Выполнение Колоноскопической-Guided Pinch биопсии у мышей и оценки последующих изменений тканей

Резюме

Здесь мы предоставляем подробное описание процедуры, чтобы вызвать колоноскопические управляемые щепотку биопсии у мышей и отслеживать замыкание ран в режиме реального времени. Кроме того, предусмотрены методы подготовки тканей для гистологического, иммуногистохимического и молекулярного анализа раневого койки.

Аннотация

Понимание тканей и клеточных изменений, которые происходят в острой реакции травмы, а также во время процесса заживления ран имеет первостепенное значение при изучении заболеваний желудочно-кишечного тракта (ГИ) тракта. Murine толстой кишки щепотку биопсии модель является полезным инструментом для определения этих процессов. Кроме того, можно изучить взаимодействие между содержанием люминесцентных опухолей кишечника (например, микробов) и толстой кишки. Тем не менее, индукция ран и способность отслеживать закрытие раны с течением времени надежным образом может быть сложной задачей. Кроме того, подготовка и ориентация тканей должны осуществляться стандартизированным способом оптимального допроса гистологических и молекулярных изменений. Здесь мы представляем подробный метод, описывающий биопсии индуцированной травмы и мониторинга закрытия раны с помощью повторных колоноскопии. Описан подход, который обеспечивает последовательные и воспроизводимые измерения размера раны, способность собирать раневую кровать для молекулярного анализа, а также визуализировать раневую кровать при разделе тканей. Способность успешно выполнять эти методы позволяет для изучения острой реакции травмы, заживление ран и светящиеся взаимодействия в толстой кишке.

Введение

Желудочно-кишечный тракт (ГИ) является сложной системой органов, учитывая его многочисленные функции, типы клеток-хозяина (например, эпителиальные, иммунные, стромальные и т.д.), а также триллионы микробов. В свете этой сложности, заболевания желудочно-кишечного тракта часто связаны с взаимодействием всех этих факторов. Например, воспалительные заболевания кишечника (IBD) связаны с циклами воспаления и ремиссии в желудочно-кишечном тракте, с участием активации воспалительных клеток, дисбактериоза и^{эпителиального ремонта 1,2,3,4,5,6,7.} Наличие соответствующих модельных систем для изучения IBD и других воспалительных состояний желудочно-кишечного тракта имеет решающее значение для выяснения патогенеза болезни. Существует несколько моделей для изучения патогенеза IBD, включая генетически модифицированных мышей и использование химических веществ, таких как декстран сульфат натрия (DSS)^{у грызунов 8,9,10}. Ограничения этих моделей включают в себя неспособность точно контролировать индукцию воспаления, а также трудности в оценке заживления ран. Альтернативные методы для имитации аспектов патогенеза IBD может оказаться полезным для разработки методов лечения.

Колоноскопическая биопсия щепотки у мышей предлагает полезную модельную систему для изучения патогенеза воспалительной реакции, заживления ран, а также взаимодействия хост-микробов в толстой кишке. Этот подход был впервые использован в качестве экспериментального инструмента в 2009 году, который продемонстрировал свою полезность для изучения острой воспалительной реакции и заживления ран в^{кишечнике 11}. Последующие исследования использовали эту технику для оценки роли различных сигнальных путей, а также микрофлоры кишечника, в заживлении толстой кишки^{раны 11,12,13,14,15,16,17,18}. Совсем недавно, наша группа использовала эту модель для изучения важности сфингозина-1-фосфат сигнализации и бактерий в острой реакции на травмы толстой^{кишки 19}. Хотя полезно, проведение колоноскопических управляемых щепотку биопсии у мышей и оценки последующих изменений тканей может быть технически сложной задачей. Например, перфорация кишечника может произойти при индукции травмы и обеспечения последовательных измерений раневого койко-поколя через серийные колоноскопии может быть трудно. Кроме того, ориентация толстой ткани должным образом визуализировать раневую кровать для гистологических или иммуногистохимических анализов может быть сложной задачей. Хотя некоторая информация существует в отношении^{этих методов 18,20}, точное пошаговое описание этих методов вместе будет визуальные пособия обещает повысить надежность и более широкую полезность этой модели. Здесь мы представляем подробный метод проведения колоноскопической биопсии щепотки у мышей, отслеживания закрытия раны с течением времени и подготовить ткани, чтобы гистологические и молекулярные анализы раны кровать. Создание стандартного метода для выполнения этих методов может расширить использование этой модели для изучения ранее нерасследованных посредников, которые потенциально важны для воспаления Г.И. и восстановления ран.

протокол

Все процедуры, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию медицины Вейл Корнелла». Для: "Все процедуры, описанные здесь были одобрены институциональных животных уход и использование комитетов Вейл Корнелл медицины и Стоуни Брук университета.

1. Колоноскопия и индукция раны

1. Предварительная сборка компонентов эндоскопа путем первой вставки 1,9 мм жесткого эндоскопа скважины в оболочку(рисунок 1A-B). Прикрепите воздушный насос (для обеспечения двоеточия insufflation) с помощью трубки при условии, газовый клапан на левой стороне оболочки рядом с рабочим каналом (Рисунок 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что объектив, описанный здесь, составляет 0 ", объектив 30" также может быть использован для этой цели.
2. Убедитесь, что рабочий канал находится в открытом положении и вставьте 3 fr биопсии типсов через рабочий канал и заранее его до конца оболочки (при обеспечении того, чтобы он не выступает из оболочки) (Рисунок 1C). Прикрепите собранный эндоскоп к источнику света и устройству видеосъемки в соответствии с инструкциями производителя.
3. Обезболить мышь с 5% изофлюран с кислородом в индукционной камере. Затем переместите мышь на эндоскопическую постановочную платформу, содержащую систему отопления (для предотвращения переохлаждения) на ее брюшной стороне и поддерживайте под наркозом с помощью носового конуса с 2% изофлюраном с кислородом. Добавьте ветеринарную мазь в глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии. Убедитесь, что мышь полностью анестезируется, осторожно щипать заднюю ногу, чтобы проверить на рефлектор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любой штамм или любой пол мышей могут быть использованы с этой техникой; однако, предпочтительно что мыши по крайней мере 8 неделей времени поэтому они больш достаточно для процедуры.
   1. Добавьте ветеринарную мазь в глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
   2. Убедитесь, что мышь полностью анестезируется, осторожно щипать заднюю ногу, чтобы проверить на рефлектор.
4. Заполните шприц 3 мл с прикрепленной иглой крысиного гаважа с фосфатно-буферным солевым раствором (PBS). Вставьте иглу примерно на 1 см в анус мыши и аккуратно влить PBS для очищения фекального материала. Несколько фекальных гранул должны выйти из мыши вместе с PBS, который был пропитан.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Закапывания чрезмерного объема PBS может привести к образованию пены в люмене, которые могли бы скрыть просмотр люмена.
5. Вставьте собранный эндоскоп 0,5 см в анус мыши. Заранее биопсии миппы в люмен прямой кишки до полного "челюсти" (в том числе шарнир) типсов находятся за пределами конца оболочки (как видно на видео-монитор) (Дополнительное видео 1). Поверните типсы на 90 градусов, так что челюсти открываются в восточно-западной ориентации(Дополнительное видео 1).
6. Для биопсии откройте типсы и заранее примерно на 1 см, закройте миппы и одним плавным движением быстро оттяните на типсы, оставляя их закрытыми(Дополнительное видео 1).
   1. Избегайте полностью insufflating толстой кишки при выполнении биопсии. Поэтому оставьте правую сторону газового клапана открытой во время этого шага; хотя следует отметить, что при открытии типсов существует риск повреждения слизистой оболочки, когда толстая кишка находится в этом положении.

2. Визуализация и измерение раны кровати

1. Инициировать видеозапись сразу после биопсии, нажав на педаль стопы, прикрепленную к записывающее устройство колоноскопа. Полностью insufflate толстой кишки, твердо нажав указательный палец на правую сторону газового клапана, чтобы полностью покрыть отверстие для того, чтобы заставить воздух в эндоскоп и, таким образом, в толстой кишке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя этот протокол описывает использование воздушного насоса, в котором поток воздуха управляется вручную, перистальтический насос с контролируемым подачи воздуха также может быть использован.
2. Заранее типсы обратно из оболочки, и в ректальный люмен в то время как в закрытом положении (Дополнительное видео 1). Поместите типсы против ректальной стенки непосредственно над раной до тех пор, пока основание челюстей не будет выровнено с верхнимкраем поля просмотра (рисунок 2 и дополнительное видео 1). Продолжить полностью insufflating толстой кишки, пока четкое представление о ране можно наблюдать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует позаботиться о том, чтобы расширить типс достаточно далеко, чтобы выявить только челюсти типсов до основания для каждой мыши рассматривается для того, чтобы обеспечить последовательное расстояние между объективом эндоскопа и поражения (Рисунок 2, белая стрелка).
3. При проведении биопсии на нескольких мышах в тот же день, удалить биопсии ткани предыдущей мыши из типсов (с помощью чистки кисти при условии) и протрите оболочку объектива с 70% этанола, чтобы очистить его, прежде чем индуцирование раны в следующей мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя этот протокол описывает проведение одной биопсии на мышь, несколько биопсий могут быть выполнены на одной мыши при условии, что ткань, взятая из предыдущей биопсии удаляется из типсов для того, чтобы обеспечить полную биопсию может быть принято на последующие биопсии.
4. Поместите мышь в клетку пустоту других мышей и на верхней части полотенца, чтобы сохранить дыхательные пути ясно, пока он не оправиться от анестезии после завершения процедуры. Монитор мыши, чтобы убедиться, что он восстанавливается после анестезии, как указано на восстановление активности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Два человека должны вызвать рану и визуализировать раневую кровать на 0-й день (один работает эндоскоп, а другой работает биопсии типсов), но только один человек необходим для визуализации ран в последующие дни (как описано ниже).
5. Следуйте той же процедуре для подготовки мыши и колоноскопии для последующих измерений раны (обычно дней 2, 4 и 6 после биопсии), как описано выше в разделах 1.1-1.4, за исключением индукции раны.
6. Найдите раневую кровать на видео мониторе в эти моменты времени после вставки эндоскопа и заранее биопсии типсов (в закрытом положении), чтобы непосредственно над раной кроватью, insufflate толстой кишки и инициировать видеозапись, как описано в разделах 2.1 и 2.2 (Рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть трудно найти рану более чем через 6 дней после биопсии.
7. Заранее типсов в люмен в эти последующие дни на том же расстоянии, как на день 0, чтобы обеспечить последовательное расстояние между объективом эндоскопа и поражения в течение нескольких дней. Обеспечение последовательного расстояния между объективом и поражением повысит точность измерений с течением времени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один человек может проводить измерения в эти дни (эндоскоп работает с правой рукой и биопсии миппы передовые с левой рукой).
8. После завершения всех измерений откройте видеозаписи серийных колоноскопий в программном обеспечении для редактирования видео, которое позволяет создавать кадры из видео.
9. Заранее видео на кадр, показывающий момент времени, когда раневая кровать может быть легко визуализированы, закрытые типсы над раной кровать и против ректальной стены и стены тугой. Сделайте снимок этого кадра и кодировать название файла, чтобы убедиться, что измерения раны кровати проводятся в ослепленным образом.
10. Откройте изображения с закодированными именами файлов в NIH ImageJ для количественной оценки размера раны кровати. Под вкладкой Анализ выберите набор измерений и проверьте поле Area.
    1. Выберите инструмент выбора Freehand из основного бара меню и нарисуйте периметр вокруг раны (см. рисунок 2). Под вкладкой Анализ выберите Измерение и значение этого измерения автоматически заселит в окне Результатов.
11. Экспорт результатов в электронную таблицу после завершения измерений для всех изображений, выбрав Save As под вкладкой Файл в окне Результатов и изменив расширение, чтобы стать файлом электронной таблицы.
12. Рассчитайте размер раны в дни, последующие после индукции раны (т.е. дни 2, 4 и 6) по отношению к размеру на день 0 (сразу после ранения) в электронной таблице. Выполнить это путем деления размера раны на каждый день на размер раны на день 0 и преобразования этого значения в процентах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При нормальных условиях, использующих этот метод колоноскопического просмотра, наибольшее закрытие раны наблюдается после первых 2 дней (сокращение размера на 75%) с более постепенным закрытием в дни 4 и 6 (снижение размера на 80% и 95% соответственно).

3. Сбор раны для молекулярного анализа

1. Euthanize мыши с использованием CO_{2 удушья} следуют шейки матки дислокации (или эквивалентной техники) на выбранный день после биопсии.
2. Урожай дистальной области толстой кишки, открыв кожу и мышцы живота, чтобы разоблачить полость тела. Поместите закрытые ножницы под толстой кишки и осторожно поднимите, чтобы освободить его от основной мезентерии, а затем сократить толстой кишки в средней точке и на анус, чтобы удалить его из мыши.
3. Флеш фекального содержания с помощью крысы gavage иглы прилагается к 20 мл шприц заполнен ледяной 1x PBS затем сложить толстой кишки на фильтровальную бумагу.
4. Разрежьте открытую толстую кишку продольно на фильтровальной бумаге, гарантируя, что мезентерическая сторона лицом вниз против фильтровальной бумаги. Нанесите 0,2% метиленовый синий на слизистую оболочку с помощью выжимать пипетку в то время как ткань все еще находится на фильтровальной бумаге, а затем слейте избыток метиленового синего. Просмотр толстой кишки под рассечением микроскопа и найти рану кровать (Рисунок 3A).
5. Используя 4 дюйма микро радужной оболочки ножницы, вырезать вокруг края раны кровать (Рисунок 3A, пунктирной круг) быть осторожным, чтобы не нарезать мышечный слой (если мышцы не требуется) и передачи расчлененной раны кровать в трубку с использованием тонкой точки пинцет для оснастки замораживания или желаемого метода хранения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ткани, собранной таким образом, достаточно для извлечения РНК для РНК-сек или эквивалентного анализа.

4. Подготовка тканей к гистологическому анализу

1. Усынить мышь и урожай толстой кишки, как описано в шаге 3.1-3.2.
2. Разрежьте открытую толстую кишку продольно на фильтровальной бумаге, гарантируя, что мезентерическая сторона лицом вниз против фильтровальной бумаги. Аккуратно нанесите 4% параформальдегид (или фиксатор по выбору) с помощью выжимать трубу и покрыть ткань парафильмом. Оставьте квартиру в запечатанном контейнере на 4-6 часов.
3. Передача тканей на 70% этанола для хранения. Когда готовы к обработке тканей, удалить парафильм и применить 0,2% метиленовый синий к слизистой оболочке с помощью выжать пипетку в то время как ткань все еще находится на фильтровальной бумаге. Затем слейте излишки метиленового синего цвета.
4. Просмотр толстой кишки под рассечением микроскопа и найти рану кровать (Рисунок 3A). Используя скальпель с лезвием #10, прорезать непосредственно через центр раны кровать и продолжать резки через оставшуюся часть толстой кишки по прямой линии, так что толстая кишка была разрезана пополам, длина мудрый (Рисунок 3A, черная линия).
5. Процесс толстой кишки, а затем парафин вставлять (или одной или обеих сторон, которые остаются после резки) таким образом, что сторона, которая была сокращена скальпелем (сторона, которая была центром раны кровать до bisection) лицом вниз в парафин. Приступить к резки разделов и окрашивания для желаемого пятна (ы) или Maker (ы).
6. Если для данного окрашивания необходимы криозиции, урожай толстой кишки, описанный в шаге 3.1, и открыть продольно на фильтровальной бумаге, гарантируя, что мезентерическая сторона лицом вниз против фильтровальной бумаги.
7. Раздельте раневую кровать в свежесобранной толстой кишке, как описано в шаге 4.5 и вставлять толстой кишки (либо одна или обе стороны, которые остаются после резки) таким образом, что сторона, которая была сокращена скальпелем лицом вниз в базовой плесени наполовину заполнены ткани замораживания среды.
8. Закрелите ткань на месте мелким пинцетом и поместите базовую форму на металлическую пластину поверх сухого льда, чтобы затвердеть замерзающую среду. После того, как нижняя часть среды заморожена (и ткань находится на месте), отпустите ткань и заполните оставшийся объем базовой формы с замораживанием среды и поместите обратно на сухой лед.
   1. После того, как весь объем замораживания среды заморожен, перенесите в морозильную камеру -80 градусов по Цельсию до секции.
9. Для парафина или замороженных секций, вырезать и пятно дополнительных разделов Н И Е, чтобы убедиться, что рана кровать была захвачена на разделе, прежде чем приступить к изучению конкретных окрашивания. На рисунке 3B показан пример секции, в которой можно четко наблюдать раневую кровать.

Результаты

Мелкие предметы (линзы, оболочки, биопсии типсов), необходимых для проведения биопсии показаны на рисунке 1 вместе с показателями надлежащей сборки этих компонентов. На рисунке 2 показаны репрезентативные изображения приемлемых видов раны на кровати, с т...

Обсуждение

Обеспечение последовательной и точной биопсии, а также измерения размера раны имеют первостепенное значение при попытке эффективно оценить скорость закрытия раны в этой модели. Поэтому необходимо принять ряд мер, чтобы быть уверенными в том, что процедуры выполняются правильно. Во-пе?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biopsy forceps, 3 Fr	Karl Storz	61071ZJ
Coloview Tower system	Karl Storz	contact company
Examination sheath, 9 Fr, Kit	Karl Storz	61029DK
Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm	Karl Storz	64301AA
isofluorane	Covetrus	2905
methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
micro iris scissors	Integra	18-1619
NIH ImageJ	NIH	N/A	software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/
Pawfly MA-60 aquarium pump	Amazon	N/A
scalpal with #10 blade	Hill-Rom	372610