Murin Kalp Nakli için Manşet Tekniğinin Optimizasyonu

Özet

Biz manşet üzerinde evert yardımcı olmak için fare servikal heterotopik kalp nakli için manşet tekniği bir iç tüp yaklaşım tanıtmak. İki deneyimli cerrah arasındaki işbirliğinin ameliyat süresini belirgin bir şekilde kısalttAdığını gördük.

Özet

40 yılı aşkın bir süredir rüren kalp nakli yapılmaktadır. Mikrocerrahideki gelişmelerle birlikte cerrahi verimliliği artırmak için bazı yeni teknikler kullanılmıştır. Laboratuvarımızda manşet tekniğini iki ana adımla optimize ettik. İlk olarak, iç tüp tekniğini kullanarak dış juguler vene ve karotis arter kan damarına geçici bir iç tüp yerleştirerek kabın manşet üzerinde eversiyonını kolaylaştırdık. İkinci olarak, iki deneyimli cerrahın işbirliği ile tam heterotopik kalp nakli gerçekleştirdik. Bu modifikasyonlar çalışma süresini %95'lik bir başarı oranıyla 25 dakikaya indirdi. Bu raporda, bu yordamları ayrıntılı olarak açıklar ve ek bir video sağlarız. Geliştirilmiş manşet tekniği ile ilgili bu raporun, murine heterotopik kalp nakli için pratik rehberlik sunacağına ve temel araştırmalar için bu fare modelinin yararını artıracağına inanıyoruz.

Giriş

1973 yılında karın içinde uçtan uca anastomoz yoluyla fare heterotopik kalp nakli kurulması temel transplantasyon immünoloji araştırma¹önemli bir kilometre taşı oldu. Bu model iskemi reperfüzyon yaralanma mekanizmaları analiz etmek için önemli ve geçerli bir araç sağlanan², immünolojik ret, ve tolerans^3,4. Ancak, cerrahinin karmaşık ve zaman alıcı doğası nın yanı sıra enfeksiyon potansiyeli ciddi perioperatif abdominal yapışıklıklara ve inflamatuar reaksiyonlara neden olabilir ve heterotopik kalp transplantasyonu modelinde düşük verimlilik sağlar.

Servikal heterotopik kalp nakli tekniği ilk olarak Chen tarafından 1991⁵yılında tanımlanmıştır. Bu modelde, alıcının dış juguler ven greft pulmoner arter ekadar ve karotis arter artan aort anastomosed. Bu yöntemin başlıca avantajları izleme kolaylığı ve alıcıya travma azaltılması vardır. Aynı yıl, Matsuura geliştirilmiş bir teknik tarif, hangi dış juguler ven ve karotis arter sonunda bir Teflon manşet üzerinde everted ve bir çevresel ipek ligature ile sabit⁶. Bazı araştırmacılar da alıcının dış juguler ven içine manşet eklemeden önce donör kalp sağ pulmoner arter manşet sabit⁷. Şimdiye kadar, manşet tekniği yaygın akciğer^8,karaciğer^9,ve renal¹⁰ transplantasyonu için olanlar da dahil olmak üzere çeşitli vasküler pedikül nakli modelleri, uygulanmıştır.

Bugüne kadar, manşet tekniği ile ilgili çeşitli zorluklar vardır. Örneğin, karotis arter ek elastikiyet nedeniyle manşet üzerinde evert zordur, doku geriye doğru takla ile sonuçlanan. Bu nedenle bu adımı tamamlamak için ek uygulama ve mikrocerrahi dilatör gerekebilir. Buna ek olarak, servikal damar hazırlanması 25 dakika kadar sürebilir.

Bu sorunları çözmek için, biz manşet tekniğine dayalı ve damar duvarının eversion yardımcı olmak için bir iç tüp kullanarak dış juguler ven ve karotis arter üzerinde manşet sabitleme içeren iç tüp tekniği, tanıtmak. Buna ek olarak, basit eğitim ile, alıcı hazırlık 15,5 dakika ya da azalır. Bu teknik operasyonun karmaşıklığını azaltır ve ek uygulama veya vasküler dilatör kullanımını gerektirmez. Tüm transplantasyon immün araştırmalarda uygulanabilir, özellikle alıcı iki kardiyak allografts alır sırasında üçüncü taraf bağışıklık toleransı doğrulamak için, karın içinde ve boyun diğer¹¹. Ayrıca bu modeli oluşturmak için iki yetenekli cerrah arasında işbirliği yapmanızı öneriyoruz, bir cerrah alıcı hayvanı hazırlarken diğeri donör kalbi hasat edip implante eder. Bu tür işbirliği çalışma süresini 25 dakikaya kısaltabilir. Bu optimize prosedürü kullanarak, biz syngeneic kurduk, allojenik^{12,13,14,15,16,17,18,19}, ve ksenojenik fare kalp nakli modelleri²⁰.

İç tüp tekniğinin geliştirilmesinin mantığı, yüksek başarı oranına sahip bir fare kalp nakli modelinin kurulması için çalışma süresini kısaltmaktı. Servikal kalp nakli modelinin optimizasyonu, geleneksel dikiş ve manşet tekniğine göre kısa bir süre içinde yüksek başarı oranlarının elde edilmesine yardımcı olur^21. Ayrıca, işbirliği modeli daha da tek bir operatör ile yapılan ameliyatlar ile karşılaştırıldığında donör kalbin sıcak iskemik süresini azaltabilir.

Protokol

Hayvanlar (BALB/c, C57BL/6, erkek, 8-12 hafta) Xiamen Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Merkezi'nde özel bir patojensiz tesiste bulunmaktadır. C57BL/6 alıcı olarak, BALB/c donör olarak kullanılır. Tüm işlemler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine göre gerçekleştirilir.

NOT: Operasyon için mikro makas, mikro düz forseps, mikro kavisli forseps ve mikro iğne tutucular gibi bir dizi mikrocerrahi alet gereklidir(Tablo ve Malzemeler, Şekil 1B, C, D, E). Tek kullanımlık bulldog kelepçeler bir çift(Şekil 1F)gereklidir. Dış juguler ven ve karotis arter için iki manşet bir mikroskop altında no. 10 neşter ile özelleştirilmiş poliamid tüpler kesilerek hazırlanır. Ven ve arter manşetinin çapı sırasıyla 0.9 mm ve 0.55 mm'dir. Buna ek olarak, ilgili ven manşet için iç tüpün çapı 0.6 mm, ve bu ilgili arter manşet için iç tüp 0.28 mm(Şekil 1G).

1. Alıcı nın hazırlanması

1. Pentobarbital (60 mg/kg, i.p) ile alıcı fareyi anestezi edin. Sağ lateral servikal bölgede saç kaldırmak için atravmatik mekanik makası kullanın.
2. İyot antiseptik ve ardından %70 etanol ile cerrahi alanı silmek için steril bir pamuk ucu aplikatör kullanın.
3. Fareyi işlem platformunda supine pozisyonunda yerleştirin. Fareyi steril gazlı bezle örtün.
4. Sağ omuz köprücük kemiği eklem alt üçte bir boyun orta hat bir enine kesi yapmak için bir oftalmik makas kullanın.
5. Mikro kavisli forceps ile doğru dış juguler ven yeterli uzunlukta ortaya çıkarmak için izole, elektrokoagülasyon yoluyla dalları kesmek, ve 6-0 ipek sütür kullanarak distal ucunda damar ligate.
6. Bir bulldog kelepçe kullanarak proksimally harici juguler ven kelepçe ve daha sonra bir mikro makas kullanarak ligatür için proksimal ven transect.
7. Damar lülesini 100 U/mL 0-4 °C heparinize salin ile yıkayın ve artık kanı temizler.
8. Mikro düz forceps kullanarak damar manşet içip harici juguler ven çekin; bir stent olarak lümen içine damar iç tüp yerleştirin ve mikro düz forceps ile manşet üzerinde damar duvarı evert(Şekil 2A).
9. Bir circumferential 8-0 kullanarak manşet proksimal ucunda everted damar endotel düzeltmek ipek sütür (Şekil 2B).
10. Damar damarından damar iç tüpünü çekmek için mikro düz forceps kullanın.
11. Sternokleidomastoid iç kenarına bitişik sağ karotis arter izole etmek için mikro kavisli forceps ile künt diseksiyon gerçekleştirin.
12. Bir bulldog kelepçe kullanarak sağ karotis arter proksimally kelepçe, 6-0 ipek sütür kullanarak distal karotis arter ligate, ve ligatür yakın karotis arter transect için bir mikro makas kullanın.
13. Karotis arteri 100 U/mL 0-4 °C heparinize salin ile yıkayın ve artık kanı temizler.
14. Arter manşet yoluyla karotis arter geçirin ve mikro düz forceps kullanarak arter damar içine arter iç tüp eklemek (Şekil 2C).
15. Mikro düz forceps kullanarak manşet üzerinde gemi Evert; bir çevre 8-0 kullanarak everted damar endotel düzeltmek ipek sütür (Şekil 2D).
16. Mikro düz forceps ile arter damarından arter iç tüp çekin.
    NOT: Alıcının submandibular bezini koruyun.

2. Donör hazırlanması

1. Pentobarbital (60 mg/kg, i.p) ile donör fareanestezik. Karın bölgesindeki saçı çıkarmak için travmatik mekanik makaslar kullanın.
2. Fareyi işlem platformunda supine pozisyonunda yerleştirin. Fareyi steril gazlı bezle örtün.
3. İyot antiseptik ve ardından %70 etanol ile cerrahi alanı silmek için steril bir pamuk ucu aplikatör kullanın.
4. Bir oftalmik makas ile bir karın orta hat insizyonu yapmak ve karın boşluğu maruz.
5. Inferior vena kavasını ortaya çıkarmak için mikro kavisli forceps kullanın ve daha sonra intravenöz olarak 200 μL 100 U/mL 0-4 °C heparinize salin iline inferior vena kava yoluyla 20 g vücut ağırlığı.
6. Oftalmik makas ile torakotomi yapın, iki taraflı midaxillary line kesiler aracılığıyla kaburga kesmek, torasik boşluğu ortaya çıkarmak için ön göğüs duvarı dışa doğru çevirin.
7. Timusu mikro kavisli forceplarla boşaltın.
8. Aort maruz, ve sonra aort kemer imal koroner arter e-koroner arter e-100 U/mL 0-4 °C heparinize salin 200 μL perfuse.
   NOT: Donör kalbine gaz kabarcıkları sokmaktan kaçının.
9. Aort kemerbaşında artan aort transect için bir mikro makas kullanın.
10. Pulmoner arteri iki ana dalı mikro makasla geçirin.
11. 6-0 ipek sütür kullanarak superior vena kava ve inferior vena cava proximally ligate ve ligature distal ven transect ven için bir mikro makas kullanın.
12. Pulmoner damarları birlikte, çevresel olarak, tek bir 6-0 ipek sütür kullanarak ligate ve bir mikro makas kullanarak ligatür distal ven dalları kesti.
13. Çevredeki yumuşak dokulardan kalp greftini çıkarın; 0-4 °C heparinize tuzlu olarak muhafaza edin.

3. Kalp implantasyonu

1. Donör kalbini alıcının sağ boyun bölgesine ters çevirin.
2. Donör kalbin pulmoner arterini mikro düz forcep'lerle 6-0'lık bir ipek halkasına sok.
3. Damar manşetetrafında damar lümen sarın ve sonra damar eklem bant manşet etrafında 6-0 ipek dikiş döngüleri sıkın.
4. 3.2 adımda açıklanan adımları izleyerek greft ve arter manşetinin aort anastomozisini gerçekleştirin.
5. Kenetlenmiş juguler ven ve ardından kenetlenmiş juguler arteri bırakın. Damar eklemini bükülmemiş tutun ve kan akışının engellenmediğinden emin olun.
   NOT: 1 dk içinde 200'den fazla kez dönen sinüs ritmi normal kabul edilir.
6. Sıcak (37 °C) tuzlu su yla donör kalbini nemlendirin ve greftin kanama olup olmadığını kontrol edin. Pulsing kalp greftini deri altı uzaya ayarlayın ve sonra kesiyi dikin.

4. Postoperatif Bakım ve Greft Değerlendirmesi

1. Postoperatif greft fonksiyonunu izlemek için kelepçe salımdan sonra en az 5 dakika normal sinüs ritmine ve normal sinüs ritminin korunmasına kadar süreyi kaydedin.
2. Alıcı anesteziden uyanana kadar alıcıyı sıcak bir battaniyenin üzerine tek başına yerleştirin. Ameliyat sonunda ve ameliyat sonrası 72 saat boyunca her 12 saatte bir buprenorfin analjezisi, 0.05 mg/kg, s.c uygulayın.
3. Alıcının ağırlığını ve ameliyat sonrası iyileşme durumunu günlük olarak kaydedin. Ameliyat tarihinde buna göre %>%15 kilo kaybı, hemiplejik felç veya enfeksiyon durumunda, terminal isofluran inhalasyonu²¹ile alıcıyı ötenazi yedirin.
4. Her gün palpasyon ile greft sağkalımlarını izleyin. Mürin allograft >72 saat hayatta ise ameliyat başarılı olarak kabul edilir. Daha önce bildirilen greft fonksiyonu,²²: Ölçek 3 - şiddetle zonklama ve sıklığı; Ölçek 2 - daha az pulsate; Ölçek 1- fibrilasyon ve yakın ret; veya Ölçek - 0, kalp atışı kaybı ve tam reddi.

Sonuçlar

Cerrahi Operasyon Süresi

Eğitimden sonra, yetenekli bir cerrah ameliyatı iç tüp tekniğini kullanarak 35 dakika içinde başarıyla gerçekleştirebilir, alıcının hazırlanması için yaklaşık 15,5 dakika, donör hazırlanması için 10,9 dakika, donör kalp anastomozları için ise 4,4 dakika gereklidir. Soğuk ve sıcak iskemi süresi (donör preparatından kalp implantasyonuna kadar) iç tüp tekniği ve dikiş tekniği olmadan manşet tekniği kullanılarak yapı...

Tartışmalar

Fare kalp nakli modelleri nakil immünoloji araştırmaları için önemli araçlardır, çünkü bu modelin bağışıklık mekanizmalarını değerlendirmek için gerekli araç ve gereçler ve çok sayıda gen modifiye edilmiş fare mevcuttur. Ancak, damar sütür ve eversiyon gibi mikrocerrahi teknik zorluklar, yaygın kullanımını sınırlandırmış. Bu çalışmada, mindik kalp naklinin bazı temel teknik zorluklarını araştırdık ve iyi sonuçlar elde ettik. Protokolün kritik bir adım manşet üzerinde dama...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artery cuff	Self-made		Polyamide tube. diameter: 0.55 mm,length: 1.0 mm
Artery inner tube	Self-made		Polyamide tube. Diameter: 0.28mm
Micro curved forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA3050	1/8 arc, 0.3-mm tip without a hook
Micro needle holders	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA2050	0.2-mm tip
Micro scissors	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA1050	Straight, blade length: 10 mm
Micro straight forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA3060	0.15-mm tip without a hook
Scanlan Vascu-Statt Bulldog Clamps	Scanlan International Inc	1001-531	Clamping pressure 20–25 grams
Vein cuff	Self-made		Polyamide tube. diameter: 0.9 mm,length: 1.2 mm
Vein inner tube	Self-made		Polyamide tube. Diameter: 0.6 mm