Optimisation de la technique de manchette pour la transplantation cardiaque murine

Résumé

Nous introduisons une approche de tube interne à la technique de manchette pour la transplantation de coeur hétérotopique cervical de souris pour aider evert le vaisseau au-dessus de la manchette. Nous avons constaté que la coopération entre deux chirurgiens expérimentés raccourcit nettement le temps d’opération.

Résumé

La transplantation cardiaque de Murine a été exécutée pendant plus de 40 ans. Avec les progrès de la microchirurgie, certaines nouvelles techniques ont été utilisées pour améliorer l’efficacité chirurgicale. Dans notre laboratoire, nous avons optimisé la technique de manchette avec deux étapes importantes. Tout d’abord, nous avons utilisé la technique du tube interne pour insérer un tube intérieur temporaire dans la veine jugulaire externe et le vaisseau sanguin de l’artère carotide pour faciliter l’ensonation du vaisseau au-dessus du brassard. Deuxièmement, nous avons exécuté la transplantation cardiaque hétérotopique complète par la collaboration de deux chirurgiens expérimentés. Ces modifications ont effectivement réduit le temps d’exploitation à 25 minutes, avec un taux de réussite de 95%. Dans ce rapport, nous décrivons ces procédures en détail et fournissons une vidéo supplémentaire. Nous croyons que ce rapport sur la technique améliorée de manchette offrira des conseils pratiques pour la transplantation de coeur hétérotopique de murine et améliorera l’utilité de ce modèle de souris pour la recherche fondamentale.

Introduction

L’établissement de la transplantation cardiaque hétérotopique de souris par anastomose de bout en bout dans l’abdomen en 1973 a été une étape importante dans la recherche fondamentale d’immunologie de greffe¹. Ce modèle a fourni un outil important et valide pour analyser les mécanismes de la blessure de reperfusion d’ischémie², rejet immunologique, et tolérance^3,4. Cependant, la nature complexe et longue de la chirurgie ainsi que le potentiel d’infections peuvent entraîner des adhérences abdominales périopératoires graves et des réactions inflammatoires, résultant en une faible efficacité pour le modèle de transplantation cardiaque hétérotopique.

La technique de transplantation cardiaque hétérotopique cervicale a été décrite pour la première fois par Chen en 1991⁵. Dans ce modèle, la veine jugulaire externe du destinataire est anestomosed à l’artère pulmonaire de la greffe et l’artère carotide est anestomosed à l’aorte ascendante. Les principaux avantages de cette méthode sont la commodité de la surveillance et la réduction des traumatismes pour le destinataire. Dans la même année, Matsuura décrit une technique améliorée, dans laquelle la fin de la veine jugulaire externe et l’artère carotide ont été jamaissées sur un brassard de téflon et fixé avec une ligature de soie circonférentielle⁶. Certains chercheurs ont également fixé le brassard à l’artère pulmonaire droite dans le cœur du donneur avant d’insérer le brassard dans la veine jugulaire externe du receveur⁷. Jusqu’à présent, la technique de manchette a été largement appliquée dans divers modèles vasculaires de greffe de pédicle, y compris ceux pour le poumon⁸, foie⁹, et la transplantation rénale^10.

À ce jour, il y a plusieurs difficultés associées à la technique de manchette. Par exemple, l’artère carotide est difficile à evert sur le brassard en raison de l’élasticité supplémentaire, ce qui entraîne le tissu se retourner vers l’arrière. Par conséquent, une pratique supplémentaire et un dilatateur microchirurgical peuvent être nécessaires pour compléter cette étape. En outre, la préparation du col de l’utérus peut prendre jusqu’à 25 minutes.

Pour résoudre ces problèmes, nous introduisons la technique du tube intérieur, qui est basée sur la technique de manchette et comprend la fixation de la manchette sur la veine jugulaire externe et l’artère carotide à l’aide d’un tube intérieur pour aider à la eversion de la paroi du navire. En outre, avec une formation simple, la préparation des bénéficiaires est réduite à 15,5 minutes. Cette technique réduit la complexité de l’opération et ne nécessite pas de pratique supplémentaire ou l’utilisation d’un dilatateur vasculaire. Il peut être appliqué dans toutes les recherches immunitaires de transplantation, en particulier pour vérifier la tolérance immunitaire de tiers au cours de laquelle le receveur reçoit deux allogreffes cardiaques, l’un dans l’abdomen et l’autre dans le cou¹¹. Nous recommandons également la coopération entre deux chirurgiens qualifiés pour établir ce modèle, avec un chirurgien préparant l’animal receveur et l’autre récoltant et implantant le coeur de donneur. Une telle collaboration peut réduire le temps d’opération à 25 minutes. En utilisant cette procédure optimisée, nous avons établi syngeneic, allogénique^{12,13,14,15,16,17,18,19}, et xénogénéique modèles de transplantation cardiaque de souris²⁰.

La raison d’être du développement de la technique du tube intérieur était de réduire le temps d’opération pour l’établissement d’un modèle de transplantation cardiaque de souris avec un taux de réussite élevé. L’optimisation du modèle de transplantation cardiaque cervicale facilite l’acquisition de taux de réussite élevés dans une courte période de temps de chirurgie par rapport à la technique traditionnelle de suture et de manchette²¹. En outre, le modèle de coopération peut réduire davantage le temps ischémique chaud du cœur du donneur par rapport aux chirurgies effectuées avec un seul opérateur.

Protocole

Les animaux (BALB/c, C57BL/6, mâle, 8-12 semaines) sont logés dans une installation spécifique sans pathogènes au Laboratoire animal de l’Université de Xiamen. C57BL/6 est utilisé comme receveur et BALB/c est utilisé comme donneur. Toutes les procédures sont effectuées conformément aux lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC).

REMARQUE : Un ensemble d’instruments microchirurgicaux, y compris un micro ciseaux, des micro forceps droits, des forceps micro incurvés et des supports de micro aiguille, sont nécessaires pour l’opération (Table et Matériaux, Figure 1B, C, D, E). Une paire de pinces à bouledogue à usage unique (Figure 1F) est nécessaire. Deux poignets pour la veine jugulaire externe et l’artère carotide sont préparés en coupant les tubes de polyamide personnalisés avec un scalpel no 10 sous un microscope. Le diamètre de la veine et du brassard d’artère est de 0,9 mm et 0,55 mm, respectivement. En outre, le diamètre du tube intérieur pour le brassard veineux correspondant est de 0,6 mm, et ceux-ci du tube intérieur pour le brassard d’artère correspondant est de 0,28 mm (figure 1G).

1. Préparation des bénéficiaires

1. Anesthésiez la souris destinataire avec du pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Utilisez des tondeuses mécaniques atraumatiques pour enlever les cheveux à la région cervicale latérale droite.
2. Utilisez un applicateur de pointe de coton stérile pour essuyer la zone chirurgicale avec l’antiseptique d’iode suivi de 70% d’éthanol.
3. Placez la souris en position supination sur la plate-forme d’opération. Couvrir la souris de gaze stérile.
4. Utilisez un ciseaux ophtalmique pour faire une incision transversale de la ligne médiane inférieure d’un tiers du cou à l’articulation droite épaule-clavicule.
5. Isoler la veine jugulaire externe droite avec des forceps micro incurvés pour exposer suffisamment de longueur, couper les branches par électrocoagulation, et lier le navire à l’extrémité distale à l’aide d’une suture de soie 6-0.
6. Pincez la veine jugulaire externe à l’aide d’une pince de bouledogue, puis transectez la veine proximalement à la ligature à l’aide d’un micro ciseaux.
7. Laver le lumen du navire avec 100 U/mL 0-4 °C héparinisé saline pour enlever tout sang résiduel.
8. Tirez la veine jugulaire externe à travers le brassard veineux à l’aide de micro forceps droits; insérer le tube intérieur de la veine dans le lumen comme stent, et evert le mur du navire sur le brassard avec des forceps micro droites (Figure 2A).
9. Fixer l’endothélium du navire everted à l’extrémité proximale de la manchette à l’aide d’un 8-0 circonférentiel suture en soie (figure 2B).
10. Utilisez des micro forceps droites pour retirer le tube intérieur de la veine du vaisseau veineux.
11. Effectuer une dissection émoussée avec des forceps micro incurvés pour isoler l’artère carotide droite adjacente au bord intérieur du sternocleidomastoid.
12. Pincez l’artère carotide droite à l’aide d’une pince de bouledogue, liverge l’artère carotide distally à l’aide d’une suture de soie 6-0, et utilisez un micro ciseaux pour transect l’artère carotide proximally à la ligature.
13. Laver l’artère carotide avec 100 U/mL 0-4 °C héparinisé saline pour enlever tout sang résiduel.
14. Passer l’artère carotide par le brassard de l’artère et insérer le tube interne de l’artère dans le vaisseau de l’artère à l’aide de micro forceps droits (Figure 2C).
15. Evert le navire sur le brassard à l’aide de micro forceps droites; fixer l’endothélium du navire everted à l’aide d’un 8-0 circonférentiel suture en soie (Figure 2D).
16. Retirez le tube interne de l’artère du vaisseau de l’artère avec des forceps micro droites.
    REMARQUE : Préserver la glande submandibulaire du receveur.

2. Préparation des donneurs

1. Anesthésiez la souris donneuse au pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Utilisez des tondeuses mécaniques atraumatiques pour enlever les cheveux à la région abdominale.
2. Placez la souris en position supination sur la plate-forme d’opération. Couvrir la souris de gaze stérile.
3. Utilisez un applicateur de pointe de coton stérile pour essuyer la zone chirurgicale avec l’antiseptique d’iode suivi de 70% d’éthanol.
4. Faire une incision abdominale de ligne médiane avec un ciseaux ophtalmique et exposer la cavité abdominale.
5. Utilisez des forceps micro incurvés pour exposer la vena cava inférieure, puis injectez par voie intraveineuse 200 μL de 100 U/mL 0-4 °C héparinisé saline par 20 g de poids corporel par le vena cava inférieur.
6. Effectuer la thoracotomie avec des ciseaux ophtalmiques, couper les côtes par les incisions bilatérales de ligne midaxillaire, retourner la paroi thoracique antérieure vers l’extérieur pour exposer la cavité thoracique.
7. Exciser le thymus avec des forceps micro incurvés.
8. Exposer l’aorte, puis perfuse 200 μL de 100 U/mL 0-4 °C héparinisé saline à l’artère coronaire par l’arc aortique.
   REMARQUE : Évitez de perfuser des bulles de gaz dans le cœur du donneur.
9. Utilisez un micro ciseau pour transecter l’aorte ascendante au début de l’arc aortique.
10. Transect l’artère pulmonaire au début des deux branches principales avec un micro ciseaux.
11. Lier la vena cava supérieure et la vena cava inférieure à l’aide d’une suture de soie 6-0 et utiliser un micro ciseaux pour transect veiner distally à la ligature.
12. Lier les veines pulmonaires ensemble, circonférentiellement, en utilisant une seule suture de soie 6-0, et couper les branches veineuses distally à la ligature à l’aide d’un micro ciseaux.
13. Retirer la greffe cardiaque des tissus mous environnants; le conserver en 0-4 °C héparinisé saline.

3. Implantation cardiaque

1. Placez le cœur du donneur à l’envers dans la région du cou droit du receveur.
2. Entrez l’artère pulmonaire du cœur du donneur à une boucle de soie 6-0 avec des forceps micro droites.
3. Enroulez le lumen du navire autour du brassard veineux, puis serrez les boucles de suture de soie 6-0 autour du brassard pour bander le joint du navire.
4. Effectuer l’anastomose de l’aorte de la greffe et de la manchette de l’artère en suivant les étapes décrites à l’étape 3.2.
5. Relâchez la veine jugulaire serrée suivie de l’artère jugulaire serrée. Gardez l’articulation du vaisseau non coulé et assurez-vous que le flux sanguin est dégagé.
   REMARQUE : Le rythme des sinus qui revient à plus de 200 fois en 1 min est considéré comme normal.
6. Humidifiez le cœur du donneur à l’aide d’une solution saline chaude (37 °C) et inspectez si la greffe saigne. Placez la greffe cardiaque pulsante dans l’espace sous-cutane, puis suturez l’incision.

4. Évaluation des soins postopératoires et de la greffe

1. Enregistrez le temps au rythme normal des sinus et la préservation du rythme normal des sinus pendant au moins 5 minutes après la libération de la pince pour surveiller la fonction de greffe postopératoire.
2. Placez le destinataire seul sur une couverture chaude jusqu’à ce que le receveur se réveille de l’anesthésie. Administrer l’analgésie de buprénorphine, 0,05 mg/kg, s.c, à la fin de la chirurgie et toutes les 12 heures pendant 72 heures après la chirurgie.
3. Enregistrez quotidiennement le poids et l’état de récupération postopératoire du receveur. En cas de perte de poids >15% par rapport à celle de la date de la chirurgie, paralysie hémiplégique, ou infection, euthanasier le destinataire par inhalation isoflurane terminale²¹.
4. Surveiller la survie de greffe par palpation quotidienne. La chirurgie est considérée comme un succès si l’allogreffe murine survit pendant >72 heures. Grader la fonction de greffe, comme précédemment rapporté²²: Échelle 3 - pulsation vigoureuse et fréquence ; Échelle 2 - moins de pulsation; Échelle 1- fibrillation et rejet imminent; ou Échelle - 0, perte de rythme cardiaque et rejet complet.

Résultats

Temps d’opération chirurgicale

Après la formation, un chirurgien qualifié peut effectuer avec succès l’opération dans les 35 minutes en utilisant la technique du tube interne, dans le cadre de laquelle environ 15,5 minutes sont nécessaires pour la préparation du receveur, 10,9 minutes sont nécessaires pour la préparation du donneur, et 4,4 minutes sont nécessaires pour les anastomoses cardiaques du donneur. Le temps d’ischémie froid et chaud (de la préparatio...

Discussion

Les modèles de transplantation cardiaque de souris sont des outils importants pour la recherche en immunologie des greffes, car des outils et des matériaux pour évaluer les mécanismes immunitaires de ce modèle et un grand nombre de souris modifiées par les gènes sont disponibles. Cependant, les défis techniques microchirurgicaux, tels que la suture et l’eversion des navires, ont limité son utilisation généralisée. Dans la présente étude, nous avons étudié certains défis techniques fondamentaux de la tr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artery cuff	Self-made		Polyamide tube. diameter: 0.55 mm,length: 1.0 mm
Artery inner tube	Self-made		Polyamide tube. Diameter: 0.28mm
Micro curved forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA3050	1/8 arc, 0.3-mm tip without a hook
Micro needle holders	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA2050	0.2-mm tip
Micro scissors	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA1050	Straight, blade length: 10 mm
Micro straight forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA3060	0.15-mm tip without a hook
Scanlan Vascu-Statt Bulldog Clamps	Scanlan International Inc	1001-531	Clamping pressure 20–25 grams
Vein cuff	Self-made		Polyamide tube. diameter: 0.9 mm,length: 1.2 mm
Vein inner tube	Self-made		Polyamide tube. Diameter: 0.6 mm