시아 타바치 복합체의 흰파리에 의해 지속적이고 순환적인 방식으로 전달된다. 전 세계적으로 작물 생산에 베고모 바이러스로 인한 광범위한 손상을 고려, 베고모 바이러스와 그들의 흰 파리 벡터 사이의 상호 작용을 이해하는 것이 필수적이다. 이렇게 하려면 벡터 조직에서 바이러스의 국소화 및 정량화가 중요합니다. 여기서, 예를 들어 토마토 노란 잎 컬 바이러스(TYLCV)를 사용하여, 우리는 면역형광에 의한 백딧지, 1차 타액선 및 난소에서 베고모바이러스를 국소화하는 상세한 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 바이러스 코트 단백질, 염료 표지 이차 항체 및 공초점 현미경에 대한 특정 항체의 사용에 기초한다. 프로토콜은 또한 베고모바이러스 및 흰플라이 단백질을 국소화하는데 사용될 수 있다. 우리는 또한 양적 PCR (qPCR)에 의하여 흰살 파리 중두, 1 차 적인 타액 선, 헤모 림프 및 난소에 있는 TYLCV의 정량화를 위한 프로토콜을 기술합니다. TYLCV를 위해 특별히 설계된 프라이머를 사용하여 정량화를 위한 프로토콜은 화이트플라이의 상이한 조직에서 TYLCV의 양을 비교하는 것을 허용한다. 기재된 프로토콜은 화이트플라이 및 바이러스에 감염된 식물의 체내에서 베고모바이러스의 정량화에 잠재적으로 유용하다. 이 프로토콜은 화이트플라이에서 베고모바이러스의 순환 경로를 분석하거나 화이트플라이-베고모바이러스 상호작용을 연구하는 다른 방법에 대한 보완으로 사용될 수 있다.

서문

지난 수십 년 동안, 베고모바이러스(Begomovirus, 가족 쌍둥이자리)는전 세계적으로 많은 채소, 섬유질 및 장식용 작물의 생산에 심각한 손상을 입혔습니다^1. 베고모바이러스는 35종 이상을 포함하는 복합종인 흰파리 베미시아 타바치(Hemiptera: Aleyrodidae)에 의해 지속적으로전달된다. 베고모바이러스는 백딧항 4, 장수^4,호스트 선호도^5,6과 같은 백딧물 생리학 및 행동에 직간접적으로 영향을 미칠 수 있다. 더욱이, 주어진 베고모바이러스 종/균주의 투과 효율은 동일한 실험^{조건7,8,9,10하에서도}다른 흰동비 비밀 종에 대해 다양하며, 이는 베고모바이러스와 흰파리 사이에 복잡한 상호작용이 있음을 나타낸다. 화이트플라이-베고모바이러스 상호 작용의 근본적인 메커니즘을 더 잘 이해하려면, 흰파리 조직에서 바이러스의 국소화 및 정량화가 필수적입니다.

토마토 노란 잎 컬 바이러스(TYLCV)는 이스라엘에서 처음 보고되었지만 요즘에는 전 세계적으로 토마토 생산에 심각한 손상을 입히는 베고모바이러스(TYLCV)이다. 경제적 중요성으로 인해 가장 잘 연구 된 베고모 바이러스¹³중 하나입니다. 다른 모노파르트 베고모바이러스와 마찬가지로, TYLCV는 약 2,800개의 뉴클레오티드^14의게놈 크기를 가진 단일 가닥 원형 DNA 바이러스이다. 여전히 논쟁 중, 증거의 여러 줄은 흰 파리에서 TYLCV의 복제를 지원^15,16,17. 더욱이, TYLCV 입자와 흰플라이 단백질의 상호작용은^{6,18,19,20으로}보고되었다. 바이러스 전염을 위해, 흰파리는 바이러스에 감염된 식물에 공급하여 TYLCV를 취득하고, 비리온은 식도에 도달하기 위해 음식 운하를 따라 통과하고, 헤모 림프에 도달하기 위해 중구 벽을 관통한 다음, 1 차 적인 침샘 (PSGs)으로 옮겨갑니다. 마지막으로, 비리온은 침관을 따라 침을 식물 phloem^21로예시한다. 게다가, 몇몇 연구 결과는 TYLCV가 그들의 자손^22,23에암컷 흰파리에서 transovarially 전달될 수 있다는 것을 보여줍니다. 즉, 생산적인 전염을 달성하기 위해, 바이러스는 한 조직에서 다른 조직으로 옮기기 위해 백색가비 내의 세포 장벽을 극복해야 한다. 이 장벽의 교차 도중, whitefly와 바이러스 단백질 사이 상호 작용은 아마 바이러스가 전송되는 효율성을 결정하는, 일어날 확률이 높습니다.

면역형광은 단백질 분포 분석을 위해 일반적으로 사용되는 기술입니다. 그들의 항원과 결합하는 항체의 특이성은 면역 형광의 기초를 형성한다. TYLCV의 경제적 중요성으로 인해, TYLCV 코트 단백질에 대한 단일 클론 항체가 개발되어 바이러스^24를국소화하는 매우 민감한 방법을 제공합니다. 정량적 PCR(qPCR)은 핵산의 민감하고 구체적인 정량화를 가능하게 합니다. 이 기술은 가수분해 프로브(예를 들어, TaqMan) 또는 형광 염료(예를 들어, SYBR Green) 검출의 사용에 가장 자주 기초한다. 가수분해 프로브 기반 qPCR의 경우 특정 프로브가 필요하므로 비용이 증가합니다. 형광 염료 기반 qPCR은 라벨이 부착된 앰플리톤 특이적 혼성화 프로브가^25를필요로 하지 않기 때문에 더 간단하고 비용 효율적입니다. 지금까지, 몇몇 연구 결과는 복잡한 begomovirus-흰파리 상호 작용을 조사하기 위하여 그밖 방법과 더불어 면역 형광 및 qPCR를 이용했습니다. 예를 들어, Pan et al.은 백색파리 조직에서 바이러스의 qPCR 및 면역형광 분석을 수행하고 백색파리 종 아시아II 1과 중동 아시아 소소1(MEAM1) 사이의 담배 경투 바이러스(TbCSV)를 전송하는 능력의 차이가 아시아II1하지만^MEAM1이아닌 아시아II1의 중거벽을 효율적으로 교차할 수 있는 바이러스에 기인한다는 것을 발견하였다. 유사하게, 지중해 (MED) 흰파리는 쉽게 TYLCV를 전송할 수 있지만, 그들은 토마토 노란 잎 컬 중국 바이러스 (TYLCCNV)를 전송하는 데 실패합니다. 선택적 전염은 PSGs에서 바이러스의 면역형광 검출을 사용하여 조사되었으며, 이는 TYLCCNV가 MED^{흰파리(26)의}PSG를 쉽게 교차하지 않는 것으로 나타났다. 백색파리 미드구트에서 TYLCV CP 및 자가포식 마커 단백질 ATG8-II의 면역형광 동국화는 자가포식이 화이트플라이^27에서TYLCV의 감염을 억제하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.

여기서, 예를 들어 TYLCV를 사용하여, 우리는 면역형광 기술에 의한 백비행 중거트, PSG 및 난소에서 베고모바이러스의 국소화를 위한 프로토콜을 기술한다. 이 기술은 1 차및 염료 표지된 이차 항체를 가진 해부, 고정 및 배양을 포함합니다. 흰파리 조직에서 바이러스 성 단백질의 위치를 보여주는 형광 신호는 공초점 현미경으로 검출 될 수 있습니다. 더 중요한 것은, 이 프로토콜은 베고모바이러스 및 흰파리 단백질을 국소화하는 데 사용될 수 있다. 우리는 또한 다른 whitefly 조직 견본에 있는 바이러스의 양을 비교하기 위하여 이용될 수 있는 백색파리 midguts, PSGs, hemolymph 및 난소에 있는 SYBR 녹색 기지를 둔 qPCR를 사용하여 TYLCV의 정량화를 위한 프로토콜을 기술합니다.

프로토콜

1. 화이트 플라이, 바이러스, 식물, 바이러스의 취득

1. 면에 있는 후방 흰살파리(MEAM1)는 26±1°C에서 온실에서 곤충 방지 케이지에서 14:10의 빛:암주기 및 60±10% 상대 습도에 있는 곤충 방지 케이지에 있다.
2. 백두미토콘드리아 시토크롬 산화아제 I 유전자에 기초한 종래의 PCR을 수행하여 백파리 집단의 순도를 결정한다.
   1. 20 마리의 성인 흰파리를 수집하고 30 μL의 라시스 버퍼를 함유 한 PCR 튜브로 개별적으로 옮김 (10 mM Tris, pH = 8.4, 50 mM KCl, 0.45% [wt/vol] 트웬-20, 0.2% [wt/vol] 젤라틴, 0.45% [vol/vol] 노니데트 P 40, 60 g/mL 프로틴라제 K).
   2. 각 PCR 튜브에 5-7 개의 세라믹 비드 (직경 2mm)를 넣고 샘플을 분쇄하여 조직 분해를 수행합니다.
   3. 모든 샘플을 65°C에서 1시간 동안 배양한 다음 100°C에서 10분 간 인큐베이션한 다음 원심분리기를 간략하게 배양합니다. PCR 증폭을 위한 템플릿으로 이 상급자를 사용하십시오.
      참고: 필요한 경우 65°C에서 의 배양 시간을 늘릴 수 있습니다.
   4. 다음과 같이 PCR 반응을 준비합니다: Taq DNA 폴리머라제 1U, 10x 완충액의 2 μL(Mg^2+),dNTP 혼합물 1.6 μL(2.5 mM), 각 프라이머의 0.5 μL(각각 10 μM), 2 μL의 백색파리 조직 용해상상판, 및 이중 증류수를 총 20μl의 부피로 준비한다. 전진 프라이머 시퀀스는 5'-TTTTTTTTTTTTTTCATAGAGT-3'이고 역프라이머 시퀀스는 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCTGGA-3'입니다.
      참고: DNA가 뉴클레아제없는 물로 대체되는 부정적인 대조군과 이전에 확인된 MEAM1 흰살 파리 DNA를 가진 양성 통제가 포함되어야 합니다.
   5. 다음 사이클링 매개 변수를 사용하여 PCR을 수행하십시오 : 3 분 동안 95 °C에서 초기 변성, 30 초 동안 95 °C에서 35 사이클의 변성, 30 초 동안 50-55 °C에서 어닐링, 1 분 동안 72 °C에서 연장 한 다음 10 분 동안 72 °C로 확장하십시오.
   6. 제한 효소 Taq I로 증폭 된 제품을 소화. 이렇게하려면 소화 혼합물을 0.1 μL (1 U)의 효소, 10 x Taq I 버퍼의 1 μL, BSA 의 1 μL, 증폭 된 생성물의 5 μL 및 총 부피10 μL로 이중 증류수를 준비하십시오. 열사이클러에서 1시간 동안 65°C에서 배양합니다.
   7. 각 소화된 생성물의 5-7 μL과 1% 아가로즈 겔의 우물에 DNA 사다리(100-2,000 bp)를 적재하여 시료의 아가로즈 겔 전기 영동을 수행합니다. 그런 다음 UV 광을 사용하여 젤 문서화 기계에서 젤 적색 염색으로 DNA 밴드 크기를 관찰하십시오. 소화된 제품의 밴드 크기를 양수 대조군과 비교하여 화이트플라이 모집단의 순도를 결정합니다.
3. Agro-접종 TYLCV의 전염성 복제 (GenBank 가입 번호 AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4A) 3-4 진정한 잎 단계 토마토 식물에(솔라눔 lycopersicum L. Cv. Hezuo 903).
   1. 하나 식민지로 카나마이신 (50 μg / mL) 및 리팜피신 (50 μg / mL)을 포함하는 루리아 - 베르타니 (LB) 배지의 10 mL을 접종하십시오. OD_600이 ~1.5에 도달할 때까지 200 rpm에서 28°C에서 배양합니다.
   2. 10 분 동안 4,000 x g에서 원심 분리에 의해 농균을 수확.
   3. 200 μM 아세토시링존, 10 mM 2-(N-morpholino) 에탄 설포닉산(MES) 및 10 mM MgCl_2로구성된 10 mL의 침투 완충제에서 펠릿을 다시 일시 중단한다. 1-2 시간 동안 실온 (RT)에서 배양하십시오.
   4. 1.3.3 단계에서 혼합물을 사용하여 1 mL 바늘없는 주사기로 2-3 식물 잎을 침투시다. 26 ± 1 ° C에서 온실에서 식물을 유지합니다.
4. 약 1 개월 후, 육안 검사를 수행하고 노란색 컬 잎과 스턴트 증상을 보여주는 식물을 선택합니다.
5. 바이러스 획득을 위해 48시간 동안 TYLCV에 감염된 토마토 식물에 비-viruliferous 화이트플라이 성인을 옮니다.

2. 암컷 흰살파리의 해부 및 미드거트, 1차 침샘(PSG), 난소 및 헤모림프의 회수

1. 포부를 사용하여 흰파리를 수집한 다음 얼음 위에 올려 놓아 혼수상태에 넣습니다. 현미경 슬라이드에 1x PBS (인산 완충 식염수) 버퍼를 추가 한 다음 스테레오 현미경으로 해부를 위해 1x PBS 버퍼에 흰 파리를 놓습니다.
   1. 미드구트 해부를 위해 흰파리의 복부를 부수고 미세한 침술 바늘 (직경 0.25mm)을 사용하여 미드가트를 꺼냅니다. 1x PBS를 깨끗하게 하기 위해 미드가트를 옮김을 옮김.
   2. PSG 해부를 위해, 등쪽에서 머리 근처 흉부에 있는 흰살파리의 몸을 부수세요. 다음으로, 흰살을 고치기 위하여 흉부로 바늘을 삽입하고, 2개의 침샘이 바디에서 분리될 때까지 흰파리를 흔들기 위하여 다른 바늘을 이용하십시오. 그런 다음 PSG를 1x PBS로 청소합니다.
   3. 난소 해부를 위해 흰파리의 복부를 완전히 부수고 바늘을 사용하여 난소를 다른 조직과 분리하십시오. 그런 다음 파이펫팅으로 과도한 조직을 제거하십시오.
   4. hemolymph 수집의 경우 현미경 슬라이드에 10 μL의 PBS 버퍼를 추가한 다음 버퍼에 흰파리를 놓습니다. hemolymph를 얻으려면 미세 침술 바늘을 사용하여 복부의 구멍을 부드럽게 찢고 복부를 약간 눌러 혈림프를 완충제로 풀어 냅니다. 헤모 림프 샘플로서 액체의 8 μL을 수집합니다.

3. 면역형광에 의한 백플라이 미드구트, 원발성 타액선 및 난소에서 TYLCV의 국소화

참고 : 미드 구트에서 TYLCV의 국소화 절차가 예로 제시된다. 이 방법은 PSG 및 난소에 사용할 수 있습니다.

1. 2.2.1단계에서 기재된 바와 같이 TBS 완충액(10 mM Tris-HCl, 150 mM 염화나트륨, pH=7.5)에서 미드거트를 해부한다. 15-20 개의 흰파리 미드거트를 모아 유리 페트리 접시 (직경 3.5cm)로 옮은 다음 과도한 결핵 완충제를 제거하십시오.
2. 4% 파라포름데히드 1 mL를 추가하여 실온에서 2시간 동안 미드구트를 고정한 다음 고정 용액을 제거합니다. 피펫을 천천히 3x TBS로 2분 동안 세척합니다.
3. 0.5% 트리톤 X-100의 1 mL에서 30 분 동안 투과하여 미드거트를 배양합니다. 이어서 투과액을 제거하고 3.2단계에서 설명한 대로 TBST(1x TBS와 0.05% 트웬20)로 미드거트를 3x 세척한다.
4. 1% BSA (TBST에서 제조 된 소 혈청 알부민)의 1 mL을 추가하여 중거트를 차단합니다. RT에서 2시간 동안 차단 단계를 수행한 다음 차단 용액을 제거하고 TBST에서 미드거트를 3x 세척합니다.
5. 1차 항체(TYLCV 코트 단백질에 대한 MAb 1C4)를 TBST^24로 1:400에서 희석하고 용액을 페트리 접시에 추가하여 미드구트를 담급니다. 어둠 속에서 밤새 4 °C에서 배양하십시오. 1차 항체 용액을 버리고 TBST에서 3x를 세척합니다.
6. TBST로 1:400에서 이차 항체(항 마우스)를 희석하고 페트리 접시에 용액을 첨가하여 미드구트를 담급니다. 어둠 속에서 RT에서 2 시간 동안 접시를 배양하십시오. 이차 항체 용액을 버리고 TBST에서 미드구트를 3배 세척합니다.
7. 명확한 현미경 슬라이드에 midguts를 전송합니다. 가능한 한 슬라이드에서 TBST를 흡인합니다. DAPI 1 방울(4', 6-디아미디노-2-페닐린돌, 디하이드로클로라이드)을 추가하여 핵을 염색한 다음 커버슬립을 넣고 매니큐어로 밀봉합니다. 공초점 현미경으로 검사하십시오.

4. 화이트플라이 미드구트, 1차 침샘, 헤모림프 및 qPCR을 가진 난소에서 TYLCV의 정량화

1. 위에서 설명한 바와 같이 1x PBS에서 흰파리 미드거트, PSG, 헤모림프 및 난소를 해부한다.
2. 중거트, PSG, 혈림프 및 난소의 DNA를 추출합니다.
   1. 해부 후, 중거트, PSG 및 난소를 깨끗하게 1x PBS 완충액 2-3x로 씻으세요.
   2. 1x PBS의 5 μL에서 20개의 미드거트 또는 20개의 PSG를 수집하고 25 μL 용해액으로 옮김. 1x PBS의 5 μL에서 각 난소를 옮김을 개별적으로 25 μL 용해액으로 옮김.
   3. 1.2.2단계에서 설명한 대로 미드거트, PSG 및 난소 샘플을 분쇄합니다.
   4. 1x PBS로 8 μL의 헤모림프를 PCR 튜브에 수집한 다음 10 μL의 용해 액을 추가합니다. 철저히 섞으세요.
3. 1.2.3에 기재된 바와 같이 모든 샘플에서 DNA를 추출한다.
4. 다음과 같이 TYLCV 및 내부대조군(β-actin gene)에 대해 2개의 별도의 qPCR 마스터 믹스(18 μL 각)를 준비합니다: SYBR 그린 믹스의 10 μL, 각 프라이머의 0.8 μL(각 10 μM), 및 반응당 이중 증류수 6.4 μL. TYLCV에 대 한, 앞으로 프라이머 시퀀스는 5′-GAAGCGACCAGGATATAA-3′ 역 프라이머 시퀀스는 5′-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3′. β-액틴의경우, 전방 프라이머 서열은 5′-TCTTCCAGCCTTTG-3′이고 역프라이머 서열은 5′-CGGTGATTTTCTTGCATT-3′이다.
5. 마스터 믹스의 18 μL을 qPCR 스트립 튜브 또는 96 웰 플레이트의 바이알에 분배합니다. 그런 다음 DNA 샘플의 2 μL을 각 바이알에 추가합니다. 적어도 3개의 기술적 복제및 3개의 생물학적 복제물로 모든 반응을 수행한다.
   참고: 4.5단계는 얼음 위에 두어야 합니다.
6. qPCR 튜브를 닫거나 접착제 플레이트 씰로 96 웰 플레이트를 밀봉하십시오.
7. 원심분리기는 qPCR 튜브 또는 96 웰 플레이트의 바닥에 있는 액체를 수집한다.
8. 튜브 또는 플레이트를 실시간 열 사이클러에 넣고 qPCR을 수행합니다.
   1. 다음 사이클링 파라미터를 사용하여 qPCR을 수행: 30초에 95°C, 프라이머 어닐링 및 연신을 위한 34s의 경우 95°C의 40 사이클, 15초동안 95°C에서 1사이클, 60°C ~ 95°C의 용융 곡선 단계로 종료 15s당 0.5 °C의 증분.
   2. SYBR을 형광소염료로 선택하고 샘플 유형으로 알 수 없음을 선택합니다.
9. 정량적 데이터를 스프레드시트 형식으로 내보내고 2^−ΔΔCT 방법^28을통해 바이러스 DNA의 상대적 양을 분석합니다.

결과

B. 타바치 복합체 및 TYLCV의 MEAM1 흰파리는 절차를 설명하기 위해 여기에 예로 사용되었다. 본 원고에 기재된 면역형광 및 바이러스 정량화 절차의 개요는 도 1에나타내고 있다. 도 2는 PSGs, midguts 및 난소에서 TYLCV 및 DAPI 염색의 면역 형광 검출의 대표적인 결과를 나타내며, TYLCV가 PSG 및 midguts에서 더 많이 축적되고 난소에서 덜 축적되었음을 나타?...

토론

여기서 우리는 면역형광 및 qPCR에 의한 백비행 벡터의 조직에서 베고모바이러스의 국소화 및 정량화를 위한 프로토콜을 기술한다. 해부는 흰파리 조직에서 바이러스를 현지화하고 정량화하는 첫 번째 단계를 나타냅니다. 화이트플라이 몸체는 길이가 약 1mm이며, 이는 조직이 매우 작으며 해부하기가 어렵습니다. 게다가, 조직 사이 강한 연결이 있습니다. 예를 들면, 난소는 박테리오시테와 단단히...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	MultiSciences	F0001
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Abcam	ab104139
Bovine Serum Albumin (BSA)	MultiSciences	A3828
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-RAD	185-5201
Confocal microscopy	Zeiss	LSM800
Dylight 549-goat anti-mouse	Earthox	E032310-02	Secondary antibody
Monoclonal antibody (MAb 1C4)			Primary antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sangon Biotech	B548119-0500
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)	TaKaRa	RR820A	qPCR master mix
Thermocycler	Thermofisher	A41182
Tissuelyzer	Shaghai jingxin	Tissuelyser-48
Triton-X-100	BBI life sciences	9002-93-1
Tween 20	BBI life sciences	9005-64-5