Esecuzione di biopsie di avvicinamento delle dita guidate dal colonscopico nei topi e valutazione dei successivi cambiamenti tissutali

Riepilogo

Qui, forniamo una descrizione dettagliata della procedura per indurre biopsie di pizzico guidate dal colonscopico nei topi e tracciare la chiusura delle ferite in tempo reale. Inoltre, vengono forniti metodi per la preparazione di tessuti per analisi istologiche, immunoistochimiche e molecolari del letto della ferita.

Abstract

Comprendere i cambiamenti tissutali e cellulari che si verificano nella risposta alle lesioni acute e durante il processo di guarigione delle ferite è di fondamentale importanza quando si studiano le malattie del tratto gastrointestinale (IG). Il modello di biopsia a pizzico colonico murino è uno strumento utile per definire questi processi. Inoltre, è possibile studiare l'interazione tra il contenuto luminale intestinale (ad esempio, microbi) e il colon. Tuttavia, l'induzione della ferita e la capacità di tracciare la chiusura della ferita nel tempo in modo affidabile possono essere impegnative. Inoltre, la preparazione e l'orientamento dei tessuti devono essere effettuati in modo standardizzato per interrogare in modo ottimale i cambiamenti istologici e molecolari. Qui presentiamo un metodo dettagliato che descrive le lesioni indotte dalla biopsia e il monitoraggio della chiusura delle ferite attraverso colonscopie ripetute. Viene descritto un approccio che garantisce misurazioni coerenti e riproducibili delle dimensioni della ferita, la capacità di raccogliere il letto della ferita per analisi molecolari e visualizzare il letto della ferita al momento della sessatura dei tessuti. La capacità di eseguire con successo queste tecniche consente studi sulla risposta acuta alle lesioni, sulla guarigione delle ferite e sulle interazioni luminare-ospite all'interno del colon.

Introduzione

Il tratto gastrointestinale (GI) è un sistema di organi complesso date le sue molteplici funzioni, i tipi di cellule ospiti (ad esempio epiteliale, immunitario, stromale, ecc.) e trilioni di microbi. Alla luce di questa complessità, le malattie del tratto gastrointestinale spesso comportano l'interazione di tutti questi fattori. Ad esempio, le malattie infiammatorie intestinali (IBD) sono associate a cicli di infiammazione e remissione nel tratto gastrointestinale, che comportano l'attivazione di cellule infiammatorie, disbiosi e riparazione epiteliale^{1,2,3,4,5,6,7}. Avere sistemi modello appropriati per studiare l'IBD e altre condizioni infiammatorie del tratto GASTROINTESTINAL è fondamentale per chiarire la patogenesi della malattia. Esistono diversi modelli per studiare la patogenesi IBD, compresi i topi geneticamente modificati e l'uso di sostanze chimiche come il solfato di sodio di dextran (DSS)^{nei roditori 8,9,10}. Le limitazioni di questi modelli includono l'incapacità di controllare con precisione l'induzione dell'infiammazione e le difficoltà nel valutare la guarigione delle ferite. Metodi alternativi per imitare aspetti della patogenesi IBD potrebbero rivelarsi utili per lo sviluppo di terapie.

Le biopsie di pizzico guidate dal colonscopico nei topi offrono un utile sistema modello per studiare la patogenesi della risposta infiammatoria, la guarigione delle ferite e le interazioni ospite-microbo nel colon. Questo approccio è stato utilizzato per la prima volta come strumento sperimentale nel 2009, che ha dimostrato la sua utilità per lo studio della risposta infiammatoria acuta e della guarigione delle ferite^{nell'intestino 11}. Studi successivi hanno utilizzato questa tecnica per valutare i ruoli delle diverse vie di segnalazione così come il microbiota intestinale, nella guarigione delle ferite coloniche^{11,12,13,14,15,16,17,18}. Più recentemente, il nostro gruppo ha utilizzato questo modello per studiare l'importanza della segnalazione della sfingosina-1-fosfato e dei batteri nella risposta acuta alla lesione^{colonica 19}. Sebbene utile, effettuare biopsie di pizzico guidate dal colonscopico nei topi e valutare i successivi cambiamenti tissutali può essere tecnicamente impegnativo. Ad esempio, la perforazione dell'intestino può verificarsi all'induzione di lesioni e garantire misurazioni coerenti del letto della ferita attraverso colonscopie seriali può essere difficile. Inoltre, orientare correttamente il tessuto colon per visualizzare il letto della ferita per analisi istologiche o immunoistochimiche può essere impegnativo. Sebbene esistano alcune informazioni su questi metodi^18,20, una descrizione precisa di queste tecniche insieme agli ausili visivi promette di migliorare l'affidabilità e l'utilità più ampia di questo modello. Qui presentiamo un metodo dettagliato per effettuare biopsie di pizzico guidate colonscopiche nei topi, tracciare la chiusura delle ferite nel tempo e preparare il tessuto per consentire analisi istologiche e molecolari del letto della ferita. La creazione di un metodo standard per eseguire queste tecniche può espandere l'uso di questo modello per studiare mediatori precedentemente non investiti che sono potenzialmente importanti per l'infiammazione dell'IG e la riparazione delle ferite.

Protocollo

Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di Weill Cornell Medicine. A: "Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dagli Institutional Animal Care and Use Committees di Weill Cornell Medicine e Stony Brook University.

1. Colonscopia e induzione della ferita

1. Preassemblare i componenti dell'endoscopio inserendo prima l'endoscopio a foro rigido da 1,9 mm nella tona (Figura 1A-B). Collegare la pompa dell'aria (per fornire l'insufflazione colonica) utilizzando i tubi forniti, alla valvola del gas sul lato sinistro della chiave accanto al canale dilavoro (figura 1C).
   NOTA: Sebbene l'obiettivo qui descritto sia di 0°, a questo scopo può essere utilizzata anche una lente a 30°.
2. Assicurarsi che il canale di lavoro sia in posizione aperta e inserire le forcepsi della biopsia 3 Fr attraverso il canale di lavoro e avanzare fino alla fine della torcia (assicurandosi che non spedi dalla torcia)(Figura 1C). Collegare l'endoscopio assemblato alla sorgente luminosa e al dispositivo di imaging video per le istruzioni del produttore.
3. Anestetizzare il topo con il 5% di isoflurane con ossigeno in una camera di induzione. Quindi spostare il mouse su una piattaforma di stadiazione endoscopica contenente un sistema di riscaldamento (per prevenire l'ipotermia) sul lato ventrale e mantenere in anestesia utilizzando un cono nasale con isoflurane al 2% con ossigeno. Aggiungere un unguento veterinario agli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato pizzicando delicatamente il piede posteriore per verificare la ricerca di un riflesso.
   NOTA: Qualsiasi ceppo o sesso di topi può essere utilizzato con questa tecnica; tuttavia, è preferibile che i topi abbiano almeno 8 settimane di età, quindi sono abbastanza grandi per la procedura.
   1. Aggiungere un unguento veterinario agli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
   2. Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato pizzicando delicatamente il piede posteriore per verificare la ricerca di un riflesso.
4. Riempire una siringa da 3 ml con un ago di gavage per topo attaccato con soluzione salina tamponata da fosfati a temperatura ambiente (PBS). Inserire l'ago di circa 1 cm nell'ano del mouse e infondere delicatamente PBS per cancellare il materiale fecale. Diversi pellet fecali dovrebbero uscire dal mouse insieme al PBS che è stato infuso.
   NOTA: L'instillazione di un volume eccessivo di PBS può provocare la formazione di schiuma nel lume che potrebbe oscurare la visione del lume.
5. Inserire l'endoscopio assemblato di 0,5 cm nell'ano del mouse. Far avanzare la biopsia nel lume del retto fino a quando le 'mascelle' complete (compresa la cerniera) delle forcep sono oltre la fine della toria (come osservato sul monitor video)(Video supplementare 1). Ruotare i forcep di 90° in modo che le mascelle si apra in un orientamentoest-ovest ( Video supplementare 1).
6. Per la biopsia, aprire le forcep e avanzare di circa 1 cm, chiudere le forcep e in un movimento liscio tirare rapidamente indietro sulle forcep lasciandole chiuse(Video supplementare 1).
   1. Evitare di insufflare completamente il colon quando si esegue la biopsia. Pertanto, lasciare aperto il lato destro della valvola del gas durante questa fase; anche se va notato che all'apertura delle forcep c'è il rischio di danneggiare la mucosa quando il colon è in questa posizione.

2. Visualizzare e misurare il letto della ferita

1. Avviare la registrazione video immediatamente dopo la biopsia premendo il pedale collegato al dispositivo di registrazione del colonscopio. Insuffare completamente il colon premendo saldamente un indice contro il lato destro della valvola a gas per coprire completamente l'apertura al fine di forzare l'aria nell'endoscopio e quindi nel colon.
   NOTA: Sebbene questo protocollo descriva l'uso di una pompa d'aria in cui il flusso d'aria è controllato manualmente, è anche possibile utilizzare una pompa peristaltica con un alimentatore d'aria controllato.
2. Far avanzare le forcep fuori dalla tona e nel lume rettale mentre si è in posizione chiusa (Video supplementare 1). Posizionare le forcep contro la parete rettale immediatamente sopra la ferita fino a quando la base delle ganasce non è allineata con il bordo superiore del campo di visualizzazione (Figura 2 e Video supplementare 1). Continuare a insufflare completamente il colon fino a quando non si può osservare una visione chiara della ferita.
   NOTA: Si deve fare attenzione ad estendere le forcep abbastanza lontano da rivelare solo le mascelle delle forcep fino alla base per ogni mouse esaminato al fine di garantire una distanza costante tra la lente dell'endoscopio e la lesione(Figura 2, freccia bianca).
3. Se si educono biopsie su più topi lo stesso giorno, rimuovere il tessuto biopsied del mouse precedente dalle flessioni (utilizzando il pennello per la pulizia fornito) e pulire la torcia dell'obiettivo con il 70% di etanolo per pulirlo prima di indurre una ferita nel topo successivo.
   NOTA: Sebbene questo protocollo descriva l'esecuzione di una singola biopsia per topo, è possibile eseguire più biopsie su un singolo topo a condizione che il tessuto prelevato dalla biopsia precedente venga rimosso dalle forcep al fine di garantire che una biopsia completa possa essere assunta su biopsie successive.
4. Posizionare il mouse in una gabbia priva di altri topi e sopra un asciugamano per mantenere le vie aeree chiare fino a quando non si riprende dall'anestesia dopo aver completato la procedura. Monitorare il mouse per assicurarsi che si riprenda dall'anestesia come indicato riacquistando l'attività.
   NOTA: Due persone sono tenute a indurre la ferita e visualizzare il letto della ferita il giorno 0 (una che opera l'endoscopio e l'altra che opera le flesse della biopsia) ma è necessario un solo individuo per visualizzare le ferite nei giorni successivi (come descritto di seguito).
5. Seguire la stessa procedura per la preparazione del topo e della colonscopia per successive misurazioni della ferita (in genere giorni 2, 4 e 6 dopo la biopsia), come descritto sopra nelle sezioni 1.1-1.4, ad eccezione dell'induzione della ferita.
6. Individuare il letto della ferita sul monitor video in questi punti del tempo dopo aver inserito l'endoscopio e far avanzare le forcep della biopsia (in posizione chiusa) immediatamente sopra il letto della ferita, insuffare il colon e avviare la registrazione video, come descritto nelle sezioni 2.1 e 2.2(Figura 2).
   NOTA: Può essere difficile localizzare il letto della ferita più di 6 giorni dopo la biopsia.
7. Far avanzare le forcep nel lume in questi giorni successivi alla stessa distanza del giorno 0 per garantire una distanza costante tra la lente dell'endoscopio e la lesione tra i giorni. Garantire una distanza costante tra l'obiettivo e la lesione migliorerà l'accuratezza delle misurazioni nel tempo.
   NOTA: Un individuo può effettuare misurazioni in questi giorni (l'endoscopio è azionato con la mano destra e le forcep della biopsia sono avanzate con la mano sinistra).
8. Una volta completate tutte le misurazioni, aprire le registrazioni video delle colonscopie seriali nel software di editing video che consente la creazione di scatti fermi dal video.
9. Far avanzare il video su un fotogramma che mostra un punto nel tempo in cui il letto della ferita può essere facilmente visualizzato, le forcep chiuse sono sopra il letto della ferita e contro la parete rettale e il muro è teso. Scatta un'istantanea di questo telaio e codifica il nome del file per assicurarti che le misurazioni dei letti delle ferite vengano eseguite in modo accecato.
10. Apri le immagini con nomi di file codificati in NIH ImageJ per quantificare le dimensioni del letto della ferita. Nella scheda Analizza selezionare Imposta misure e selezionare la casella Area.
    1. Selezionate lo strumento Selezioni a mano libera dalla barra dei menu principale e disegnate un perimetro attorno alla ferita (vedere figura 2). Nella scheda Analizza selezionare Misura e il valore di tale misurazione verrà popolato automaticamente nella finestra Risultati.
11. Esportare i risultati in un foglio di calcolo dopo aver completato le misurazioni per tutte le immagini, selezionando Salva con nome nella scheda File all'interno della finestra Risultati e modificando l'estensione in modo che diventi un file di foglio di calcolo.
12. Calcola la dimensione della ferita nei giorni successivi all'induzione della ferita (cioè i giorni 2, 4 e 6) rispetto alle dimensioni del giorno 0 (immediatamente dopo il mento) in un foglio di calcolo. Eseguire questa operazione dividendo la dimensione della ferita ogni giorno per la dimensione della ferita il giorno 0 e convertendo tale valore in una percentuale.
    NOTA: In condizioni normali utilizzando questo metodo di visione colonscopica, la più grande chiusura della ferita si osserva dopo i primi 2 giorni (~75% di riduzione delle dimensioni) con chiusura più graduale nei giorni 4 e 6 (~80% e ~95% di riduzione delle dimensioni, rispettivamente).

3. Raccolta del letto della ferita per l'analisi molecolare

1. Eutanasia del topo utilizzando asfissia di CO₂ seguita da lussazione cervicale (o tecnica equivalente) il giorno selezionato dopo la biopsia.
2. Raccogliere la regione distale del colon aprendo la pelle e il muscolo addominale per esporre la cavità corporea. Posizionare le forbici chiuse sotto i due punti e sollevarle delicatamente per rilasciarlo dal mesentere sottostante e quindi tagliare i due punti nel punto centrale e nell'ano per rimuoverlo dal mouse.
3. Lavare il contenuto fecale utilizzando un ago di gavage per topi attaccato a una siringa da 20 ml riempita con PBS 1x ghiacciato, quindi posare i due punti su carta da filtro.
4. Tagliare i due punti longitudinalmente sulla carta da filtro assicurando che il lato mesenterico sia a faccia in giù contro la carta filtrante. Applicare lo 0,2% di blu di metilene sulla mucosa utilizzando una pipetta di compressione mentre il tessuto è ancora sulla carta filtrante e quindi drenare il blu di metilene in eccesso. Visualizzare i due punti al microscopio di sezionamento e individuare il letto della ferita (Figura 3A).
5. Utilizzando forbici micro iris da 4 pollici, tagliare intorno al bordo del letto della ferita(Figura 3A,cerchio tratteggiato) facendo attenzione a non tagliare nello strato muscolare (a meno che il muscolo non sia desiderato) e trasferire il letto della ferita sezionato su un tubo utilizzando pinzette a punta fine per il congelamento a scatto o il metodo di conservazione desiderato.
   NOTA: La quantità di tessuto raccolto in questo modo è sufficiente per estrarre l'RNA per l'RNA-seq o l'analisi equivalente.

4. Preparazione dei tessuti per l'analisi istologica

1. Eutanasia del topo e raccogliere il colon come descritto nel passaggio 3.1-3.2.
2. Tagliare i due punti longitudinalmente sulla carta da filtro assicurando che il lato mesenterico sia a faccia in giù contro la carta filtrante. Applicare delicatamente la paraformaldeide al 4% (o fissante di scelta) utilizzando una pipetta di compressione e coprire il tessuto con parafilm. Lasciare piatto in un contenitore sigillato per 4-6 ore.
3. Trasferire i tessuti al 70% di etanolo per lo stoccaggio. Quando sei pronto per elaborare i tessuti, rimuovere il parafilm e applicare lo 0,2% di blu di metilene sulla mucosa usando una pipetta di compressione mentre il tessuto è ancora su carta da filtro. Quindi scolare il blu di metilene in eccesso.
4. Visualizzare i due punti al microscopio di sezionamento e individuare il letto della ferita (Figura 3A). Usando un bisturi con una lama #10, tagliato direttamente attraverso il centro del letto della ferita e continuare a tagliare attraverso il resto del colon in linea retta, in modo che il colon sia stato tagliato a metà, per quanto riguarda lalunghezza (Figura 3A,linea nera).
5. Elaborare i due punti e quindi incorporare la paraffina (uno o entrambi i lati che rimangono dopo il taglio) in modo che il lato tagliato dal bisturi (il lato che era il centro del letto della ferita prima della bisezione) sia a faccia in giù nella paraffina. Procedere al taglio delle sezioni e alla colorazione per le macchie o i maker desiderati.
6. Se sono necessarie criosezioni per una determinata colorazione, raccogliere i due punti come descritto al passaggio 3.1 e aprirli longitudinalmente su carta filtrante, assicurando che il lato mesenterico sia a faccia in giù contro la carta filtrante.
7. Bisect il letto della ferita all'interno del colon appena raccolto come descritto nel passaggio 4.5 e incorporare il colon (uno o entrambi i lati che rimangono dopo il taglio) in modo che il lato che è stato tagliato dal bisturi sia a faccia in giù in uno stampo di base mezzo riempito con mezzo di congelamento dei tessuti.
8. Fissare il tessuto in posizione con pinzette fini e posizionare lo stampo di base su una piastra metallica sopra il ghiaccio secco per indurire il mezzo di congelamento. Una volta che la parte inferiore del mezzo è congelata (e il tessuto è tenuto in posizione), rilasciare il tessuto e riempire il volume rimanente dello stampo di base con mezzo di congelamento e riposizionare sul ghiaccio secco.
   1. Dopo che l'intero volume del mezzo di congelamento è stato congelato, trasferire in un congelatore a -80 °C fino alla sessatura.
9. Per sezioni di paraffina o congelate, tagliare e macchiare sezioni aggiuntive da H&E per assicurarsi che il letto della ferita sia stato catturato nella sezione prima di procedere alla colorazione specifica dello studio. La figura 3B mostra un esempio di sezione in cui il letto della ferita può essere chiaramente osservato.

Risultati

I piccoli oggetti (lente, fante, forcep di biopsia) necessari per eseguire le biopsie sono mostrati nella figura 1 insieme agli indicatori di un corretto assemblaggio di questi componenti. La figura 2 mostra immagini rappresentative di viste accettabili del letto della ferita al fine di quantificare con precisione le dimensioni del letto della ferita e il tasso di chiusura della ferita. Un esempio di vista ex vivo del letto della ferita è mostrato nella

Discussione

Garantire biopsie coerenti e accurate e misurazioni delle dimensioni della ferita sono di fondamentale importanza quando si tenta di valutare efficacemente il tasso di chiusura delle ferite in questo modello. Pertanto, si dovrebbero adottare diverse misure per essere sicuri che le procedure siano state eseguite correttamente. In primo luogo, la profondità della biopsia non deve essere troppo bassa o profonda. Se troppo superficiale, non ci sarà una finestra sufficiente per valutare la chiusura della ferita.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biopsy forceps, 3 Fr	Karl Storz	61071ZJ
Coloview Tower system	Karl Storz	contact company
Examination sheath, 9 Fr, Kit	Karl Storz	61029DK
Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm	Karl Storz	64301AA
isofluorane	Covetrus	2905
methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
micro iris scissors	Integra	18-1619
NIH ImageJ	NIH	N/A	software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/
Pawfly MA-60 aquarium pump	Amazon	N/A
scalpal with #10 blade	Hill-Rom	372610