Farelerde Kolonoskopik Güdümlü Çimdik Biyopsilerinin Yapılması ve Sonraki Doku Değişikliklerinin Değerlendirilmesi

Özet

Burada, farelerde kolonoskopik güdümlü çimdik biyopsilerini indüklemek ve yara kapanışını gerçek zamanlı olarak izlemek için prosedürün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Ayrıca yara yatağının histolojik, immünohistokimyasal ve moleküler analizleri için dokuların hazırlanması için yöntemler sağlanmaktadır.

Özet

Gastrointestinal (GI) sistem hastalıkları incelerken akut yaralanma yanıtının yanı sıra yara iyileşme sürecinde meydana gelen doku ve hücresel değişikliklerin anlaşılması son derece önemlidir. Murine kolonik çimdik biyopsi modeli bu süreçleri tanımlamak için yararlı bir araçtır. Ayrıca, bağırsak parlak içeriği (örneğin, mikroplar) ve kolon arasındaki etkileşim incelenebilir. Bununla birlikte, yara indüksiyonu ve zaman içinde yara kapatmayı güvenilir bir şekilde takip etme yeteneği zor olabilir. Ayrıca, histolojik ve moleküler değişiklikleri en iyi şekilde sorgulamak için doku hazırlama ve yönlendirme standart bir şekilde yapılmalıdır. Burada biyopsi kaynaklı yaralanmayı ve tekrarlayan kolonoskopiler yoluyla yara kapatmanın izlenmesini anlatan ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Yara boyutunun tutarlı ve tekrarlanabilir ölçümlerini, moleküler analizler için yara yatağını toplama yeteneğini ve dokuların kesitleri üzerine yara yatağını görselleştirmeyi sağlayan bir yaklaşım tanımlanmıştır. Bu teknikleri başarıyla yerine getirme yeteneği, kolon içindeki akut yaralanma yanıtı, yara iyileşmesi ve luminal konak etkileşimlerinin çalışmalarına izin verir.

Giriş

Gastrointestinal (GI) sistem, birden fazla işlevi, konak hücre tipleri (örneğin epitel, bağışıklık, stromal vb.) ve trilyonlarca mikrop göz önüne alındığında karmaşık bir organ sistemidir. Bu karmaşıklığın ışığında, GI kanalı hastalıkları genellikle tüm bu faktörlerin etkileşimini içerir. Örneğin, enflamatuar bağırsak hastalıkları (IBD), enflamatuar hücrelerin aktivasyonunu, disbiyozu ve epitel onarımı 1, 2 ,³,⁴,^5,6,7'yi içeren GI kanalında iltihaplanma ve remisyon döngüleri ile ilişkilidir. GI sisteminin IBD ve diğer enflamatuar durumlarını incelemek için uygun model sistemlerine sahip olmak, hastalığın patogenezini emmek için kritik öneme sahiptir. Genetik olarak tasarlanmış fareler ve kemirgenlerde dektran sodyum sülfat (DSS) gibi kimyasalların kullanımı da dahil olmak üzere IBD patogenezini incelemek için çeşitli modeller^{vardır 8,9,10}. Bu modellerin sınırlamaları, iltihabın indüksiyonunu hassas bir şekilde kontrol edememenin yanı sıra yara iyileşmesini değerlendirmede zorluklar içerir. IBD patogenezinin yönlerini taklit etmek için alternatif yöntemler tedaviler geliştirmek için yararlı olabilir.

Farelerde kolonoskopik güdümlü çimdik biyopsileri, enflamatuar yanıtın patogenezini, yara iyileşmesini ve kolondaki konak mikrop etkileşimlerini incelemek için yararlı bir model sistemi sunar. Bu yaklaşım ilk olarak 2009 yılında akut inflamatuar yanıtı ve bağırsaktaki yara iyileşmesini incelemek için yardımcılığını gösteren deneysel bir araç olarak kullanılmıştır¹¹. Daha sonrakiçalışmalar, kolon yara^{iyileşmesinde 11 , 12 , 13 , 14 , 15,16,17,18}'de bağırsak mikrobiyotasının yanı sıra farklı sinyal yollarının rollerini değerlendirmek için bu tekniği kullandı. Daha yakın zamanda, grubumuz kolon hasarına akut yanıtta sphingosine-1-fosfat sinyalinin ve bakterilerin önemini araştırmak için bu modeli kullandı¹⁹. Yararlı olmasına rağmen, farelerde kolonoskopik güdümlü çimdik biyopsileri yapmak ve sonraki doku değişikliklerini değerlendirmek teknik olarak zor olabilir. Örneğin, yaralanmanın indüksiyonu üzerine bağırsağın delinmesinin gerçekleşmesi ve seri kolonoskopiler yoluyla yara yatağının tutarlı ölçümlerinin sağlanması zor olabilir. Ek olarak, histolojik veya immünohistokimyasal analizler için yara yatağını görselleştirmek için kolonik dokuyu düzgün bir şekilde yönlendirmek zor olabilir. Her ne kadar bu yöntemlerle ilgili bazı bilgiler mevcut olsa da^18,20Bu tekniklerin kesin bir adım açısından açıklaması, bu modelin güvenilirliğini ve daha geniş yararını geliştirmeyi vaat eden görsel yardımlar sağlayacaktır. Burada, farelerde kolonoskopik güdümlü çimdik biyopsileri yapmak, zamanla yara kapatmayı izlemek ve yara yatağının histolojik ve moleküler analizlerini sağlamak için dokuyu hazırlamak için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Bu teknikleri gerçekleştirmek için standart bir yöntem oluşturmak, GI iltihabı ve yara onarımı için potansiyel olarak önemli olan daha önce araştırılmamış arabulucuları incelemek için bu modelin kullanımını genişletebilir.

Protokol

Burada açıklanan tüm prosedürler Weill Cornell Tıp Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı." To: "Burada açıklanan tüm prosedürler Weill Cornell Tıp ve Stony Brook Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı.

1. Kolonoskopi ve yara indüksiyonu

1. Önce 1,9 mm sert delikli endoskopu kılıma takarak endoskopun bileşenlerini önceden monte edin (Şekil 1A-B). Hava pompasını (kolonik insufflation sağlamak için) sağlanan boruyu kullanarak, çalışma kanalının yanındaki kılıfın sol tarafındaki gaz vanasına takın(Şekil 1C).
   NOT: Burada açıklanan lens 0° olmasına rağmen, bu amaçla 30° lens de kullanılabilir.
2. Çalışma kanalının açık konumda olduğundan emin olun ve çalışma kanalından 3 Fr biyopsi forseps yerleştirin ve kılıfa kadar ilerletin (kılıfa çıkıntı çıkarmamasını sağlarken) (Şekil 1C). Monte edilen endoskopu, üreticinin talimatlarına göre ışık kaynağına ve video görüntüleme cihazına takın.
3. Fareyi bir indüksiyon odasında oksijen ile% 5 izofluran ile uyuşturun. Daha sonra fareyi ventral tarafında bir ısıtma sistemi (hipotermiyi önlemek için) içeren endoskopik bir hazırlama platformuna taşıyın ve oksijenli% 2 izofluran içeren bir burun konisi kullanarak anestezi altında saklanın. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhem ekleyin. Bir refleksi test etmek için arka ayağı hafifçe sıkıştırarak farenin tamamen uyuşturulduğından emin olun.
   NOT: Farelerin herhangi bir türü veya cinsiyeti bu teknikle kullanılabilir; bununla birlikte, farelerin en az 8 haftalık olması tercih edilir, bu nedenle prosedür için yeterince büyüktürler.
   1. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhem ekleyin.
   2. Bir refleksi test etmek için arka ayağı hafifçe sıkıştırarak farenin tamamen uyuşturulduğından emin olun.
4. 3 mL'lik bir şırıngayı oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin (PBS) ile ekli bir sıçan gavage iğnesi ile doldurun. Farenin anüsüne yaklaşık 1 cm iğne yerleştirin ve dışkı malzemesini temizlemek için PBS'yi hafifçe demleyin. Aşılanan PBS ile birlikte fareden birkaç dışkı peleti çıkmalıdır.
   NOT: Aşırı miktarda PBS'nin aşılanması, lümende köpük oluşumuna neden olabilir ve bu da lümenin görüntülenmesini gizleyebilir.
5. Monte edilen endoskopu farenin anüsüne 0,5 cm yerleştirin. Biyopsi forsepslerini, forsepslerin tam 'çeneleri' (menteşe dahil) kılıbun ucunun ötesine geçene kadar (video monitöründe gözlemlendiği gibi) rektumun lümenine ilerletin (Ek Video 1). Çeneleri doğu-batı yönünde açacak şekilde 90° çevirin (Ek Video 1).
6. Biyopsi yapmak için forsepsleri açın ve yaklaşık 1 cm ilerleyin, forsepsleri kapatın ve tek bir düzgün hareketle forsepsleri kapalı bırakırken hızlı bir şekilde geri çekin (Ek Video 1).
   1. Biyopsi yaparken kolonu tamamen enflamaktan kaçının. Bu nedenle, bu adım sırasında gaz vanasının sağ tarafını açık bırakın; her ne kadar kümesleri açıldıktan sonra kolon bu pozisyondayken mukozaya zarar verme riski olduğu belirtilmelidir.

2. Yara yatağının görselleştirilmesi ve ölçülmesi

1. Kolonoskop kayıt cihazına bağlı ayak pedalı basarak biyopsiden hemen sonra video kaydını başlatın. Havayı endoskopa ve dolayısıyla kolona zorlamak için açıklığı tamamen kapatmak için gaz vanasının sağ tarafına bir işaret parmağı bastırarak kolonu tamamen insufflate edin.
   NOT: Bu protokol, hava akışının manuel olarak kontrol ettiği bir hava pompasının kullanımını açıklasa da, kontrollü hava beslemeli bir peristaltik pompa da kullanılabilir.
2. Forsepsleri kılıfa geri ve kapalı konumdayken rektal lümene ilerletin (Ek Video 1). Çenelerin tabanı görüntüleme alanının üst kenarı ile hizalanana kadar kaleleri yaranın hemen üzerine rektal duvara yerleştirin(Şekil 2 ve Ek Video 1). Yaranın net bir görünümü gözleninene kadar kolonu tamamen ensufflating devam edin.
   NOT: Endoskop lensi ile lezyon arasında tutarlı bir mesafe sağlamak için incelenen her fare için forsepslerin sadece çenelerini tabana kadar ortaya çıkaracak kadar uzatılmasına özen gösterilmelidir(Şekil 2, beyaz ok).
3. Aynı gün birden fazla fare üzerinde biyopsi yapıyorsanız, önceki farenin biyopsilenmiş dokusunu kümeslerden çıkarın (sağlanan temizleme fırçasını kullanarak) ve bir sonraki farede bir yaraya neden olmadan önce temizlemek için lens kılımını% 70 etanol ile silin.
   NOT: Bu protokolde fare başına tek bir biyopsi yapılması açıklansa da, daha sonraki biyopsilerde tam biyopsi yapılabilmesini sağlamak için önceki biyopsiden alınan dokununpstan çıkarılması koşuluyla tek bir fare üzerinde birden fazla biyopsi yapılabilir.
4. İşlemi tamamladıktan sonra anesteziden kurtulana kadar hava yolunu açık tutmak için fareyi diğer farelerin kafes boşluğuna ve bir havlunun üzerine yerleştirin. Aktiviteyi geri kazanarak belirtildiği gibi anesteziden iyileştiğinden emin olmak için fareyi izleyin.
   NOT: Yarayı indüklemek ve yara yatağını 0. günde görselleştirmek için iki kişi gerekir (biri endoskopu, diğeri biyopsi forsepsini çalıştırma) ancak sonraki günlerde yaraları görselleştirmek için sadece bir kişiye ihtiyaç vardır (aşağıda açıklandığı gibi).
5. Yaranın indüksiyonu dışında, yukarıda 1.1-1.4 bölümlerinde açıklandığı gibi, sonraki yara ölçümleri için fare ve kolonoskopinin hazırlanması için aynı prosedürü izleyin (genellikle biyopsiden sonraki 2, 4 ve 6. günler).
6. Endoskopu taktıktan sonra video monitöründeki yara yatağını bu zaman noktalarında bulun ve biyopsi forsepsini (kapalı konumda) yara yatağının hemen üstüne ilerletin, kolonu alt edin ve bölüm 2.1 ve 2.2'de açıklandığı gibi video kaydını başlatın (Şekil 2).
   NOT: Biyopsiden 6 günden fazla bir süre sonra yara yatağını bulmak zor olabilir.
7. Endoskop lensi ile lezyon arasında günler boyunca tutarlı bir mesafe sağlamak için forsepsleri sonraki günlerde lümene 0 gün ile aynı mesafeye ilerletin. Lens ve lezyon arasında tutarlı bir mesafe sağlamak, zaman içinde ölçümlerin doğruluğunu artıracaktır.
   NOT: Bu günlerde bir kişi ölçüm yapabilir (endoskop sağ elle çalıştırılır ve biyopsi önpsleri sol elle ilerletilir).
8. Tüm ölçümler tamamlandıktan sonra, seri kolonoskopilerin video kayıtlarını videodan hareketsiz çekimler oluşturulmasını sağlayan video düzenleme yazılımında açın.
9. Videoyu, yara yatağının kolayca görselleştirilebildiği, kapalı forsepslerin yara yatağının üstünde ve rektal duvara karşı olduğu ve duvarın gergin olduğu bir noktayı gösteren bir kareye ilerletin. Bu çerçevenin bir anlık görüntüsünü alın ve yara yataklarının ölçümlerinin kör bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlamak için dosya adını kodla.
10. Yara yatağının boyutunu ölçmek için NIH ImageJ'de kodlanmış dosya adlarına sahip görüntüleri açın. Çözümle sekmesinin altında Ölçümleri Ayarla'yı seçin ve Alan kutusunu işaretleyin.
    1. Ana menü çubuğundan Serbest seçim aracını seçin ve yaranın etrafına bir çevre çizin (bkz. Şekil 2). Analiz Et sekmesinin altında Ölçü'nün altında Ölçü'nün altında, bu ölçümün değeri Sonuçlar penceresinde otomatik olarak doldurulur.
11. Tüm görüntüler için ölçümleri tamamladıktan sonra, Sonuçlar penceresindeki Dosya sekmesinin altında Farklı Kaydet'i seçerek ve uzantıyı elektronik tablo dosyası olacak şekilde değiştirerek sonuçları bir elektronik tabloya dışa aktarma.
12. Yaranın indüksiyonunu izleyen günlerde (yani 2, 4 ve 6. günler) yaranın boyutunu, bir elektronik tablodaki 0. Bunu, her gün yaranın boyutunu 0.
    NOT: Bu kolonoskopik görüntüleme yöntemi kullanılarak normal koşullarda, yaranın en büyük kapanması ilk 2 günden sonra (~%75 boyut küçülme) ve 4 ve 6. günlerde daha kademeli kapanma (~%80 ve ~%95 boyut küçülme) gözlenir.

3. Moleküler analiz için yara yatağının toplanması

1. Biyopsiyi takip eden seçilen günde CO₂ boğulmasını ve ardından servikal çıkığı (veya eşdeğer tekniği) kullanarak fareyi ötenazi yapın.
2. Vücut boşluğunu açığa çıkarmak için deriyi ve karın kasını açarak kolonun distal bölgesini hasat edin. Kapalı makası kolonun altına yerleştirin ve alttaki mezentery'den serbest bırakmak için hafifçe kaldırın ve ardından fareden çıkarmak için kolonu orta noktasında ve anüste kesin.
3. Dışkı içeriğini, buz gibi 1x PBS ile doldurulmuş 20 mL şırıngaya bağlı bir sıçan gavage iğnesi kullanarak yıkayın, ardından kolonu filtre kağıdına yatırın.
4. Kolonu filtre kağıdında boylamsal olarak kesin ve mezenterik tarafın filtre kağıdına karşı yüzüstü kalmasını sağlayın. Doku hala filtre kağıdındayken bir sıkma pipet kullanarak mukozaya% 0.2 metilen mavisi uygulayın ve ardından fazla metilen mavisini boşaltın. Kolonu bir diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin ve yara yatağını bulun (Şekil 3A).
5. 4 inç mikro iris makası kullanarak, yara yatağının kenarını kesin(Şekil 3A,kesik daire) kas tabakasını kesmemeye dikkat edin (kas istenmediği sürece) ve parçalanan yara yatağını çıtçıt dondurma veya istenen depolama yöntemi için ince nokta cımbız kullanarak bir tüpe aktarın.
   NOT: Bu şekilde toplanan doku miktarı RNA-seq veya eşdeğer analiz için RNA çıkarmak için yeterlidir.

4. Histolojik analiz için dokunun hazırlanması

1. Fareyi ötenazi edin ve 3.1-3.2 adımında açıklandığı gibi iki nokta üst üste hasat edin.
2. Kolonu filtre kağıdında boylamsal olarak kesin ve mezenterik tarafın filtre kağıdına karşı yüzüstü kalmasını sağlayın. Bir sıkma pipeti kullanarak% 4 paraformaldehit (veya tercih edilen fiksatif) hafifçe uygulayın ve dokuyu parafilm ile örtün. Kapalı bir kapta 4-6 saat boyunca düz bırakın.
3. Dokuları depolama için% 70 etanol aktarın. Dokuları işlemeye hazır olduğunuzda, parafilmi çıkarın ve doku hala filtre kağıdı üzerindeyken bir sıkma pipet kullanarak mukozaya% 0.2 metilen mavisi uygulayın. Sonra fazla metilen mavisini boşaltın.
4. Kolonu bir diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin ve yara yatağını bulun (Şekil 3A). #10 bıçaklı bir neşter kullanarak, doğrudan yara yatağının ortasından kesin ve kolonun geri kalanını düz bir çizgide kesmeye devam edin, böylece kolon ikiye bölünmüş, uzunluk açısından(Şekil 3A, siyah çizgi).
5. Kolonu işleyin ve daha sonra parafin gömme (kesildikten sonra kalan bir veya her iki taraf) neşter tarafından kesilen taraf (bizeksiyondan önce yara yatağının merkezi olan taraf) parafin içinde yüzüstü olacak şekilde gömün. İstenilen lekeler veya yapıcılar için kesme bölümlerine ve boyamaya devam edin.
6. Belirli bir boyama için kriyoseksiyonlar gerekiyorsa, kolonu adım 3.1'de açıklandığı gibi hasat edin ve filtre kağıdında uzunlamasına açın, mezenterik tarafın filtre kağıdına karşı yüzüstü olmasını sağlayın.
7. 4.5. adımda açıklandığı gibi yara yatağını taze hasat edilmiş kolon içinde ikiye ayırın ve kolonu (kesildikten sonra kalan bir veya her iki taraf) neşter tarafından kesilen tarafın doku dondurma ortamı ile yarı dolu bir taban kalıbına yüzüstü olacak şekilde gömün.
8. Dokuyu ince cımbızla yerine sabitleyin ve donma ortamını sertleştirmek için baz kalıbı kuru buzun üzerine metal bir plakaya yerleştirin. Ortamın alt kısmı dondurulduktan (ve doku yerinde tutulduktan) sonra, dokuyu serbest bırakın ve baz kalıbın kalan hacmini donma ortamıyla doldurun ve kuru buza geri yerleştirin.
   1. Tüm donma ortamı hacmi dondurulduktan sonra, kesilene kadar -80 ° C dondurucuya aktarın.
9. Parafin veya dondurulmuş bölümler için, çalışmaya özgü boyamaya geçmeden önce yara yatağının bölüme yakalandığından emin olmak için H&E tarafından ek bölümleri kesin ve lekelendirin. Şekil 3B, yara yatağının açıkça gözlemlenebildiği bir bölüm örneği göstermektedir.

Sonuçlar

Biyopsi yapmak için gereken küçük öğeler (lens, kılıt, biyopsi tokmakları) bu bileşenlerin uygun montaj göstergeleri ile birlikte Şekil 1'de gösterilmiştir. Şekil 2, yara yatağının boyutunu ve yaranın kapanma oranını doğru bir şekilde ölçmek için yara yatağının kabul edilebilir görünümlerinin temsili görüntülerini göstermektedir. Yara yatağının eks vivo görünümünün bir örneği Şekil 3A'da,

Tartışmalar

Bu modelde yara kapatma oranını etkili bir şekilde değerlendirmeye çalışırken tutarlı ve doğru biyopsilerin yanı sıra yara büyüklüğü ölçümlerinin sağlanması son derece önemlidir. Bu nedenle, prosedürlerin doğru şekilde yürütüldüğünden emin olmak için çeşitli önlemler alınmalıdır. İlk olarak, biyopsinin derinliği çok sığ veya derin olmamalıdır. Çok sığsa, yara kapatmayı değerlendirmek için yeterli bir pencere olmayacaktır. Şekil 2, 0. gün...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biopsy forceps, 3 Fr	Karl Storz	61071ZJ
Coloview Tower system	Karl Storz	contact company
Examination sheath, 9 Fr, Kit	Karl Storz	61029DK
Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm	Karl Storz	64301AA
isofluorane	Covetrus	2905
methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
micro iris scissors	Integra	18-1619
NIH ImageJ	NIH	N/A	software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/
Pawfly MA-60 aquarium pump	Amazon	N/A
scalpal with #10 blade	Hill-Rom	372610