시험을 위해 불완전하게 절제술된 연조직 육종의 마우스 모델(Neo) 보조 요법

요약

이 프로토콜에서, 우리는 테스트 (네오) 보조 요법을위한 연조직 육종의 불완전한 수술 절제술의 마우스 모델을 설명합니다.

초록

수술은 종종 많은 고형 종양에 대한 첫 번째 치료입니다. 그러나, 국소 재발은 보조 또는 신 보조 요법에도 불구하고 1 차적인 종양 절제술 다음 수시로 생깁니다. 이것은 외과 마진이 불충분하게 종양이 없는 때, 잔류암세포의 결과로 생깁니다. 생물학적 및 면역학적 관점에서 수술은 무효 이벤트가 아닙니다. 상처 치유 환경은 프로 종양 유발 경로를 유도하는 것으로 알려져 있다. 결과적으로, 국소 재발방지를 위한 약물 개발을 위한 전임상 모델은 새로운 (neo) 보조 요법을 테스트할 때 외과 적 절제술을 통합하여 수술로 치료받은 환자의 임상 설정을 모델링해야 합니다.

여기서, 우리는 상처 치유 반응의 설정에서 (네오) 보조 요법의 테스트를 허용하는 WEHI 164 연조직 육종의 불완전한 수술 절제술의 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델에서는 종양의 50% 또는 75%가 제거되어 임상 환경에서 수술 후 총 잔류 질환을 모델링하기 위해 일부 암 조직을 남겨두고 있습니다. 이 모델은 또한 상처 치유 반응을 고려하는 동안 수술의 맥락에서 치료를 테스트 할 수 있습니다, 이는 (네오) 보조 치료의 효능에 영향을 미칠 수 있습니다. 불완전한 외과 절제술은 보조 요법의 부재에 있는 모든 마우스에 있는 종양의 재현가능한 재생결과. 체크포인트 봉쇄를 가진 보조 치료는 감소된 종양 재성장을 초래합니다. 이 모형은 이렇게 수술 및 그것의 관련인된 상처 치유 반응의 맥락에서 치료를 시험하기 위하여 적적합하고 고형암의 그밖 모형으로 확장될 수 있습니다.

서문

수술은 연조직 육종^2,3을포함하여 많은 고형 종양^1에대한 주요 치료 옵션으로 남아 있다.^, 암 수술 기술의 개선에도 불구하고(neo)보조 요법과의 조합, 1차 종양 절제술^4,,5에이어 암 재발 및 전이의 위험이 여전히 높다. 연조직 육종에서는 재발이 수술 현장에서 특히 로코리토리적으로 발생하여 이환율과 사망률이 증가합니다. 임상 설정에서, 충분한 마진(예를 들어, 해부학적 제약으로 인한)을 얻기 어려울 수 있으며, 불완전한 절제술과 후속 종양 재발^6의결과로. 수술적 스트레스와 상처 치유의 후속 과정은 종양 재발에 유리한 면역 억제 종양 미세 환경을 조성하는 것으로 알려져 있다^7,,8. 따라서 연조직 육종, 특히 면역 요법을 위한 새로운 치료법의 발견 및 개발은 외과 적 상처 치유 반응을 이상적으로 고려해야합니다.

보조 요법에 대한 대부분의 전임상 연구는 처음에는 수술 스트레스 및 상처 치유 반응을 통합하지 않고 피하 합성 또는 xenotransplant 마우스 모델을 사용하여 수행된다^9,,10. 따라서 불완전한 수술 절제술을 통합한 합성 피하 마우스 연조직 육종 모델을 개발했습니다. WEHI 164 섬유육종 세포는 피하로 접종되고 종양이 확립되면 종양 벌크의 50-75 %를 제거합니다(도 1A-E). 종양은 지속적으로 나머지 종양에서 다시 증가. 이 모델은 외과 스트레스와 상처 치유의 효과를 고려하면서 보조 요법을 테스트 할 수 있습니다. 불완전한 절제술의 유사한 외과 모형은 몇몇 단에 의하여 연구의 수에서 이용되고 재현가능하고 효과적인 것으로 나타났습니다^11,,12,,13. 여기에서이 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

프로토콜

이 실험에 사용된 동물은 동물 자원 센터 (퍼스, 웨스턴 오스트레일리아)에서 수득되었다. 동물은 의학 연구 생물 자원 노스 시설의 해리 퍼킨스 연구소 (퍼스, 웨스턴 오스트레일리아)에서 표준 병원체없는 조건하에서 유지되었다. 모든 실험은 의학 연구 동물 윤리위원회의 해리 퍼킨스 연구소에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다. 이 실험에서 8-12주 생의 BALB/c 마우스가 사용하였다. WEHI 164 섬유육종 세포주체는 셀뱅크 오스트레일리아(웨스트미드, 뉴사우스웨일즈)로부터 입수되었다.

1. 세포의 접종

1. 세포와 동물의 준비
   1. 셀라인이 권장 된 매체에서 유지되는지 확인합니다. 예를 들어, 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 1640 배지에서 WEHI 164 세포주를 유지하여 2mM L-글루타민, 10% 태아소 세럼, 20mMHEPES, 0.05mMMMMMMMM, 0.05mMMM 2-mercaptoethanol, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/stl/ml.ml.ml.을 유지합니다.
      참고: 극저온 저장에서 제거된 후 적어도 3회 및 최대 5회 까지의 통로 세포. 최적의 세포 생존가능성을 보장하기 위해 70-80% 컨할 때 세포를 분할해야 합니다. 종양 세포주 마이코플라즈마에 대 한 테스트 해야 합니다., 감염 세포 성장을 변경 하 고 생체 내 면역 반응에 영향을 미칠 수 있습니다.
   2. 접종 하루 전에, 클리퍼를 사용하여 오른쪽 아래 측면에 마우스를 면도.
      참고: 여성 BALB/c 마우스, 사이 세 8-12 주, 정상 무게의 (16-22 그램) 이 실험에서 사용 되었다.
   3. 접종 당일, 트립시화에 의해 70-80% 컨럭물 때 WEHI 164 세포를 수확하십시오.
      1. 조직 배양물플라스크로부터 배양 배지를 흡인한 다음 멸균 인산완충액(1x PBS)을 추가하여 태아 소 혈청(FBS)의 남은 흔적을 제거한다.
      2. 조직 배양 플라스크에서 PBS를 흡인. 0.05% 트립신 3mL(T75 플라스크용)를 추가한 다음 플라스크를 소용돌이쳐 세포가 있는 플라스크의 전체 표면이 트립신으로 덮이도록 합니다.
      3. 플라스크를 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 3분 동안 배양합니다.
      4. 세포 배양 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 트립신을 중화하기 위해 FBS로 보충 된 5 mL의 미디어를 추가하십시오.
         참고: 세포를 손상시키고 셀 생존 가능성이 낮을 수 있기 때문에 필요한 것보다 더 오래 트립신에 세포를 두지 마십시오.
      5. 파이펫 서스펜션은 단일 셀 서스펜션을 얻기 위해 여러 번. 세포 현탁액을 원심 분리튜브로 옮는다.
      6. 3 분 동안 350 x g에서 회전하여 펠릿 셀.
   4. 1x PBS에서 셀을 세 번 씻으시면 됩니다.
      1. 멸균 1x PBS의 50mL에서 세포를 재중단하고 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 세포를 세척합니다. 3 분 동안 350 x g에서 회전하여 펠릿 셀.
      2. 15mL의 멸균 1x PBS에서 초신을 흡인하고 세포를 재분리한다. 셀 서스펜션을 위아래로 배관하여 셀을 세척합니다. 3 분 동안 350 x g에서 회전하여 펠릿 셀.
      3. 수퍼내티드를 흡인하고 정확히 10mL의 멸균 1x PBS에서 세포를 재분리한다. 1.1.4.2 단계에서와 같이 세포를 세척하고 셀 현탁액의 소량(약 100 μL)을 계산을 위한 원심분리기 튜브로 이송한다. 3 분 동안 350 x g에서 회전하여 펠릿 셀.
   5. 혈전계 또는 자동 셀 카운터를 사용하여 Trypan 블루 제외 방법을 사용하여 셀 번호를 결정합니다. 멸균 1x PBS에서 세포를 5 x 10⁶ 셀/mL 농도로 재중단합니다. 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
      참고: 종양 세포의 생존력은 재현 가능한 종양 성장을 보장하기 위해 동일하거나 80% 이상이어야합니다.
2. 피하 접종
   1. 셀 서스펜션을 철저히 혼합하고 멸균 1x PBS에서 100 μL의 세포 현탁액(5 x 10⁵ 셀)을 26G 바늘로 주사기를 채우십시오. 다음 주사기를 로드하기 전에 셀의 혼합을 반복합니다.
      참고: 생존력을 유지하기 위해 시술 내내 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
   2. 마우스를 적절히 억제하여 오른쪽 아래 측면에 접근할 수 있도록 합니다. 면도된 오른쪽 아래 측면에 마우스를 피하합니다.
      참고: 피부 밑에 볼 수 있어야 하는 바늘을 약간 들어 올려 서 접종이 복막에 있지 않은지 확인하십시오. 거품 같은 덩어리는 접종 다음 피부 아래에 형성되어야한다.
   3. 해당 윤리 승인에 의해 요구되는 마우스를 모니터링하고 종양이 약 50mm^2의크기로 성장했을 때 외과 절제술을 수행한다.

2. 종양의 부분 외과 절제술

참고: 이 프로토콜에는 두 명의 연구원이 필요합니다. 외과 적 수술 (외과 의사)에 대한 하나, 마우스 모니터링 (조수)에 대한 다른.

1. 수술 설정
   1. 12일 후 접종시 종양이 약 50mm^2의크기에 도달하면, 목의 스크러프에서 부프레노르핀 s.c.의 100 μL(0.1 mg/kg)을 가진 용량 마우스가 수술 30분 전에.
   2. 벤치 코트로 덮인 열 패드로 수술 영역을 설정하고 마취를위해 코 콘을 설정합니다. 사용하기 전에 수술 도구를 살균하고 열 비드 멸균기를 사용하여 각 동물 사이에서 식혀 서 공구를 사용하기 전에 식힙니다. 클로르헤시딘, 면봉, 거즈, 아이젤, 커브드 포셉 2개, 가위, 클립 어플리케이터, 클립 리필(그림 2A, 2B)등 다음과 같은 수술 장비를 깨끗하고 쉽게 도달할 수 있습니다.
   3. 가열 챔버를 37 °C로 데우고 회복을위한 또 다른 열 패드를 설치합니다(그림 2C). 멸균 된 도구를 자동 패드와 같은 멸균 표면에 놓습니다.
2. 마 취
   1. 마우스를 유도 챔버에 놓고 마우스를 4% 이소플루란(1 L/min의 유량으로 100% 산소로 4%)으로 마취하여 호흡 속도가 분당 약 60호흡(초당 1분)으로 느려질 때까지(보통 1분 정도 걸립니다.&1분).
      참고: 질식과 사망으로 이어질 수 있는 마우스를 너무 오랫동안 챔버에 두지 마십시오. 마취 하에 한 번에 하나의 마우스만 있습니다.
   2. 수술 대에 열 패드에 마우스를 전송, 코 콘에 코와 마우스를 배치하고 0.5 L /분의 유량으로 100 % 산소에 3-4 %의 이소플루란으로 마취 상태를 유지. 마취의 깊이가 유지되도록 호흡 속도를 모니터링.
      참고: 어시스턴트는 정확한 수준의 마취가 유지되도록 수술 전반에 걸쳐 마우스의 호흡을 모니터링해야 합니다. 호흡이 너무 느려지면 마취 농도를 낮추거나 마취의 깊이가 너무 얕으면 농도가 증가합니다. 마우스가 헐떡이기 시작하면 코 콘에서 마우스를 제거하고 마취 농도를 감소시키고 호흡이 정상화 될 때까지 기다렸다가 코 콘에 다시 놓습니다.
   3. "핀치 테스트"와 "각막 반사^{테스트"14를} 수행하여 마우스가 수술을 시작하기 전에 완전히 마취되었는지 확인합니다.
      참고: 마우스의 모든 부분의 이동은 마우스가 완전히 마취되지 않았다는 표시입니다. 동물은 즉시 마취 농도를 증가시켜 추가 마취를 받아야한다.
   4. 눈건조증을 피하기 위해 소량의 안과 젤로 마우스의 눈을 가립니다.
3. 외과 수술 (외과 의사)
   1. 알코올 클로레식시딘으로 수술 부위를 3번 면봉하십시오. 집게와 한 쌍의 가위를 사용하여 등쪽면을 따라 1cm 직선 절개를 하고 종양으로부터 3mm 떨어진 곳에있습니다(그림 3A, 3B).
      참고: 모든 마우스에서 절개를 1cm로 표준화(통치자 사용)는 마우스 사이의 상처 치유에 대한 평가조차 허용합니다. 절개를 찾아 3 mm 멀리 종양에서 상처에서 누출없이 후속 종양 부관 치료를 할 수 있습니다.
   2. 핀셋을 사용하여 종양과 복막 사이의 근막과 피하 지방 조직을 빼냅니다. 피하 종양은 일반적으로 피부 측에 부착됩니다.
   3. 핀셋을 사용하여 종양 베어링 측에 피부를 부드럽게 잡고, 종양이 외부에서 볼 수 있도록 종양을 "반전"하여 상처를 엽니다(그림3C, 3D).
      참고: 분해되는 종양의 단면은 상처를 닫기 위하여 충분한 피부가 있기 위하여 개구부에 가장 가까워야 합니다. 종양을 제거할 때 피부를 자르지 않도록 주의하십시오.
   4. 한 쌍의 가위를 사용하여, 개구부에 가장 가까운 종양의 기지에서 시작하여 제거하는 반쪽에서 종양 캡슐을 잘라냅니다.
   5. 50% 해독 수술을 위해 종양의 중간을 가로 질러 잘라. 구부러진 집게를 사용하여, 제거될 종양의 단면을 떠서 (50%); 탈벌된 지역에서 남은 것을 떠서.
   6. 75% 디벌크의 경우, 위의 2.3.5부와 같이 50% 종양 해독을 수행한다. 그런 다음 종양의 나머지 50 %의 절반을 자르고 위에서 설명한 대로 곡면 집게를 사용하여 종양의 25 %를 떠냅니다.
4. 수술 부위 폐쇄
   1. 남은 종양을 피부 밑에 다시 놓고, 집게를 사용하여, 피부 플랩을 함께 당기고 상처를 따라 피부를 일렬로 세워놓습니다.
   2. 상처 가장자리에서 5mm 의 피부를 함께 잡고 수술 클립을 사용하여 집게에 가장 가까운 측면에서 시작하여 상처를 닫습니다. 기본 조직이 노출되지 않도록 필요한 만큼 클립을 적용하십시오. 일반적으로 클립 사이에 2mm 간격이 있는 3~4개의 클립이 적용됩니다.
      참고: 클립이 잘 적용되지 않으면 클립 리무버를 사용하여 클립 리무버를 제거하고 새 클립으로 바꿉을 수 있습니다.
5. 마우스 의 회복 (조수)
   1. 마우스가 따뜻한 (37 °C) 가열 챔버에 넣어 복구 할 수 있습니다.
   2. 열 패드에 마우스의 케이지를 놓습니다. 그들은 마취에서 회복 될 때까지 가열 챔버에서 마우스를 모니터링 (깨어 걷기) 다음 케이지에 다시 마우스를 넣어. 마우스가 더 활성화 될 때까지, 더 열 패드에 케이지를 둡니다.
   3. 쥐에게 젖고 부드러운 음식을 주세요. 쥐를 모니터링 1 복구를 위해 수술 후 시간 및 클립 장소에 남아 있는지 확인. 케이지가 열패드에서 반/반 떨어져 있어 동물이 무인 상태에서 온도를 스스로 조절할 수 있도록 하십시오.
   4. 0.1 mg/kg buprenorphine (100 μL 목의 스크러프에서 피하), 수술 후 6-8 시간 (하루의 끝에)를 가진 복용량 마우스. 다음 날 아침 일찍 마우스를 모니터링하고, 0.1 mg/kg 부프레노르핀(목 의 스크러프에서 피하100μL)으로 마우스를 다시 투여한다. 필요에 따라 더 많은 젖은 음식을 제공합니다.
   5. 다음 7 일 동안 매일 마우스를 모니터링합니다. 클립 리무버를 사용하여 7일 후에 클립을 제거할 수 있습니다.
6. 보조 또는 네오아드주반트 치료
   1. 관심의 치료에 따라 주어진 시간에 (네오) 보조 요법으로 마우스를 peri-operative으로 치료하십시오.
   2. 예를 들어, 접종 후 15일째에 항 CTLA-4 내측(i.p.)의 100 μg의 1회 투여량으로 마우스를 치료하거나 접종 후 15일, 17일 및 19일째에 200μg 항 PD-1 i.p.의 3회 용량으로 치료한다.
7. 실험 컨트롤
   1. 이 모델을 사용하여 염증/상처 치유의 효과를 평가할 때 다음 대조군을 사용하는 것이 좋습니다: 1) 수술 금지 제어(치료는 여전히 종양 내 투여될 수 있음); 2) 샴 수술 제어 : 외과 절개는 피부에 만들어집니다; 종양은 조작되고 노출되지만 종양 조직은 제거되지 않습니다. 상처는 클립으로 닫힙습니다.

결과

50mm^2의 크기로 종양 성장은 부분 해독에 이상적인 크기이다. 50mm² 종양의 불완전한 외과 절제술은 보조 면역 요법(도 4A)이없는경우 종양의 100 % (n =5) 재현 가능한 재성장을 초래합니다. 우리는 다음으로 검사점 분자 Cyto독성 T 림프구 관련 단백질 4 (CTLA-4) 및 프로그램 된 죽음 수용체 1 (PD-1)에 대한 항체를 사용하여 보조 면...

토론

우리는 peri 수술 치료를 테스트하기 위해 연조직 육종의 불완전한 수술 절제술의 마우스 모델에 대한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 치료 다음 마우스 사이 상처 치유의 평가를 허용 하기 위해 수술 절개를 표준화.

종양 배치는 이 프로토콜의 중요한 부분입니다. 우리는 마우스에 최소한의 부담으로 종양 부위에 쉽게 수술 및 투여를 허용하는 피하 종양 모델을 선택했?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 gauge 0.5 mL insulin syringe	Becton Dickinson, Australia	326769	None
2-Mercaptoethanol	Life Technologies Australia Pty Ltd	21985023	None
Anaestetic gas machine	Darvall Vet, Australia	SKU: 2848	None
Anti-CTLA-4	BioXcell, USA	BE0164	None
Anti-PD-1	BioXcell, USA	BP0273	None
Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL	RB healthcare UK Limited, UK	55175	Prescription order
Chlorhexidine Surgical Scrub 4%	Perigo Australia, Australia	CHL01449F(scrub	None
Fetal Bovine serum	CellSera, Australia	AU-FBS-PG	None
Forceps Fine 10.5 cm	Surgical house, Western Australia	CC74110	None
Forceps Fine 12 cm Serrated	Surgical house, Western Australia	CC74212	None
Forceps Halsted 14 cm	Surgical house, Western Australia	CD01114	None
Heating chamber	Datesand Ltd, UK	Mini-Thermacage	None
HEPES (1M)	Life Technologies Australia Pty Ltd	15630080	None
Isoflurane	Henry Schein Animal Health, Australia	SKU: 29405	Prescription order
Lubricating Eye Ointment	Alcon	n/a	None
Penicillin/streptomycin 1000X	Life Technologies Australia Pty Ltd	15140122	None
Phosphate Buffered Solution 10x	Life Technologies Australia Pty Ltd	70013-032	None
Reflex 7mm Clips	Able scientific, Australia	AS59038	None
Reflex 7mm Wound Clip Applicator	Able scientific, Australia	AS59036	None
Reflex Wound Clip Remover	Able scientific, Australia	AS59037	None
Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit	Darvall Vet, Australia	#7885	None
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine	Life Technologies Australia Pty Ltd	21870092	None
Scissors Iris STR 11 cm	Surgical house, Western Australia	KF3211	None
Scissors Iris STR 9 cm	Surgical house, Western Australia	JH4209	None
Small Induction Chamber	Darvall Vet, Australia	SKU: 9630	None
TrypLE express 1x	Life Technologies Australia Pty Ltd	12604-021	None