Ottimizzazione della tecnica del bracciale per il trapianto di cuore di Murine

Riepilogo

Introduciamo un approccio della camera d'aria alla tecnica del polsino per il trapianto di cuore eterotopico cervicale del topo per aiutare a evert il vaso sopra il polsino. Abbiamo scoperto che la cooperazione tra due chirurghi esperti riduce notevolmente i tempi di funzionamento.

Abstract

Il trapianto cardiaco di Murine è stato eseguito per più di 40 anni. Con i progressi nella microchirurgia, alcune nuove tecniche sono state utilizzate per migliorare l'efficienza chirurgica. Nel nostro laboratorio, abbiamo ottimizzato la tecnica del bracciale con due passaggi principali. In primo luogo, abbiamo usato la tecnica della camera d'aria per inserire una camera d'aria temporanea nella vena giugulare esterna e nel vaso sanguigno carotide per facilitare l'eversione del vaso sul polsino. In secondo luogo, abbiamo eseguito un completo trapianto cardiaco eterotopico attraverso la collaborazione di due chirurghi esperti. Queste modifiche hanno ridotto effettivamente il tempo di funzionamento a 25 minuti, con un tasso di successo del 95%. In questo rapporto vengono descritte in dettaglio queste procedure e viene fornito un video supplementare. Riteniamo che questa relazione sulla tecnica del bracciale migliorata offrirà una guida pratica per il trapianto di cuore eterotopico murino e migliorerà l'utilità di questo modello murino per la ricerca di base.

Introduzione

L'istituzione di trapianti di cuore eterotopici di topo attraverso anastomosi end-to-end all'interno dell'addome nel 1973 è stata una pietra miliare nella ricerca sull'immunologia dei trapianti di base¹. Questo modello ha fornito uno strumento importante e valido per analizzare i meccanismi della lesione di reperfusione di ischemia², rigetto immunologico e tolleranza^3,4. Tuttavia, la natura complessa e dispendiosa in termini di tempo della chirurgia e il potenziale per le infezioni possono provocare gravi adeguarsi addominali perioperatorie e reazioni infiammatorie, con conseguente bassa efficienza per il modello di trapianto di cuore eterotopico.

La tecnica di trapianto di cuore eterotopico cervicale è stata descritta per la prima volta da Chen nel 1991⁵. In questo modello, la vena giugulare esterna del destinatario viene anastomosed all'arteria polmonare dell'innesto e l'arteria carotide viene anastomosed all'aorta ascendente. I principali vantaggi di questo metodo sono la comodità del monitoraggio e la riduzione dei traumi al destinatario. Nello stesso anno, Matsuura descrisse una tecnica migliorata, in cui la fine della vena giugulare esterna e dell'arteria carotide venivano eversate su un polsino in Teflon e fissate con una legatura di seta circonferenziana⁶. Alcuni ricercatori hanno anche fissato il bracciale all'arteria polmonare destra nel cuore del donatore prima di inserire il bracciale nella vena giugulare esterna del destinatario⁷. Finora, la tecnica del bracciale è stata ampiamente applicata in vari modelli di trapianto di piediloni vascolari, compresi quelli per il polmone⁸, fegato⁹e trapianto renale^10.

Ad oggi, ci sono diverse difficoltà associate alla tecnica del bracciale. Ad esempio, l'arteria carotide è difficile da evert sopra il bracciale a causa dell'elasticità aggiuntiva, con conseguente capovolgimento del tessuto all'indietro. Quindi, pratica aggiuntiva e un dilatatore microchirurgico può essere richiesto per completare questa fase. Inoltre, la preparazione del recipiente cervicale può richiedere fino a 25 minuti.

Per risolvere questi problemi, introduciamo la tecnica della camera d'aria, che si basa sulla tecnica del bracciale e include il fissaggio del polsino sulla vena giugulare esterna e sull'arteria carotide utilizzando una camera d'aria per aiutare con l'eversione della parete del vaso. Inoltre, con una formazione semplice, la preparazione del destinatario è ridotta a 15,5 minuti. Questa tecnica riduce la complessità dell'operazione e non richiede ulteriore pratica o l'uso di un dilatatore vascolare. Può essere applicato in tutte le ricerche immunitarie dei trapianti, in particolare per verificare la tolleranza immunitaria di terze parti durante la quale il ricevente riceve due allotrapianti cardiaci, uno all'interno dell'addome e l'altro nel collo¹¹. Raccomandiamo inoltre la cooperazione tra due chirurghi esperti per stabilire questo modello, con un chirurgo che prepara l'animale ricevente e l'altro che raccoglie e impianta il cuore del donatore. Tale collaborazione può ridurre il tempo di funzionamento a 25 minuti. Utilizzando questa procedura ottimizzata, abbiamo stabilito modelli di trapianto di cuore di topo singenico, allogenico^12,13,14^{,1515,16,17,18,19}e xenogenei modelli di trapianto di cuore di topo²⁰.

La logica per lo sviluppo della tecnica della camera d'aria era quella di ridurre i tempi di funzionamento per la creazione di un modello di trapianto di cuore di topo con un alto tasso di successo. L'ottimizzazione del modello di trapianto di cuore cervicale facilita l'acquisizione di alti tassi di successo in un breve periodo di tempo di chirurgia rispetto alla tradizionale tecnica di sutura e polsino²¹. Inoltre, il modello di cooperazione può ridurre ulteriormente il caldo tempo ischemico del cuore donatore rispetto agli interventi chirurgici eseguiti con un unico operatore.

Protocollo

Gli animali (BALB/c, C57BL/6, maschio, 8-12 settimane) sono ospitati in una struttura specifica priva di agenti patogeni presso il Xiamen University Laboratory Animal Center. Il C57BL/6 viene utilizzato come ricevente e il BALB/c viene utilizzato come donatore. Tutte le procedure sono eseguite secondo le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC).

NOTA: Per l'operazione sono necessari una serie di strumenti microchirurgici, tra cui micro forbice, micro pinze dritte, pinze micro curve e micro assi (Tabella e materiali, Figura 1B, C, D, E). È necessaria una coppia di morsetti bulldog monouso (Figura 1F). Due polsini per la vena giugulare esterna e l'arteria carotide vengono preparati tagliando i tubi di poliammide personalizzati con un bisturi n. 10 al microscopio. Il diametro della vena e del bracciale dell'arteria è rispettivamente di 0,9 mm e 0,55 mm. Inoltre, il diametro del tubo interno per il corrispondente bracciale venoso è di 0,6 mm, e questi della camera d'aria per il bracciale dell'arteria corrispondente è 0,28 mm (Figura 1G).

1. Preparazione del destinatario

1. Anestesizzare il mouse ricevente con pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Utilizzare clipper meccanici atraumatici per rimuovere i capelli nella regione cervicale laterale destra.
2. Utilizzare un applicatore sterile di punta di cotone per pulire l'area chirurgica con antisettico di iodio seguito da 70% di etanolo.
3. Posizionare il mouse nella posizione supina sulla piattaforma di funzionamento. Coprire il topo con una garza sterile.
4. Utilizzare una forbice oftalmica per fare un'incisione trasversale dalla linea mediana inferiore del collo all'articolazione della spalla-clavicola destra.
5. Isolare la vena giugulare esterna destra con micro pinze curve per esporre abbastanza lunghezza, tagliare i rami tramite elettrocoagulazione e ligare il vaso all'estremità distale utilizzando una sutura di seta 6-0.
6. Bloccare la vena giugulare esterna prossicante utilizzando un morsetto bulldog e poi transetto la vena prossimica alla legatura utilizzando una micro forbice.
7. Lavare il lume del vaso con 100 U/mL 0-4 gradi salina epararizzata per rimuovere qualsiasi sangue residuo.
8. Tirare la vena giugulare esterna attraverso il polsino della vena utilizzando micro pinze dritte; inserire la venosa camera d'aria nel lume come stent, e sempret la parete del vaso sopra il polsino con pinze micro dritto (Figura 2A).
9. Fissare l'endotelio del recipiente all'estremità prossimale del bracciale utilizzando un 8-0 circumferenziale sutura di seta (Figura 2B).
10. Utilizzare micro pinze dritte per ritirare la venosa camera d'aria dal recipiente venoso.
11. Eseguire una dissezione smussata con micro pinze curve per isolare l'arteria carotide destra adiacente al bordo interno dello sternocleidomastoide.
12. Bloccare l'arteria carotide destra prossicante utilizzando un morsetto bulldog, legiare la distally dell'arteria carotide utilizzando una sutura di seta 6-0 e utilizzare una micro forbice per transetto l'arteria carotide prosibilmente alla legatura.
13. Lavare l'arteria carotide con 100 U/mL 0-4 gradi salina eparinizzata per rimuovere qualsiasi sangue residuo.
14. Passare l'arteria carotide attraverso il bracciale dell'arteria e inserire la camera d'aria dell'arteria nel recipiente dell'arteria utilizzando micro pinze dritte (Figura 2C).
15. Evert il vaso sopra il bracciale utilizzando micro pinze dritte; fissare l'endotelio della nave eversi utilizzando un sutura di seta (Figura 2D).
16. Ritirare la camera d'aria dell'arteria dal vaso dell'arteria con micro pinze dritte.
    NOTA: conservare la ghiandola submandibolare del destinatario.

2. Preparazione del donatore

1. Anestesizzare il topo del donatore con pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Utilizzare tagliatori meccanici atraumatici per rimuovere i capelli nella regione addominale.
2. Posizionare il mouse nella posizione supina sulla piattaforma di funzionamento. Coprire il topo con una garza sterile.
3. Utilizzare un applicatore sterile di punta di cotone per pulire l'area chirurgica con antisettico di iodio seguito da 70% di etanolo.
4. Fare un'incisione mediana addominale con una forbice oftalmica ed esporre la cavità addominale.
5. Utilizzare micro pinze curve per esporre la vena cava inferiore, quindi iniettare per via endovenosa 200 -L di 100 U/mL 0-4 s'C eparinizzato salina per 20 g di peso corporeo attraverso la vena inferiore cava.
6. Eseguire la toracotomia con le forbici oftalmiche, tagliare le costole attraverso le incisioni della linea midaxillaria bilaterale, capovolgere la parete anteriore del torace verso l'esterno per esporre la cavità toracica.
7. Accisa il timo con micro pinze curve.
8. Esporre l'aorta, e poi perfondere 200 - LL di 100 U/mL 0-4 salinizzato all'arteria coronaria attraverso l'arco aortico.
   NOTA: Evitare di perfondere eventuali bolle di gas nel cuore del donatore.
9. Utilizzare una micro forbice per transect l'aorta ascendente all'inizio dell'arco aortico.
10. Transettale l'arteria polmonare all'inizio dei due rami principali con una micro forbice.
11. Ligate la vena cava superiore e inferiore vena cava proximally utilizzando una sutura di seta 6-0 e utilizzare un micro forbice per transetto vena distally alla legatura.
12. Ligate le vene polmonari insieme, circonferenzialmente, utilizzando una singola sutura di seta 6-0, e tagliare i rami di vena distay alla legatura utilizzando un micro forbice.
13. Rimuovere l'innesto cardiaco dai tessuti molli circostanti; conservarla in salina eparinizzata da 0 a 4 gradi centigradi.

3. Impianto cardiaco

1. Posizionare il cuore del donatore a testa in giù nella regione del collo destro del destinatario.
2. Inserire l'arteria polmonare del cuore del donatore in un anello di seta 6-0 con micro pinze dritte.
3. Avvolgere il lume del vaso intorno al bracciale venoso, quindi stringere i anelli di sutura di seta 6-0 intorno al bracciale per fasciare l'articolazione del vaso.
4. Eseguire l'anastomosis dell'aorta dell'innesto e del bracciale dell'arteria seguendo i passaggi descritti nel passaggio 3.2.
5. Rilasciare la vena giugulare bloccata seguita dall'arteria giugulare bloccata. Mantenere l'articolazione del vaso non contorta e assicurarsi che il flusso sanguigno sia libero.
   NOTA: Il ritmo del sinusto che ritorna a più di 200 volte entro 1 min è considerato normale.
6. Inumidire il cuore del donatore usando una salina calda (37 gradi centigradi) e controllare se l'innesto sta sanguinando. Impostare l'innesto cardiaco pulsante nello spazio sottocutaneo, quindi suturare l'incisione.

4. Cura postoperatoria e valutazione dell'innesto

1. Registrare il tempo al ritmo del seno normale e la conservazione del ritmo del seno normale per almeno 5 minuti dopo il rilascio del morsetto per monitorare la funzione di innesto post-operatorio.
2. Posizionare il destinatario da solo su una coperta calda fino a quando il destinatario si sveglia dall'anestesia. Somministrare l'analgesia buprenorfina, 0,05 mg/kg, s.c,, al termine dell'intervento e ogni 12 ore per 72 ore dopo l'intervento chirurgico.
3. Registrare giornalmente il peso e lo stato di recupero postoperatorio del destinatario. In caso di >15% perdita di peso rispetto a quella alla data dell'intervento chirurgico, paralisi emiplegica, o infezione, eutanasia il destinatario tramite inalazione isoflurane terminale²¹.
4. Monitorare la sopravvivenza dell'innesto dalla palpazione quotidiana. L'intervento è considerato di successo se l'allotrapianto murino sopravvive per >72 ore. Valutare la funzione di innesto, come precedentemente riportato²²: Scala 3 - vigorosamente pulsato e frequenza; Scala 2 - meno pulsato; Scala 1- fibrillazione e rifiuto imminente; o Scala - 0, perdita di battito cardiaco e rifiuto completo.

Risultati

Operazione chirurgica Tempo

Dopo l'allenamento, un chirurgo esperto può eseguire con successo l'operazione entro 35 minuti utilizzando la tecnica della camera d'aria, in cui sono necessari circa 15,5 minuti per la preparazione del destinatario, 10,9 minuti per la preparazione del donatore e 4,4 minuti sono necessari per le anastomosi cardiache del donatore. Il tempo di ischemia freddo e caldo (dalla preparazione del donatore all'impianto cardiaco) è ridotto a 15,3 minuti ris...

Discussione

I modelli di trapianto di cuore di topo sono strumenti importanti per la ricerca sull'immunologia dei trapianti, in quanto sono disponibili strumenti e materiali per valutare i meccanismi immunitari di questo modello e un gran numero di topi modificati nel gene. Tuttavia, le sfide tecniche microchirurgiche, come la sutura e l'eversione delle navi, ne hanno limitato l'uso diffuso. Nel presente studio, abbiamo studiato alcune sfide tecniche fondamentali del trapianto di cuore murino e abbiamo ottenuto buoni risultati. Un p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artery cuff	Self-made		Polyamide tube. diameter: 0.55 mm,length: 1.0 mm
Artery inner tube	Self-made		Polyamide tube. Diameter: 0.28mm
Micro curved forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA3050	1/8 arc, 0.3-mm tip without a hook
Micro needle holders	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA2050	0.2-mm tip
Micro scissors	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA1050	Straight, blade length: 10 mm
Micro straight forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA3060	0.15-mm tip without a hook
Scanlan Vascu-Statt Bulldog Clamps	Scanlan International Inc	1001-531	Clamping pressure 20–25 grams
Vein cuff	Self-made		Polyamide tube. diameter: 0.9 mm,length: 1.2 mm
Vein inner tube	Self-made		Polyamide tube. Diameter: 0.6 mm