Test (Neo) adjuvan Tedaviler için İntam Rezeke Yumuşak Doku Sarkomu Bir Fare Modeli

Özet

Bu protokolde, yumuşak doku sarkomunun (neo) adjuvan tedavileri test etmek için tamamlanmamış cerrahi rezeksiyonunun fare modelini tanımladık.

Özet

Cerrahi genellikle birçok katı tümörler için ilk tedavi yöntemidir. Ancak adjuvan veya neo-adjuvan tedavilere rağmen primer tümör rezeksiyonu sonrasında lokal nüksler sıklıkla ortaya çıkar. Bu cerrahi marjları yetersiz tümöriçermeyen oluşur, artık kanser hücreleri ile sonuçlanan. Biyolojik ve immünolojik açıdan bakıldığında, cerrahi boş bir olay değildir; yara iyileştirici ortamın hem pro- hem de anti-tümörijenik yolları indüklemesi bilinmektedir. Sonuç olarak, lokal nüksetmeyi önlemeye yönelik ilaç gelişimi için preklinik modeller, cerrahi ile tedavi edilen hastalarda klinik ayarları modellemek için yeni (neo) adjuvan tedavileri test ederken cerrahi rezeksiyonu da içine almalıdır.

Burada, bir yara iyileşmesi yanıtı ayarında (neo)adjuvan tedavilerin test edilmesine olanak sağlayan WEHI 164 yumuşak doku sarkomu eksik cerrahi rezeksiyon bir fare modeli açıklayın. Bu modelde, tümörün%50 veya %75'i çıkarılır, klinik ortamda ameliyat sonrası brüt kalıntı hastalığı nı modellemek için bazı kanser dokusu nu yerinde bırakır. Bu model aynı zamanda yara iyileşme yanıtı göz önünde bulundurularak cerrahi bağlamında test tedavileri sağlar, hangi etkinliğini etkileyebilir (neo)adjuvan tedaviler. Eksik cerrahi rezeksiyon, adjuvan tedavi nin yokluğunda tüm farelerde tümörün tekrarlanabilir şekilde yeniden büyümesi ile sonuçlanır. Kontrol noktası ablukası ile adjuvan tedavi tümör regrowth azaltılmış sonuçlanır. Bu model böylece debulking cerrahi ve ilişkili yara iyileşme yanıtı bağlamında terapiler test etmek için uygundur ve katı kanser diğer türleri için uzatılabilir.

Giriş

Cerrahi birçok katı tümörler için ana tedavi seçeneği olmaya devam etmektedir¹, yumuşak doku sarkomu dahil^2,3. Kanser cerrahisi teknikleri gelişmelere rağmen, ve kombinasyonları ile (neo)adjuvan tedaviler, hala kanser nüks ve metastaz primer tümör rezeksiyonu aşağıdaki yüksek bir risk var^4,5. Yumuşak doku sarkomunda, nüksler özellikle lokoregionally, cerrahi yerinde meydana gelir ve morbidite ve mortalite artar. Klinik ortamda, yeterince geniş marjları elde etmek zor olabilir (örneğin, anatomik kısıtlamalar nedeniyle), eksik rezeksiyon ve sonraki tümör nüks neden⁶. Cerrahi stres ve yara iyileşme sonraki süreci tümör nüks için uygun bir immünsupresif tümör mikroenvironment oluşturmak için bilinmektedir^7,8. Bu nedenle, yumuşak doku sarkomu için yeni tedavilerin keşfi ve geliştirilmesi, özellikle immünoterapiler, ideal olarak cerrahi yara iyileşme yanıtı dikkate almalıdır.

Adjuvan tedaviler için en preklinik çalışmalar başlangıçta cerrahi stres ve yara iyileşme yanıtı dahil olmadan, subkutan singenik veya ksenotransplante fare modelleri kullanılarak yapılır^9,10. Bu nedenle, eksik cerrahi rezeksiyon içeren bir sinjenik deri altı fare yumuşak doku sarkom modeli geliştirdik. WEHI 164 fibrosarkom hücreleri subkutan olarak aşılanır ve tümörler oluşturulduktan sonra tümör kütlesinin %50-75'ini çıkarıyoruz(Şekil 1A-E). Tümörler sürekli olarak kalan tümörden yeniden büyürler. Bu model cerrahi stres ve yara iyileşmesi nin etkisini göz önünde bulundurarak adjuvan tedavilerin test edilmesine olanak sağlar. Eksik rezeksiyon benzer cerrahi modeller çeşitli gruplar tarafından çalışmalarda bir dizi kullanılan ve tekrarlanabilir ve etkili olduğu bulunmuştur^11,12,13. Burada, bu protokolün ayrıntılı bir açıklamasını sağlar.

Protokol

Bu deneylerde kullanılan hayvanlar Hayvan Kaynakları Merkezi'nden (Perth, Batı Avustralya) elde edilmiştir. Hayvanlar, Harry Perkins Tıbbi Araştırma Biyokaynakları Kuzey Tesisi'nde (Perth, Batı Avustralya) standart patojensiz koşullar altında muhafaza edildi. Tüm deneyler, Harry Perkins Tıbbi Araştırma Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanan protokol sonrasında yapılmıştır. Bu deneylerde 8-12 haftalık BALB/c fareler kullanılmıştır. WEHI 164 fibrosarkom hücre hattı CellBank Avustralya (Westmead, NSW) elde edildi.

1. Hücrelerin aşılanması

1. Hücre ve hayvanların hazırlanması
   1. Hücre hattının önerilen ortamda tutulmasından emin olun. Örneğin, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 orta 2 mM L-glutamin, 10% fetal sığır serumu, 20 mM HEPES, 0.05 mM 2-mercaptoetanol, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomycin ile takviye wehi 164 hücre hattı korumak.
      NOT: Gebe hücreler kriyojenik depodan çıkarıldıktan sonra en az 3 ve en fazla 5 kez. Optimum hücre canlılığı sağlamak için, hücreler% 70-80 arasında konfluent olduğunda bölünmelidir. Tümör hücre hatları mikoplazma için test edilmelidir, enfeksiyon hücre büyümesini değiştirebilir ve in vivo bağışıklık yanıtını etkileyebilir gibi.
   2. Aşılamadan bir gün önce, sağ alt kanadında ki fareleri makas kullanarak tıraş edin.
      NOT: Bu deneyde 8-12 haftalık, normal kiloda (16 -22 gram) dişi BALB/c fareler kullanılmıştır.
   3. Aşılama gününde WEHI 164 hücrelerini %70-80 oranında trypsinizasyon la kapladığında hasat edin.
      1. Doku kültürü şişelerinden kültür ortamıaspire ve sonra steril fosfat tamponlu çözelti (1x PBS) ekleyin, fetal sığır serum (FBS) kalan izlerini kaldırmak için.
      2. Doku kültürü şişelerinden PBS aspire. %0,05 tripsin (T75 şişesi için) 3 mL ekleyin ve sonra şişeyi hücreli şişenin tüm yüzeyinin tripsin ile kaplanması için döndürün.
      3. Şişeyi 37 °C'de, %5 CO₂ kuluçka makinesinde 3 dk.
      4. Hücre kültürü kuluçka gelen şişeleri çıkarın ve trypsin nötralize FBS ile desteklenen medya 5 mL ekleyin.
         NOT: Bu hücrelere zarar verebilir ve düşük hücre canlılığı yol açabilir gibi, gerekli daha uzun tripsin hücreleri bırakmayın.
      5. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için pipet süspansiyonu birden çok kez. Hücre süspansiyonu konik santrifüj tüpüne aktarın.
      6. 3 dk için 350 x g iplik tarafından pelet hücreleri.
   4. Hücreleri 1x PBS'de üç kez yıkayın.
      1. Steril 1x PBS 50 mL hücreleri resuspend ve yukarı ve aşağı hücre süspansiyon pipetleme hücreleri yıkayın. 3 dk için 350 x g iplik tarafından pelet hücreleri.
      2. Steril 1x PBS'nin 15 mL'inde süpernatant ve resuspend hücreleri aspire edin. Hücre süspansiyonuna boru ile tutarak hücreleri yıkayın. 3 dk için 350 x g iplik tarafından pelet hücreleri.
      3. Steril 1x PBS'nin tam 10 mL'inde süpernatant ve resuspend hücreleri aspire edin. 1.1.4.2'deki gibi hücreleri yıkayın ve az miktarda (yaklaşık 100 μL) hücre süspansiyonunu saymak için bir santrifüj tüpüne aktarın. 3 dk için 350 x g iplik tarafından pelet hücreleri.
   5. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak Trypan mavi dışlama yöntemini kullanarak hücre numarasını belirleyin. Steril 1x PBS'deki hücreleri 5 x 10⁶ hücre/mL konsantrasyonda yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna buz da tut.
      NOT: Tekrarlanabilir tümör büyümesini sağlamak için tümör hücrelerinin canlılığı %80'in üzerinde olmalıdır.
2. Deri altı aşısı
   1. Hücre süspansiyonuna iyice karıştırın ve steril 1x PBS'de 100°L hücre süspansiyonu (5 x 10⁵ hücre) ile 26 G iğneile şırınga doldurun. Bir sonraki şırıngayı yüklemeden önce hücrelerin karıştırılması tekrarlayın.
      NOT: Canlılığı korumak için işlem boyunca hücreleri buzüzerinde tutun.
   2. Fareyi uygun şekilde dizginler ve sağ alt kanadına erişimi sağlar. Fareyi alttan sol kanatta aşılama.
      NOT: İğneyi hafifçe kaldırarak aşının peritonda olmadığından emin olun, deri altında görülmelidir. Aşılamadan sonra derinin altında kabarcık benzeri bir yumru oluşmalıdır.
   3. Fareleri ilgili etik onayı gerektirdiği şekilde izleyin ve tümörler yaklaşık 50 mm²boyutuna büyüdüğünde cerrahi rezeksiyon yapın.

2. Tümörün parsiyel cerrahi rezeksiyonu

NOT: Bu protokol İkİ araştırmacı gerektirir; biri cerrahi işlemler (CERRAH) ve diğeri fare izleme (ASSISTANT) için.

1. Cerrahi kurulum
   1. Gün 12 post aşılama, tümörler yaklaşık 50 mm²boyutuna ulaştığında, 100 μL (0.1 mg /kg) buprenorfin s.c. ile doz fareler boyun scruff içinde, ameliyattan 30 dakika önce.
   2. Tezgah kat ile kaplı bir ısı yastığı ile cerrahi alan kurmak ve anestezi için bir burun konisi kurmak. Kullanmadan önce cerrahi araçları sterilize edin ve her hayvan arasında bir ısı boncuk sterilizatör kullanarak, araçları kullanmadan önce soğumasını sağlar. Aşağıdaki cerrahi ekipmanı temiz ve kolay ulaşılabilecek bir yerde bulunur: klorheksidin, bez, gazlı bez, göz jeli, iki kavisli çözgü, makas, klips aplikatör, klip sökücü, klips dolumları(Şekil 2A, 2B).
   3. Isıtma haznesini 37 °C'ye ısıtın ve geri kazanım için başka bir ısı yastığı ayarlayın(Şekil 2C). Sterilize edilmiş aletleri otoklavpedler gibi steril bir yüzeye yerleştirin.
2. Anestezi
   1. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve fareyi %4 izofluran (%100 oksijende %4 1 L/dk akış hızında% 4 oksijen) ile anestezi edin, ta ki solunum hızı dakikada yaklaşık 60 nefese (saniyede 1) yavaşlayana kadar (bu genellikle <1 dk).
      NOT: Fareyi boğulma ve ölüme yol açabileceği sürece odada çok uzun süre bırakmayın. Aynı anda anestezi altında sadece bir fare var.
   2. Fareyi ameliyat masasındaki ısı yastığına aktarın, burnu burun koniile fareyi yerleştirin ve anestezi durumunu %100 oksijende %100 oksijenle 0,5 L/dk. Anestezi derinliğinin korunmasını sağlamak için nefes alma hızını izleyin.
      NOT: YARDIMCI anestezinin doğru düzeyde tutulmasını sağlamak için ameliyat boyunca farenin nefesini izlemelidir. Nefes alma çok yavaş olursa anestezi konsantrasyonu düşürün veya anestezi derinliği çok sığ ise konsantrasyonu artırmak. Fare nefes almaya başlarsa, fareyi burun konisinden çıkarın, anestezi konsantrasyonunu azaltın ve burun konisini tekrar koymadan önce nefes inin normale dönmesini bekleyin.
   3. Farenin ameliyata başlamadan önce tamamen anestezi olduğundan emin olmak için "çimdik testi" ve "kornea refleks testi"¹⁴ yapın.
      NOT: Farenin herhangi bir bölümünün hareketi, farenin tam olarak anestezili olmadığının bir göstergesidir. Anestezi konsantrasyonu artırılarak hayvana hemen ek anestezi verilmelidir.
   4. Göz kuruluğu önlemek için göz kuruluğu az miktarda göz ile farenin gözlerini kaplayın.
3. Cerrahi işlem (CERRAHİ)
   1. Cerrahi bölgeyi alkollü klorheksidin le 3 kez temizler. Forceps ve makas bir çift kullanarak, dorsal tarafı boyunca 1 cm düz kesi yapmak, tümörden 3 mm uzaklıkta(Şekil 3A, 3B).
      NOT: Kesinin her farede 1 cm'ye kadar standartlaştırılması (cetvel kullanarak) fareler arasındaki yara iyileşmesinin bile değerlendirilmesine olanak sağlar. Kesinin tümörden 3 mm uzakta bulunması, yaradan sızmadan sonraki intratümöral adjuvan tedaviye olanak sağlar.
   2. Cımbız kullanarak, tümör ve periton arasında facia ve deri altı yağ dokusu çekin. Deri altı tümör normalde deri tarafına takılır.
   3. Yarayı, cımbız kullanarak tümörün yan tarafındaki deriyi hafifçe tutarak açın ve tümörü dışarıda görülebilmesi için "ters çevirin"(Şekil 3C, 3D).
      NOT: Tümörün debulked edilecek bölümü, yarayı kapatmak için yeterli cilde sahip olmak için açıklığa en yakın olmalıdır. Tümörü çıkarırken cildi kesmemeye dikkat edin.
   4. Makas bir çift kullanarak, kaldırmak için yarısından tümör kapsülü kesip, açılışa en yakın tümörün tabanından başlayarak.
   5. %50 debulk cerrahisi için, tümörün ortasından kes. Kavisli forceps kullanarak, tümör ünkikini çıkarılacak kısmı kepçe (%50);
   6. %75 debulk için, yukarıdaki bölüm 2.3.5 olarak% 50 tümör debulk gerçekleştirin. Daha sonra tümörün kalan % 50'sinin yarısını kesip tümörün %25'ini kepçelerler, yukarıda açıklandığı gibi kavisli forcep'ler kullanarak.
4. Cerrahi alanın kapatılması
   1. Kalan tümörü derinin altına geri yerleştirin ve forceps kullanarak deri fleplerini bir araya getirin ve yara boyunca deriyi hizalayın.
   2. Yaranın kenarından 5 mm kadar deriyi bir arada tutun ve çersepse en yakın olan taraftan başlayarak yarayı kapatmak için cerrahi klipsler kullanın. Hiçbir altta yatan doku maruz olduğundan emin olmak için gerektiği kadar klips uygulayın. Genellikle, klipsler arasında 2 mm boşluklar ile üç ila dört klips uygulanır.
      NOT: Herhangi bir klip iyi uygulanmazsa, klip sökücü kullanarak çıkarın ve yeni klipler ile değiştirin.
5. Farelerin kurtarılması (YARDIMCI)
   1. Farelerin ılık (37 °C) ısıtma odasına koyarak toparlanmalarına izin verin.
   2. Farenin kafesini ısı yastığına yerleştirin. Onlar anestezi (uyanık ve yürüyüş) kurtarıldı ve daha sonra kafesiçine fareler geri koymak kadar ısıtma odasında fareler izleyin. Fareler daha aktif hale gelene kadar kafesi ısı yastığında 10 dakika daha bekletin.
   3. Farelere ıslak ve yumuşak yiyecekler verin. Kurtarma için ameliyattan 1 saat sonra fareleri izleyin ve klipslerin yerinde kalmasını sağlayın. Hayvanların gözetimsizken sıcaklığı kendi kendine düzenlemelerine izin vermek için kafesin ısı yastığının yarısı açık/yarım olduğundan emin olun.
   4. 0.1 mg/kg buprenorfin (boyun scruffin 100 μL subkutan), ameliyattan sonra 6-8 saat (günün sonunda) ile doz fareler. Fareleri ertesi sabah erken saatlerde izleyin ve fareleri tekrar 0.1 mg/kg buprenorfin (boyun scruff'unda 100 μL subkutan olarak) doza. Gerektiği gibi daha fazla ıslak gıda verin.
   5. Önümüzdeki yedi gün boyunca fareleri her gün izleyin. Klipsöküc kullanılarak klipler yedi gün sonra kaldırılabilir.
6. Adjuvan veya neoadjuvan tedavi
   1. Fareleri herhangi bir zamanda (neo)adjuvan tedavi ile perioperatif olarak tedavi edin, ilgi tedavisine bağlı olarak.
   2. Örneğin, aşıdan sonra 15 gün boyunca 100 μg anti-CTLA-4 intraperitoneally (yani) veya aşılama dan sonra 15, 17 ve 19.
7. Deneysel kontroller
   1. Bu modeli inflamasyon/yara iyileşmesinin etkilerini değerlendirmek için kullanırken, aşağıdaki kontrol gruplarını kullanmayı düşünün: 1) Ameliyatsız kontrol (tedaviler hala intratümörel olarak uygulanabilir); 2) Sham cerrahi kontrolü: Deride cerrahi kesi yapılır; tümör manipüle edilir ve maruz kalır, ancak tümör dokusu çıkarılır; yara klipslerle kapatılır.

Sonuçlar

50 mm² boyutunda tümör büyümesi kısmi debulk için ideal bir boyut. 50 mm² tümörün tamamlanmamış cerrahi rezeksiyonu adjuvan immünoterapi yokluğunda tümörlerin %100 (n=5) tekrarlanabilir rebüyüme ile sonuçlanır(Şekil 4A). Daha sonra modeli kontrol noktası molekülleri Sitotoksik T Lenfosit İlişkili Protein 4 (CTLA-4) ve Programlı Ölüm Reseptörü 1 (PD-1) karşı antikorlar kullanarak adjuvan imm...

Tartışmalar

Biz perioperatif tedavileri test etmek için yumuşak doku sarkomu eksik cerrahi rezeksiyon bir fare modeli için bir protokol sağlar. Ayrıca tedavi sonrası fareler arasında yara iyileşmesinin değerlendirilmesine olanak sağlamak için cerrahi kesi standardize edildi.

Tümör yerleşimi bu protokolün önemli bir parçasıdır. Biz fareler üzerinde en az yük ile tümör bölgesi ve lokal tedavilerin uygulanması kolay cerrahi erişim sağlamak için bir deri altı tümör modeli tercih...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 gauge 0.5 mL insulin syringe	Becton Dickinson, Australia	326769	None
2-Mercaptoethanol	Life Technologies Australia Pty Ltd	21985023	None
Anaestetic gas machine	Darvall Vet, Australia	SKU: 2848	None
Anti-CTLA-4	BioXcell, USA	BE0164	None
Anti-PD-1	BioXcell, USA	BP0273	None
Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL	RB healthcare UK Limited, UK	55175	Prescription order
Chlorhexidine Surgical Scrub 4%	Perigo Australia, Australia	CHL01449F(scrub	None
Fetal Bovine serum	CellSera, Australia	AU-FBS-PG	None
Forceps Fine 10.5 cm	Surgical house, Western Australia	CC74110	None
Forceps Fine 12 cm Serrated	Surgical house, Western Australia	CC74212	None
Forceps Halsted 14 cm	Surgical house, Western Australia	CD01114	None
Heating chamber	Datesand Ltd, UK	Mini-Thermacage	None
HEPES (1M)	Life Technologies Australia Pty Ltd	15630080	None
Isoflurane	Henry Schein Animal Health, Australia	SKU: 29405	Prescription order
Lubricating Eye Ointment	Alcon	n/a	None
Penicillin/streptomycin 1000X	Life Technologies Australia Pty Ltd	15140122	None
Phosphate Buffered Solution 10x	Life Technologies Australia Pty Ltd	70013-032	None
Reflex 7mm Clips	Able scientific, Australia	AS59038	None
Reflex 7mm Wound Clip Applicator	Able scientific, Australia	AS59036	None
Reflex Wound Clip Remover	Able scientific, Australia	AS59037	None
Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit	Darvall Vet, Australia	#7885	None
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine	Life Technologies Australia Pty Ltd	21870092	None
Scissors Iris STR 11 cm	Surgical house, Western Australia	KF3211	None
Scissors Iris STR 9 cm	Surgical house, Western Australia	JH4209	None
Small Induction Chamber	Darvall Vet, Australia	SKU: 9630	None
TrypLE express 1x	Life Technologies Australia Pty Ltd	12604-021	None