Taze Eksire Lendirilen Meme Kanseri Tümörleri için Terahertz Görüntüleme ve Karakterizasyon Protokolü

Özet

Taze eksintif insan meme kanseri tümörleri terahertz spektroskopisi ve görüntüleme ile yeni doku işleme protokolleri aşağıdaki karakterizedir. Doku konumlandırması, gelecekteki intraoperatif uygulamalar için zamanında analiz sağlarken etkili karakterizasyonu sağlamak için göz önünde bulundurulur.

Özet

Bu el yazması, darbeli terahertz görüntüleme ve spektroskopi teknikleri kullanarak yeni eksintif insan meme tümörlerini işlemek, karakterize etmek ve imaj haline getirmek için bir protokol sunar. Protokol, normal insidansında terahertz iletim modunu ve 30°'lik eğik açıyla terahertz yansıma modunu içerir. The collected experimental data represent time domain pulses of the electric field. Çıkarılan doku üzerinde sabit bir noktadan iletilen terahertz elektrik alan sinyali, kırılma indisi ve doku emilim katsayısı ayıklamak için analitik bir model aracılığıyla işlenir. Bir step motor tarayıcı kullanarak, terahertz yayılan darbe farklı doku bölgelerinin düzlemsel bir görüntü sağlayan tümör her piksel yansıtılır. Görüntü zaman veya frekans etki alanında sunulabilir. Ayrıca, her pikselde kırılma indisi ve emilim katsayısı çıkarılan verileri tümörün tomografik terahertz görüntü sağlamak için kullanılır. Protokol kanserli ve sağlıklı dokular arasında net bir ayrım göstermektedir. Öte yandan, protokole bağlı kalmamak, tümör yüzeyinde hava kabarcıkları ve sıvı kalıntılarının bulunması nedeniyle gürültülü veya yanlış görüntülere neden olabilir. Protokol meme tümörlerinin cerrahi marjlarının değerlendirilmesi için bir yöntem sağlar.

Giriş

Terahertz (THz) görüntüleme ve spektroskopi son on yılda hızla büyüyen bir araştırma alanı olmuştur. 0.1-4 THz aralığında daha verimli ve tutarlı THz yayıcılar sürekli gelişimi uygulamaları önemli ölçüde büyümeye yaptı^1. THz umut ve önemli büyüme göstermiştir bir alan biyomedikal alan². THz radyasyonun genellikle sabit dokuları analiz etmek için kullanılan güç seviyelerinde soğanlaştırıcı ve biyolojik olarak güvenli olduğu gösterilmiştir³. Sonuç olarak, THz görüntüleme ve spektroskopi sınıflandırmak ve yanık hasarı ve iyileşme⁴belirtmek için su içeriği gibi çeşitli doku özellikleri ayırt etmek için kullanılmıştır , karaciğer sirozu⁵, ve ekstesiye dokularda kanser^6,7. Özellikle kanser değerlendirmesi potansiyel klinik ve cerrahi uygulamaların geniş bir yelpazede kapsar, ve beyin kanserleri için araştırılmıştır⁸, karaciğer⁹, yumurtalıklar¹⁰, gastrointestinal sistem¹¹, ve meme^{7,12,13,14,15,16,17,18,19}.

Meme kanseri için THz uygulamaları öncelikle meme koruyucu cerrahi, ya da lumpektomi destekleyen odaklanmıştır, marj değerlendirmesi yoluyla. Bir lumpektomi amacı tümör ve çevreleyen sağlıklı doku küçük bir tabaka kaldırmaktır, tam mastektomi aksine, hangi tüm meme kaldırır. Ekspertisi yapılan dokunun cerrahi marjı, numune formalin, kesitli, parafin içine gömülü ve mikroskop slaytları üzerinde 4 μm-5m dilimler halinde monte edildikten sonra patoloji yoluyla değerlendirilir. Bu süreç zaman alıcı olabilir ve pozitif bir marj gözlenirse daha sonraki bir zamanda ikincil bir cerrahi işlem gerektirir²⁰. Amerikan Radyasyon Onkolojisi Derneği tarafından geçerli kurallar, yüzey seviyesi marjı mürekkep²¹temas kanser hücreleri sahip olarak bu pozitif marjı tanımlar. Yüksek emilim li sulu doku için THz görüntüleme öncelikle hızlı marj değerlendirme cerrahi ihtiyaçlarını karşılamak için yeterli olan doku tipine göre bazı değişen penetrasyon ile yüzey görüntüleme ile sınırlıdır. Cerrahi ayarı sırasında marj koşullarının hızlı bir analizi cerrahi maliyetleri ve takip işlem oranını büyük ölçüde azaltacak. Bugüne kadar, THz formalin-sabit, parafin gömülü (FFPE) dokularda kanser ve sağlıklı doku arasında ayrım etkili olduğu kanıtlanmıştır, ancak ek araştırma taze ekscised dokularda kanser güvenilir tespit sağlamak için gereklidir⁷.

Bu protokol, bir biyobanktan alınan taze ekscised insan dokusu örnekleri üzerinde THz görüntüleme ve spektroskopi yapmak için adımları ayrıntıları. Taze eksintise insan meme kanseri dokuları üzerine inşa THz uygulamaları nadiren yayınlanan araştırma kullanılmıştır^7,18,22,23, özellikle araştırma grupları tarafından bir hastane ile entegre değil. Taze eksintise dokuların kullanımı aynı şekilde diğer kanser uygulamaları için nadirdir, en meme dışı insan kanseri örnekleri kolon kanseri için rapor ediliyor^24,25. Bunun bir nedeni ffpe doku blokları erişim ve çalışma için kullanılan THz sistemi cerrahi iş akışının bir parçası olmadığı sürece yeni eksised doku daha işlemek çok daha kolay olmasıdır. Benzer şekilde, çoğu ticari laboratuvar THz sistemleri taze doku işlemek için hazır değildir, ve bu hala hücre hattı büyüme kullanarak aşamalarında ya da sadece hayvan modellerinden excised doku bakmaya başladı. THz'in intraoperatif bir ortama uygulanması için, taze doku için görüntüleme ve karakterizasyon adımlarını önceden geliştirerek analizin standart patolojiyi gerçekleştirme yeteneğini engellememesi gerekir. Doğal olarak intraoperatif olması amaçlanmayan uygulamalar için, taze dokunun karakterizasyonu hala in vivo uygulamaları ve farklılaşma doğru çalışmak için ele alınması gereken zorlu bir adımdır.

Bu çalışmanın amacı, ticari bir THz sistemi kullanarak yeni ekskised doku için THz uygulaması için bir kılavuz sağlamaktır. Protokol bir THz görüntüleme ve spektroskopi sistemi geliştirilmiştir²⁶ minür meme kanseri tümörleri için^13,17,19 ve biobanks elde edilen insan cerrahi doku uzatıldı^7,18. Protokol meme kanseri için üretilirken, aynı kavramlar benzer THz görüntüleme sistemleri ve başarı marjı değerlendirme bağlıdır cerrahi ile tedavi edilen katı tümör kanserleri diğer türleri için uygulanabilir²⁷. Taze eksintize dokularda yayınlanan THz sonuçlarının oldukça az bir miktarı nedeniyle, bu thz görüntüleme ve karakterizasyon için taze doku işleme protokolü odaklanmak için yazarların bilgisine ilk çalışmadır.

Protokol

Bu protokol, Arkansas Üniversitesi Çevre Sağlığı ve Güvenliği bölümü tarafından belirlenen tüm gereksinimleri izler.

1. Doku İşleme Alanını Ayarlama

1. Paslanmaz çelik tenli metal tepsi alın ve Şekil 1'degösterildiği gibi biyolojik tehlike torbası ile kaplayın. Biyolojik dokuların herhangi bir işleme tepsi alanı içinde yapılacaktır (yani, doku işleme alanı).
2. Gerektiğinde kolay erişim için tepsi etrafında laboratuvar cımbız, doku mendil, kağıt havlu, filtre kağıt paketi, doku boyası şişeleri, çamaşır suyu şişesi ve etanol şişe hazırlayın. Kullanılan tüm dokuları, mendilleri ve eldivenleri protokolün sonunda imha etmek için biyolojik tehlike malzeme yüzeyinde saklayın.
3. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünü %10 nötr tamponlu formalinin 45 mL'si ile doldurun ve doku işleme tepsisinin yanındaki santrifüj depolama tepsisine yerleştirin.

Şekil 1: Doku işleme alanının kurulumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. THz İletim Spektroskopisi için Taze Meme Kanseri Tümörü Kullanımı

DİkKAT: Herhangi bir canlı doku işleme önce, nitril el eldiven, göz koruma gözlükleri, bir yüz maskesi ve bir laboratuvar önlüğü koyun. Her zaman dokuları işlemek ve doğrudan elleriyle dokunmaktan kaçınmak için laboratuvar cımbız kullanın. Mühürlü bir kap veya tarama aşaması dışında taze doku ile tüm çalışmalar adım 1.1 kurulan doku işleme alanında yapılmalıdır.

NOT: Bu çalışmada ele alınan tüm dokular Dulbecco'nun Modifiye Kartal'ın orta (DMEM) ve biyobankadan antibiyotik çözeltisi ile sevk edildi.

1. Toplu tümörü DMEM çözeltisinden çıkarın ve doku işleme alanında bir Petri kabına yerleştirin (Bkz. Şekil 2A).
2. Brüt muayeneden, iletim karakterizasyonu için küçük parçaları dilimlemek için farklı tümör bölgelerini belirleyin. Şekil 2B'degösterildiği gibi, tanımlanan noktalardan 0,5 mm kalınlığında bir tümör parçasını paslanmaz çelik düşük profilli bir bıçak kullanarak kesin. Şekil 2C'degösterildiği gibi, sıvı numune tutucuya 0,1 mm kalınlığında bir boşluk bulunan iki kuvars pencere arasına bu dilimlenmiş bölümü yerleştirin.

Şekil 2: THz iletim spektroskopisi ölçümleri için tümör kesiti. (A) Toplu tümörün fotoğrafı. (B) Tümörden kesilen tümörün küçük bölümlerinin (0.5 mm) fotoğrafı. (C) Spektroskopi ölçümü için 0,1 mm politetrafloroetilen uzaycı ile iki kuvars pencere arasındaki sıvı numune tutucuya yerleştirilen dilimlenmiş tümör bölümü. Şekil SPIE izni ile T. Bowman ve^{ark. 18} yeniden yayınlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. THz İletim Spektroskopisi Ölçümleri

1. Modül tutamaçlarını çekirdek sistemdeki montaj direkleri üzerinde hizalayarak ve sahneyi sisteme kaydırarak THz çekirdek odası içindeki iletim spektroskopisi modüllerini ayarlayın. Şekil 3A'dagösterildiği gibi modülün sağ üst ve alt sol köşelerinde iki montaj vidasını sıkın.
2. Numune alanından su buharını temizlemek için tüm spektroskopi işlemi sırasında sistemi 5 L/dk (LPM) kuru azot gazı ile temizleyin.
3. THz şanzıman spektroskopisi ölçüm yazılımını THz sistemine bağlı masaüstünden açın. Ana pencereyi açacak.
4. Pencerenin üst kısmındaki Scan sekmesine tıklayın. Spectra Tcan Kurulum penceresi görüntülenir. Pencerenin sağ üst kısmındaki Ölçüm Modu sekmesinin açılır menüsünden iletim spektroskopisini ayarlamak için İletim'i seçin. Tepe otomatik olarak görülmüyorsa, Manuel Tepe Arama sekmesi nin altındaki Etkinleştir seçeneğini işaretleyin ve tepenoktasını görüntülemek için optik gecikmeyi el ile adımatın.
5. 30 dk tasfiye den sonra, aşağıdaki adımları izleyerek bir hava referans sinyali kaydedin.
   1. Spectra tarama kurulum penceresindeki Tarama Ayarları sekmesinin altında, başvuru dosyası için uygun bir Ad girin, Num Taramaları'yı 1.800 olarak ayarlayın ve Start Delay (s) (s)'yi 0'a ayarlayın. Diğer ayarları varsayılan değerleri olarak bırakın.
   2. Hava referans ölçümlerini almak için tbmkiçin kurulum penceresinde Ki Ölçüm Başvurusu'nu tıklatın. Daha sonra ~ 1 dk üzerinde 1.800 sinyalleri bir örnek ortalama olarak hava yoluyla iletim sinyali ölçmek için Ölçü Örnek tıklayın.

Şekil 3: THz iletim spektroskopi modülü kurulumu. (A) Üzerinde iletim modülü monte edilmiş THz çekirdek odası. (B) Sıvı numune tutucunun fotoğrafı. (C) Ölçümler için çekirdek haznesinin içine yerleştirilen numune tutucu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Şekil 3B'degösterildiği gibi sıvı numune tutucudaki iki kuvars pencereyi ölçün.
   1. İki kuvars pencereyi sıvı numune tutucuya, arada bir boşluk olmadan yerleştirin.
   2. THz çekirdek odasını açın. Şekil 3C'de gösterildiği gibi sıvı numune tutucuyu iletim spektroskopi modülüne monte edin. Odayı kapatın.
   3. Ana penceredeki Scan sekmesine tıklayın. Kuvars örneği için 3.5.1–3.5.2 adımlarını yineleyin, ancak Başlat Gecikmesi (s)ile 900'e güncelleyin. Bu ölçüm den önce herhangi bir su buharı temizlemek için zaman sağlar.
   4. Kuvars ek örnekler için referans olarak isteniyorsa, Tscan Ayarları'nın altındaki Başvuruyu Temizle sekmesine tıklayın. Bu hava referansını temizler. Ardından kuvars ölçümlerini yeni bir başvuru olarak kaydetmek için Ölçü Başvurusu sekmesine tıklayın.
7. Dilimlenmiş tümör bölümünü iki kuvars pencere arasına sıvı numune tutucunun içine yerleştirin ve dokuyu tek noktalı iletim ölçümü için tutucuyu odanın içine yerleştirin. Ölçümü kaydetmek için 3.6.3 adımını yineleyin.
8. Ölçümler tamamlandığında sıvı numune tutucuyu hazneden alın ve doku işleme için belirlenen alana getirin. Sıvı numune tutucuyu sökün, tümör bölümünü kuvars pencerelerden doku mendilleriyle silin ve kullanılan doku mendillerini diğer biyolojik tehlike atıklarıyla birlikte biyolojik tehlike torbasına atmak için aynı tepsiye yerleştirin.
9. Ek tümör dilimlerini karakterize etmek için gerekli olan 2.2, 3.7 ve 3.8 adımlarını tekrarlayın. Ölçümler tamamlandığında, ana pencereye gidin ve ölçüm verilerini kaydetmek için Dosya sekmesine tıklayın. Yazılım penceresini kapatın.

4. THz Yansıma Modu Görüntüleme için Taze Meme Kanseri Tümör Işleme

1. DMEM ve antibiyotik çözeltisinden taze tümör örneğini çıkarın ve petri kabına yerleştirin. Brüt muayene kullanarak, yeterince düz ve az kan ve az kan damarları olan görüntülenecek tümörün bir tarafı seçin. Mümkünse kan veya kan damarları ile görüntüleme doku kaçının.
2. Şekil 4A'dagösterildiği gibi, fazla DMEM'i kurutmak ve tümörden sıvı veya salgı dokusunu temizlemek için 1. Filtre kağıdındaki tümörü kağıt doygunluk ettikçe kuru bir noktaya yerleştirin. ~5 dk için tümör kuru.

Şekil 4: THz görüntüleme için taze tümör örneği hazırlığı. (A) Tümör kuruması için filtre kağıdına yerleştirilir. (B) Fazla sıvıları absorbe etmek için doku silme pedleri ile görüntüleme penceresi üzerinde polistiren plaka üzerine yerleştirilen tümör. (C) Tümör oryantasyon izlemek ve hava kabarcıkları kontrol etmek için aşağıdan izlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. İletim spektroskopisi modülünü boşaltın ve Şekil 5A'dagösterildiği gibi THz çekirdek sistemindeki yansıma görüntüleme modülünü (RIM) ayna tabanını ayarlayın. Aynaları ayarladıktan sonra, RIM tarama aşamasını ayna tabanının üzerine monte edin ve çekirdek sisteme vidalayın (Bkz. Şekil 5B).
4. Numune bölmesinden su buharını çıkarmak için görüntüleme işleminden önce 30 dk boyunca 5 LPM'de kuru azot gazı ile sistemi temizleyin. 30 dakika sonra, sistemin kullanımda olduğu süre boyunca kuru azot gazı miktarını 3 LPM'ye düşürün.
5. Çapın tarama penceresine ~1,2 mm kalınlığında bir polistiren plaka yerleştirin ~37 mm. Tarama penceresini örnek aşamasında polistiren plakayla birlikte ortalayın.

Şekil 5: Yansıma görüntüleme için sistem kurulumu. (A) Yansıma görüntüleme modülü ayna tabanı. (B) Tarama aşaması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NOT: Diğer kalınlıklar ve plaka malzemeleri adım 4.5 için uygundur ancak tek tip kalınlığa sahip olmalı ve THz sinyalini engellemeyeyecek kadar düşük emilim olmalıdır.

6. THz sistemine bağlı masaüstünden THz yansıma görüntüleme ölçüm yazılımını açın. Belirli işlevler için birkaç iletişim simgesi ve THz alan çizimleri için iki alt pencere (rasgele birimler a.u.) sırasıyla zaman ve frekans a.u. gösteren bir pencere açılır.
7. RIM kurulumu parametrelerini ayarlamak için pencerenin üst kısmındaki Görüntü Parametre İletişim ikonuna tıklayın. Görüntü Edinme Parametreleri penceresi açılır. Yansıma görüntüleme kurulumu için Şablon sekmesinin açılır menüsünden RIM'i seçin. Tamam'a vurun ve yazılımın ana penceresine geri dön.
8. Ana pencerede Sabit Nokta Lı Scan simgesine tıklayın. Bu olay THz sinyali gönderme ve polistiren plaka üzerinde tek bir noktadan yansıyan THz sinyali almaya başlamak için THz antenleri etkinleştirecektir.
9. Ana pencerenin üstündeki Motor Stage Dialog simgesine tıklayın. Motor kontrol penceresi açılacak. Ana penceredeki polistirenden yansıyan darbeyi ortalamak için ileri/geri yön oklarına tıklayarak optik gecikme eksenini ayarlayın.
   NOT: Optik gecikme eksenini ayarladıktan sonra, Şekil 6'dagösterildiği gibi pencerede iki darbe görünmelidir : biri polistiren plakanın alt arabiriminden (birincil yansıma) ve biri de polistiren plakanın üst arabiriminden (ikincil yansıma).
10. Polistiren plakadan birincil yansımayı dışarı pencere ve görüntüleme işlemi sırasında doku yansımaları katkıda bulunacak pencere, ikincil yansıması tutmak. Bu iki adımda yapılır.
    1. İlk olarak, DAQ ayarları iletişim penceresini açmak için ana pencerenin üst kısmındaki DAQ Ayarları düğmesine tıklayın. Optik gecikme değerini 5 V 'den (varsayılan) 4 V'e değiştirin.
    2. İkinci olarak, ikincil darbenin miniması en güçlü olana kadar tarama aşamasındaki mikrometre ölçeği ile tarama aşamasının dikey konumunu ayarlayın. Motor Kontrol Penceresi'ndeki eksenin optik gecikmesini ayarlayarak birincil yansımayı ölçülen yansıyan sinyalaralığının dışına koyun.
       NOT: 1,2 mm kalınlığındapolis tiren plakası için, birincil yansıma, zaman etki alanı penceresinin optik gecikme ekseninde ikincil yansıma minimum tepe noktası yaklaşık -0,3 mm olduğunda pencereden dışarı pencereliolarak yansıtılır.

Şekil 6: Polistiren plakanın alt ve üst arabirimlerinden THz yansımaları. (A) THz sinyal olayı ve 1.2 mm kalınlığında polistiren plaka yansıyan. (B) Polistirenden birincil ve ikincil THz zaman etki alanı sinyalleri ölçülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

11. Örnek aşamayı seviyealtın ve referans sinyalini kaydedin.
    1. Her eksende iki nokta (A ekseni ve B ekseni) seçin ve örnek pencerenin kenarına yakın polistiren plakaüzerindeki konumları belirtin. Örneğin, -15 mm-15 mm arasında değişen A ekseni için iki konum noktası -10 mm ve 10 mm olabilir; -15 mm-15 mm arasında değişen B ekseni için iki konum noktası -10 mm ve 10 mm olabilir.
    2. Motor kontrol penceresini açmak için Motor Denetimi İletişim düğmesine tıklayın. Motor kontrol penceresini ve ana yazılım penceresini, motor konumlarını ayarlarken zaman etki alanı sinyalinin görünür olması için yeniden konumlandırın. Hem A eksenini hem de B eksenini 0 mm'ye ayarlayın.
    3. Aşağıdaki adımları kullanarak A eksenini seviyedüzeyi. Örnek olarak -10 mm-10 mm aralığı kullanılır.
    4. Motor Kontrol Penceresinde,A ekseninin değerini 0'dan -10'a değiştirin ve Entertuşuna basın. Sahne A ekseninde -10 mm konumuna taşınır ve ana penceredeki sinyal pozisyonunda bir kayma gözlenir.
    5. Sinyalin minimum tepe noktasını adım 4.10.2'de ayarlanan konuma geri taşımak için Şekil 5B'de gösterilen tarama aşamasında ayarlanabilir mikrometre ölçeğini kullanın.
    6. A ekseni değerini +10 olarak değiştirin ve enter tuşuna basın. Sahne şimdi -10 mm konumundan A ekseninde +10 mm konuma hareket edecek ve sinyalde bir kayma tekrar gözlenecek. Sinyalin önceki konumundan kaydığı yönü ve uzaklığı not edin ve A ekseni değerini yeniden -10 olarak değiştirin. Sinyal adım 4.11.5'te belirlenen konuma geri dönecektir.
    7. Şekil 5B'de gösterildiği gibi tarama aşamasının A eksenindeki tesviye vidasını döndürün ve sinyali orijinal konumdan hareket ettiği yöndeki mesafeyi iki katına çıkaracak şekilde kaydırın. Sinyali orijinal konuma geri kaydırmak için tarama aşamasındaki mikrometreyi kullanın (1,2 mm polistiren için-0,3 mm).
    8. +10 ve -10'daki sinyal eşit olana ve her iki pozisyon için tepe noktası orijinal konuma (optik eksende-0,3 mm) odaklanana kadar 4.11.6-4.11.7 adımlarını tekrarlayın.
12. A ekseninin tesviyesi sağlandıktan sonra, A ekseni değerini 0 olarak değiştirin ve B ekseni için aynı yordamı tekrarlayın. Motor kontrol penceresi üzerindeki B ekseninin değerini 0'dan en pozitif değere (örneğin +10 mm) değiştirerek başlayın. Ayrıca, tesviye sırasında, Şekil 5B'degösterilen tarama aşamasının B ekseninde tesviye vidasını kullanın.
13. Her iki eksen de tesviye edildikten sonra, hem A eksenini hem de B eksenini 0 mm'ye döndürün. Motor Control Window
14. Bu sinyali referans olarak kaydedin.
    1. Ayarlanan DAQ Özellikleri penceresine gidin. Ortalama değeri 5 olarak değiştirin ve diğer tüm parametreleri varsayılan olarak tutun.
    2. Yeni Başvuru'yatıklayın. Pencerenin sağ üst kısmındaki ortalama sayaç 0-20 arasında sayılacaktır. Sayaç 20'ye ulaştığında, ortalama değeri 1 olarak değiştirin ve Tamam'ıtıklatın. Polistiren den yansıyan sinyal daha sonra alınan herhangi bir tarama için referans olarak kaydedilir.
       NOT: Eğer sadece THz görüntüleme işlemi yapılacaksa, tümör dokusunu DMEM çözeltisinden çıkarmadan önce 4.3-4.14 adımlarını atmak en iyisidir.
15. Tarama sahne penceresini kaplayan polistiren plakaüzerine tümörü monte edin.
    1. Görüntüleme penceresini tarama aşamasından çıkarın ve doku işleme alanına getirin. Şekil 4B'degösterildiği gibi tümörü polistiren plakaya yerleştirin.
    2. Plaka ve tümör arasında önemli bir hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Hava kabarcıkları gözlenirse, cımbızla tümöre basın veya tümörü kaldırın ve hava boşlukları en aza indirilene kadar nazikçe polistiren üzerine yuvarlayın.
    3. Ezilebilir boşlukları Şekil 4B'degösterildiği gibi test örneğinin etrafına düzenli aralıklarla yerleştirin. Tümörün üzerine başka bir polistiren plaka yerleştirin ve tümörün yüzeyini mümkün olduğunca düz hale getirmek için hafifçe bastırın. Örnek penceredeki polistiren-tümör-polistiren düzenini bantlayın.
16. Şekil 4C'degösterildiği gibi örnek pencereyi çevirin ve yönünü kaydetmek için tümörün fotoğraflarını çekin. Tümörle birlikte örnek pencereyi tarama aşamasına geri verin.
17. Görüntü Edinme Parametreleri penceresini açmak için Görüntü Parametre İletişim düğmesine tıklayın. Axis1min, Axis1max, Axis2minve Axis2max değerlerini tam olarak görüntüleme penceresinde tümörün konumunu içine almak için ayarlayın
    NOT: Varsayılan olarak, Axis1 A ekseni, Axis2 ise B eksenidir.
18. Görüntüleme taraması için Axis1step ve Axis2step'i 0,2 mm olarak ayarlayın.
    NOT: Axis1step ve Axis2step'in ayarlanması, tarama işlemi sırasında step motorlarının adım boyutunu 200 m'lik artışlara ayarlar. Toplam tazyik süresi Görüntü Edinme Parametreleri penceresinde tahmin edilebilir.
19. Ana penceredeki Ölçü sekmesine tıklayın ve Flyback 2D Taramayı seçeneğini belirleyin. Açılan pencerede, tazyik verilerini kaydetmek için altındaki dizin ve dosya adını belirtin.

5. Histopatoloji Prosedürüne Hazırlık Ta Taze Dokunun Postprocessing

1. Tarama işlemi tamamlandıktan sonra, numune penceresini, polistiren plakaları ve çekirdek THz sisteminden numune alın ve bunları tehlikeli atıklar için belirlenen alana taşıyın. Polistiren plaka dan tümör çıkarın ve tümörün karşılaştırılabilir bir boyutta karton düz bir parça üzerine yerleştirin. Tümörün yönünün polistirendekiyle aynı olduğundan emin olun, görüntüleme yüzü kartona değdi.
2. Kırmızı doku boyası bir pamuk lu bez batırın ve tümörün kenarı karton temas yere aşağı tümörün sol tarafında leke. Benzer şekilde, mavi doku boyası ile tümörün sağ tarafını leke. Şekil 7A'dagösterildiği gibi, kırmızı lekeyi mavi lekeye bağlayan sarı doku boyası ile tümörün açık yüzeyini lekelemek.
   NOT: Mürekbin formalin çözeltisini boyamasını önlemek için dokuya sadece ince bir tabaka uygulayın. Bu doku boyama önce farklı bir yüzeye pamuk lu bez dabbing veya herhangi bir aşırı boya silmek için temiz bir pamuklu bez kullanarak yapılabilir. Boyanın cilde veya giysiye temas etmesine izin vermekten kaçının. Bu tümör boyama işlemi, tümörün görüntüleme tarafı ve patoloğa yönelimi hakkında bilgi vermek için referans olarak yapılır.

Şekil 7: THz görüntüleme sonrası tümör üzerinde post işleme. (A) Tümör karton tutucu üzerine yüz üstü yerleştirilir ve doku işaretleme boya ile boyanmış. (B) Filtre kağıdı tümörün üzerine yerleştirilir ve teması korumak için bantlanır. (C) Lekeli tümör karton üzerine sabit% 10 nötr tamponlu formalin çözeltisi batırılmış ve parafilm ile mühürlü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Mürekbün yaklaşık 3-4 dk kurumasına izin verin. Tümörün üzerine yerleştirin ve Şekil 7B'degösterildiği gibi filtre kağıdı ve karton etrafında tamamen bant bir parça sarın. Bant ve filtre kağıdı herhangi bir önemli basınç uygulamadan karton karşı tümör güvenli olmalıdır.
4. Kartona yapıştırılan lekeli dokuyu %10 nötr tamponlu formalin çözeltisi içine batırın ve Şekil 7C'degösterildiği gibi bir parafin filmi kullanarak santrifüj tüpünü kapatın. Tüp etiketindeki örnek için örnek numarasını, tarihini, doku türünü ve tümör numarasını belirleyin. Daha fazla histopatoloji işleme için patoloğa tümörü gönderin.

6. Tehlikeli Atık Bertaraf

1. Şekil 8'degösterildiği gibi, tepsiyi kaplamak ve yeni bir biyolojik tehlike torbasına koymak için kullanılan biyolojik tehlike torbası ile birlikte doku işleme tepsisinden tüm atıkları toplayın. Çantayı binadaki belirlenen biyolojik tehlikeli atık alanına getirin ve atık ların geri alımı için Çevre Sağlığı ve Güvenliği (EH&S) departmanından randevu alın. % 10 çamaşır suyu çözeltisi ve etanol ile masanın doku işleme tepsisi ve çevresindeki alanı temizleyin.

Şekil 8: Biyolojik atık torbasının fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Spacers ve kuvars pencereler, tümör monte edildi örnekleme penceresi, polistiren plakalar ve laboratuvar cımbız yıkama alanına sıvı numune tutucu alın. Tüm malzemeleri suyla durulayın ve ardından %10 çamaşır suyu çözeltisini, doku enkazLarını çıkarmak için gerektiğinde kağıt havlularla silin. Tekrar su yla durulayın, alconox çözeltisi ile fırçalayın ve iyice durulayın. Cam ve plastik eşyalar için % 70 isopropil alkol durulayın ve kuruması için bir kenara koyun.
   NOT: Tümör formalin ve numune alanı temizlendikten sonra, veri işleme görüntüleme veya daha sonraki bir zamanda aynı anda işlenebilir.

7. THz görüntülerinin Oluşturulması için Veri İşleme

1. Kaydedilen .tvl veri dosyalarını THz sisteminden dışa aktarın. Sistemden elde edilen ham veri dosyaları Python'da yazılır ve MATLAB veri dosyaları olarak kaydetmeden önce Python'da en iyi şekilde okunur.
2. Taranmış taze dokunun THz görüntüsünü oluşturmak için ham veri matrisinin üçüncü boyutunda (yani zaman boyutuna) Fourier dönüşümü kullanarak ham zaman etki alanı yansıtma görüntüleme verilerini frekans etki alanına dönüştürün. Ayrıca referans verilerinin Fourier dönüşümünü de ele alalım.
   NOT: Tipik bir frekans etki alanı spektrumu 0,1 THz-4 THz arasında değişen veriler sağlamalıdır.
3. Örnek verileri referans verileriyle normalleştirin ve aşağıdaki denklemi kullanarak f₁ = 0,5 THz ile f₂ = 1,0 THz arasındaki frekans aralığında normalleştirilmiş verilerin entegrasyonuna dayalı güç^spektrumunugerçekleştirin :
   
   NOT: Burada E_örnek doku örneğinin frekans etki alanı yansıma görüntüleme verileri ve E_referans referans sinyalinin tek bir nokta yansıma verilerinin frekans etki alanıdır.
4. A ekseni ve B ekseni tarafından tanımlanan matristeki her noktada hesaplanan güç spektrum verilerini çizerek iki boyutlu görüntüyü oluşturun. Bu güç spektrumu THz görüntü olarak bilinir.
   NOT: Bunun yerine tomografik THz görüntü elde etme yöntemi 7.5-7.7 adımlarında ayrıntılı olarak açıklanır.
5. Karakterizasyon için, aşağıdaki^{denklemi 18}kullanarak potansiyel doku özellikleri bir dizi teorik frekansa bağlı yansıması hesaplamak:
   
   NOT: Burada ρ_T,ij bölge i ve bölge j;d_j arasındaki karmaşık Fresnel yansıma katsayısı j;d j bölgesinin kalınlığıdır; j bölgesinin yayılım açısı ise Snell Yasası'nın insidansı açısına bağlı olarak j bölgesidir. _j bölge jkarmaşık yayılma katsayısı , ω açısal frekans olduğu, c vakum ışık hızı, n_j kırılma indeksi gerçek parçası, ve α_abs,j emme katsayısı¹⁸. Bölge 1 hava, Bölge 2 polistiren plaka ve Bölge 3 dokudur.
6. Bölge 3(n₃ ve α_abs,3)için kullanıcı tarafından tanımlanan kırılma indeksleri ve soğurma katsayıları aralığı için (2) denklemindeki yansımayı hesaplayın ve büyüklük ve faz için toplam ortalama kare hatasını hesaplamak için her noktada ölçülen sinyalle karşılaştırın.
   NOT: Kırılma indisi ve soğurma katsayısı için çözüm, en düşük hatayı veren değerler çiftidir.
7. Çıkarılan kırılma indisi ve soğurma katsayısı verilerinden(n₃ ve α_abs,3)her pikselde tomografik THz görüntüsünü oluşturun. Patologdan elde edilen patoloji slayt görüntüsü ile karşılaştırarak tümör bölgelerini analiz edin. Temsili sonuçlar Şekil 9'dagösterilmiştir , Şekil 10 ve Şekil 11'dekiprotokole yetersiz bağlılık örnekleri ile.

8. İletim SpektroskopiSi Verileri Kullanılarak Dokunun Elektriksel Özelliklerinin Çıkarılması

1. THz iletim spektroskopisi ölçüm yazılımının ana penceresinde Dosya sekmesine gidin ve Dışa Aktarma seçeneğine tıklayın. Dışa aktarmak için Veri Türü ve Örnek'i seçmek için bir pencere açılır. Kuvars ve doku örneği ölçümleri için Verici ve İletim Fazı veri türlerini seçin.
2. Aşağıdaki denklem^ibareyikullanarak bir dizi potansiyel doku özelliği için teorik frekansa bağlı iletimi hesaplayın:
   
   NOT: İşte örnek ve referans kurulumları için Fresnel iletim katsayıları arasındaki oran; γ₁ ve γ₃ sırasıyla hava ve dokunun karmaşık yayılma sabitleridir; ve d doku kalınlığıdır. Genel olarak yayılma sabiti olarak tanımlanır. ñ, n'nin kırılma indeksi'nin gerçek parçası olduğu karmaşık kırılma indisidir; c ışık hızıdır; ω açısal frekanstır; α _abs emme katsayısı^15'tir.
3. Denklem (3) denkleminde iletimin büyüklüğü ve fazı ile kullanıcı tarafından tanımlanan n ve α_abs değerleri aralığı için sistemden alınan ölçüm verilerini arasındaki toplam ortalama kare hatasını hesaplayın.
   NOT: Kırılma indisi ve soğurma katsayısı için çözüm, en düşük hatayı veren değerler çiftidir.
4. Çıkarılan kırılma indisi ve emilim katsayısı verilerini 0,15-3,5 THz arasındaki frekans Figure 12aralığına göre çizin.

Sonuçlar

Biyobanktan alınan insan meme kanseri tümör numunesi #ND14139 yukarıda belirtilen protokolden sonra elde edilen THz görüntüleme sonuçları^Şekil 9'dasunulmuştur. Patoloji raporuna göre #ND14139 tümörü sol meme lumpektomi ameliyatı ile 49 yaşındaki bir kadından alınan I/II sınıfı infiltrasyon duktal karsinom (IDC) idi. Tümörün fotoğrafı Şekil 9A'dagösterilmiştir , Şekil 9B'dekipat...

Tartışmalar

Taze dokunun etkili THz yansıması görüntüleme sebeb iki kritik unsura bağlıdır: 1) doku işlemenin doğru değerlendirilmesi (bölüm 2 ve 4.15); ve 2) sahne kurulumu (öncelikle bölüm 4.11). Dokunun yetersiz kuruması, DMEM ve diğer sıvıların yüksek yansımaları nedeniyle bölgelerin yansımasının artmasına ve görüntülenememe neden olabilir. Bu arada, görüntüleme penceresi ile zayıf doku teması sonuçları gizlemek THz yansıma görüntü halkaları veya düşük yansıma noktalar oluşturur. ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% isopropyl alcohol	VWR	89108-162	Contains 70% USP grade isopropanol and 30% USP grade deionized water
Alconox powder detergent	VWR	21835-032	Concentrated detergent to remove organic contaminants from glass, metal, stainless steel, porcelain, ceramic, plastic, rubber, and fiberglass
Bio Hazard Bags	Fisher Scientific	19-033-712	Justrite FM-Approved Biohazard Waste Container Replacement Bags
Cardboard holder	N/A	N/A	Scrap cardboard to keep tissue imaging face intact when immersed in formalin
Centrifuge Tubes	VWR	10026-078	Centrifuge Tubes with Flat Caps, Conical-Bottom, Polypropylene, Sterile, Standard Line
Cotton Swabs	Walmart	551398298	Q-tips Original Cotton Swabs used to dye the tissue
Ethyl Alcohol	VWR	71002-426	KOPTECH Pure (undenatured) anhydrous (200 proof/100%) ethyl alcohol
Eye protection goggles	VWR	89130-918	Kimberly-clark professional safety glasses
Face Mask	VWR	95041-774	DUKAL Corporation surgical masks
Filter paper	Sigma Aldrich	Z240087	Whatman grade 1 cellulose filters
Formalin solution	Sigma Aldrich	HT501128-4L	10% neutral buffered formalin
Human freshly excised tumors (Infilterating Ductal Carcinoma (IDC))	National Disease Research Interchange (NDRI biobank	N/A	A protocol is signed with the NDRI for the type of tumors required
IRADECON Bleach solution	VWR	89234-816	Pre-diluted Sodium Hypochlorite Bleach solution
KIMTECH SCIENCE wipes	VWR	21905-026	Kimberly-clark professional Kim wipes
Laboratory Coat	VWR	10141-342	This catalog number is for medium size coat
Laboratory tweezers/Forceps	VWR	82027-388	Any laboratory tweezers can be used as long as it does not damage the tissue
Liquid sample holder (two quartz windows with a 0.1 mm teflon spacer)	TeraView, Ltd	N/A	1" diameter, and 0.1452" thick quartz windows
Nitrile hand gloves	VWR	82026-426	This catalog number is for medium size gloves
Nitrogen cylinder	Airgas	NI UHP300	NITROGEN UHP GR 5.0 SIZE 300
Paper towel	VWR	14222-321	11" x 8.78" Sheets, 1 Ply
Parafilm	VWR	52858-076	Flexible thermoplastic. Rolled, waterproof sheet interwound with paper to prevent self-adhesion.
Petri Dish	VWR	470210-568	VWR Petri Dish, Slippable, Mono Plate (undivided bottom)
Polystyrene Plate	Home Depot	1S11143A	~ 10 cm x 10 cm square piece cut from a 11" x 14" x 0.05" Non-glare styrene sheet
ScanAcquire Software	TeraView, Ltd	N/A	System Software for THz reflection imaging measurements
Stainless steel low-profile blade (#4689)	VWR	25608-964	Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades
Stainless steel metal tray	Quick Medical	10F	Polar Ware Stainless Steel Medical Instrument Trays
Tissue Marking Dyes	Ted Pella, Inc	Yellow Dye #27213-1 Red Dye #27213-2 Blue Dye #27213-4	Used to orient excised tissue samples sent to the histopathology laboratory
TPS Spectra 3000	TeraView, Ltd	N/A	THz imaging and spectroscopy system
TPS Spectra Software	TeraView, Ltd	N/A	System Software for THz transmission spectroscopy measurements