Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, kitle spektrometresi bazlı proteomik enfeksiyon sırasında konak ve patojen arasındaki etkileşimin profilini çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, tek bir deneyde hem konakçının (örneğin, makrofajlar) hem de patojenin (örneğin Cryptococcus neoformans)protein bolluğundaki değişiklikleri ölçmek için etiketsiz niceleme kullanır.

Özet

Kütle spektrometresinin (MS) teknolojik başarıları, bir organizmanın küresel proteomunu değişen koşullar altında analiz etmek için keşfedilmemiş birçok yol açar. Mikrobiyal patojenlerin istenen konak ile etkileşimlerine uygulanan bu güçlü strateji, her iki bakış açısını da enfeksiyona karşı kapsamlı bir şekilde karakterize eder. Burada, iş akışı, ölümsüzleştirilmiş makrofaj hücrelerinin varlığında ölümcül hastalık kriptokokokozun etken maddesi olan mantar öğretim üyesi hücre içi patojen Cryptococcus neoformans'ın enfektomunun etiketsiz nicelemesini (LFQ) açıklar. Protokol, tek bir deneyde hem patojen hem de memeli hücreleri için uygun protein hazırlama tekniklerini detaylandırıyor ve bu da sıvı kromatografisi (LC)-MS/MS analizi için uygun peptit gönderimi ile sonuç veriyor. LFQ'nun yüksek verimli jenerik doğası, çok çeşitli protein tanımlama ve nicelemenin yanı sıra herhangi bir konak-patojen enfeksiyon ayarına aktarılabilmesini sağlar ve aşırı hassasiyeti korur. Yöntem, enfeksiyon taklit eden koşullarda bir patojenin kapsamlı, tarafsız protein bolluk profillerini kataloglamak için optimize edilmiştir. Özellikle, burada gösterilen yöntem, virülans için gerekli protein üretimi gibi C. neoformans patogenez hakkında temel bilgiler sağlar ve mikrobiyal istilaya yanıt veren kritik konak proteinleri tanımlar.

Giriş

İnvaziv mantar enfeksiyonlarının prevalansı büyük ölçüde artmaktadır ve en sık immün yetmezlik yatkınlığı olan bireylerde bildirilen kabul edilemez yüksek ölüm oranları ile ilişkilidir1. Cryptococcus neoformans, konak makrofaj hücrelerinde hücre içi sağkalım yapabilen ünlü bir fırsatçı mantar patojenidir. Yetersiz antifungal müdahale, kriptokoksal menenjit ve meningoensefalit2,3mantar yayılması ve hayatı tehdit eden belirtilerle sonuçlanır. İmmün sistemi baskılanmış statüdeki küresel artış, C. neoformanlar da dahil olmak üzere birçok mantar türünün4,5,6'yadoğru giderek daha fazla direnç geliştirdiği antifungal ajanların kullanımında paralel bir artış talep etti. Bu nedenle, konak savunma yanıtı ve mikrobiyal patogenez ile ilgili hayati biyolojik soruları yanıtlamak için sağlam ve verimli teknolojilerin uygulanması zorunludur.

Güçlü hesaplamalı ve biyoinformatik boru hatlarının üretimi de dahil olmak üzere kütle spektrometresinde (MS) teknolojik ilerlemenin yeni çağı, konak-patojen araştırmalarının büyük ölçekli analizi için bütünleştirici bir vizyon için temel sağlar7,8. Konvansiyonel patogenez odaklı proteomik analiz, protein korelasyon profilleme, proteomik ile birlikte benzeşim kromatografisi ve interactomik9gibi kapsamlı metodolojiler de dahil olmak üzere, enfeksiyonun ana bilgisayar veya patojen perspektifinden görünümünü yaygın olarak profiller. Konak bir sistemde tehlikeli patojenlerin virülansına yönelik araştırmalar çok büyük klinik öneme sahiptir; ancak, tek bir deneyde çift perspektif analizinin uygulanması daha önce ulaşılamaz olarak kabul edildi. Örneğin, patojenin enfeksiyona bakış açısı genellikle çok bol konak proteinleri tarafından boğulmuştur ve bu da düşük bol mantar proteinlerinin tespiti için daha az hassasiyetle sonuçlanır7. Ayrıca, yüksek örnek karmaşıklığı birçok hedefi tek bir deneysel sistemde araştırmaya davet eder ve belirli bir patojen proteini için etki mekanizmalarını aydınlatmaya zor olduğunu kanıtlamaktadır.

Aşağıdan yukarıya proteomik, peptitlerin diziye özgü enzmatik sindirim ve ardından MS10 , 11ile sıvı kromatografi ayırma, tanımlama ve niceleme ile üretildiği yönetilebilir numune hazırlamayı sağlayan popüler bir MS tekniğidir. Burada, enfeksiyon bazlı bir proteom veya 'infectome'nin tarafsız bir kapsamını elde etmeyi amaçlayan veriye bağımlı bir satın alma stratejisini gösteren bir yöntem sunuyoruz. Özellikle, etiketsiz niceleme (LFQ), birden fazla proteomdaki protein seviyesi değişikliklerinin sağlam ve doğru tanımlanması için kimyasal veya metabolik etiketlere bağımlılığı azaltır, numune işleme ve işlemeadımlarını azaltır 12,13. Bu evrensel uygulama, beklenen herhangi bir protein üretiminden bağımsız bir hücre içinde belirli bir anda üretilen proteinleri sorgular; bu nedenle, enfeksiyon için kritik olan yeni içgörüler keşfedilebilir.

Burada açıklanan iş akışı, konak bağışıklık hücreleri ile enfeksiyon taklit etme koşulları sırasında C. neoformanların protein seviyesi değişikliklerini araştırmak için optimize edilmiştir (Şekil 1). Hücre tiplerinin izolasyonu ve ayrılmasına güvenmek yerine, bu yaklaşım konak ve patojen proteomlarını birlikte çıkarır ve türe özgü protein üretimini ayırt etmek için organizmaya özgü iki veritabanı kullanarak biyoinformatik ayırmayı kullanır. Bu yöntem, izotop bazlı etiketleme çalışmalarında veya fraksiyonasyonda gerekli olan ekstra maliyetli hazırlık adımları olmadan sınırsız sayıda numunenin işlenmesi için avantajlar sunar. Ayrıca, bu iş akışı, konak bağışıklık hücrelerini hedefleyebilen ve enfekte edebilen çok çeşitli mantar ve bakteriyel patojenlere aktarılabilen optimize edilmiş protein ekstraksiyon protokollerini desteklemektedir. Genel olarak, bu protokol, yüksek çözünürlüklü MS için tarafsız bir protein ekstraksiyonu ve numune işlemeyi tamamlama adımlarını ve ardından, konak savunma yanıtının kapsamlı profillemesiyle birlikte enfeksiyon için önemli mantar proteinleri hakkında zengin bir bilgi sağlayabilen veri ve istatistiksel analizi özetlemektedir.

Protokol

Guelph Üniversitesi Hayvan Kullanım Protokolü 4193 tarafından onaylanan aşağıdaki protokol için BALB/c farelerinden türetilen ölümsüzleştirilmiş bir makrofaj hattı kullanılmıştır. Özellikle, diğer fare suşları veya diğer ölümsüzleştirilmiş hücre kaynakları, ayrıntılı parametreleri optimize etmek için yeterli test ile özetlenen protokole uygulanabilir. Aşağıdaki protokol, donmuş bir makrofaj hücresi şişesiyle başlayan adımlarda gezinecektir. Hücreler% 10 FBS (fetal sığır serumu), % 1 L-glutamin ve% 5 Pen / Strep (Penisilin-Streptomisin) karışımında DMEM 'e (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı) ve% 20 DMSO'da (dimetil sülfit) depolanır.

1. C. neoformanların kült örültme

  1. Gliserol stoğu kullanarak, tek kolonileri izole etmek için Maya özü pepton dekstroz (YPD) agar plakası üzerine seri wildtype C. neoformans suşu (H99).
  2. Statik bir inkübatörde 37 °C'de 16 saat boyunca gece boyunca kuluçkaya yatırın.
  3. Gevşek bir şekilde kaplanmış 10 mL test tüpünde 5 mL YPD suyunda tek bir wildtype C. neoformans suşu ve kültürü kolonisi seçin. Dört katına çıkar.
  4. 200 rpm'de sallanan bir inkübatörde 37 °C'de 16 saat boyunca bir gecede kuluçkaya yatırın.
  5. Ertesi gün alt kültür her bir gecelik kültür 1:100 seyreltme içine 3 mL YPD et suyu.
  6. Orta kütük fazını belirlemek için mantar kültürünün optik yoğunluk (OD600nm)değerlerini ölçün. Spektrofotometreye bağlı olarak, C. neoformans wildtype suşu, 1.0 ila 1.5 arasında değişen genel OD600nm değerleri ile YPD'de 6 ila 8 h inkübasyonu takiben genellikle orta kütük aşamasına ulaşır.
  7. Hücreler orta kütük fazına ulaştığında, temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 10 μL'lik bir mantar hücresi süspansiyonu alın ve steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1:100 seyreltin. Hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın.

2. Makrofaj hücrelerinin kültülesi

NOT: Hücre kültürü çalışmalarından önce çalışma ortamının sterilize olduğundan emin olun.

  1. Hücre kültürü ortamının hazırlanması
    1. Antibiyotik takviyeli ortam: DMEM'e (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı) %10 FBS (fetal sığır serumu), %1 L-glutamin ve %5 Pen/Strep (Penisilin-Streptomisin) karışımı ekleyin. Orta filtreyi 0,2 μm komple filtre sistemi üzerinden filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
    2. Antibiyotik içermeyen ortam: Aynı protokolü izleyin, ancak Pen/Strep karışımını atlayın.
  2. Makrofaj hücrelerinin tohumlama
    NOT: Antibiyotik takviyeli ortam (2.1.1.) hücre kültürü çalışmalarından önce 37°C'ye ısıtılmalıdır.
    1. Makrofaj hücrelerinin şişelerini 37 °C boncuk banyosunda hızlı bir şekilde çözün.
    2. Hücreleri 1 mL antibiyotik takviyeli ortamda yeniden yağlayarak donma çözeltisi hücrelerini yıkayın.
      NOT: Sert pipetleme nedeniyle hücrelerin sızmamasını sağlamak için ekstra önlem gereklidir.
    3. Yeniden biriktirilen hücreleri steril 15 mL tüpe aktarın.
    4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleme ile pelet hücreleri.
    5. Serolojik pipet veya vakum aspiratörü ile süpernatant dikkatlice çıkarın.
    6. Peleti 10 mL antibiyotik takviyeli ortamda hafifçe yeniden sunun.
    7. Yavaşça pipet, hücreleri 60 x 15 mm hücre kültürüyle işlenmiş bir yemeğe yeniden biriktirdi.
    8. Bir gecede %5 CO2 ile 37 °C'de kuluçka kabı.
  3. Makrofaj hücrelerinin ilk geçişi
    NOT: Dondurulmuş hücre stokları genellikle şişe başına 5 ila 10 milyon hücre içerir (yaklaşık 1 mL). Sonraki gün, tohumlama protokolünden kurtulan makrofaj hücreleri hücre kültürü çanağının dibine yapışacak ve geçmeye hazır olacaktır.
    1. Hücre kültürü çalışmalarından önce sıcak antibiyotik takviyeli orta (adım 2.1.1) ila 37 °C. Hücre kültürü çalışmalarından önce çalışma ortamının sterilize olduğundan emin olun. Hücrelerin yapışmasını ve sağlıklı olmasını sağlamak için hücreleri hafif bir mikroskop kullanarak görselleştirin.
    2. Hücre kültürü ortamını serolojik pipet veya vakum aspiratörü ile tabaktan çıkarın.
    3. 60 x 15 mm'lik çanağa 5-7 mL steril oda sıcaklığında PBS (fosfat tamponlu salin) ekleyin.
    4. Yapışan hücreleri yıkamak için kabı hafifçe eğin.
    5. Serolojik pipet veya vakum aspiratörü kullanarak PBS'yi çıkarın.
    6. Hücrelere 1 mL soğuk PBS (4 °C'de saklanır) ekleyin, PBS'yi tüm hücrelere dağıtmak için kabı eğin ve oda sıcaklığında 1 dakika oturmaya izin verin.
    7. Çanağa hafifçe dokunarak, soğuk PBS'yi hücrelere borulayarak veya bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri serbest bırakın.
    8. Yemeğe 9 mL antibiyotik takviyeli ortam ekleyin.
    9. Yeni bir 60 x 15 mm'lik tabakta, orijinal yemekten 9 mL taze antibiyotik takviyeli orta ve 1 mL resüspended hücre ekleyin.
    10. İstenen geçiş plakalarının sayısı doldurulduktan sonra, orijinal tabaktan yeniden doldurulmuş hücreler atılabilir.
    11. Yeni yemeği yukarıda belirtilen ayarlarda kuluçkaya yatırın (adım 2.2.8).
    12. Hücreler % 70-80 izdihama ulaştığında (kullanılan hücre hattına ve ortama bağlı olarak yaklaşık 2 günde bir) sonraki geçişi gerçekleştirin.
      NOT: Makrofaj hücreleri enfeksiyon deneylerinden önce en az beş kez geçilmelidir. Hücre hattına bağlı olarak enfeksiyon deneyleri 25 ila 30 pasajla yapılmalıdır. 25 ila 30 pasajdan sonra, hücreler dondurulmalı veya atılmalıdır. Bölüm 2.4 veya 2.5 deneysel planlara göre seçilebilir. Bölüm 2.4 aşağıdaki bölümler için kullanılacaktır.
  4. Enfeksiyondan önce makrofaj hücrelerinin tohumlama
    1. Geçiş protokolü adımları 2.3.1 ile 2.3.7 arasında gerçekleştirin.
    2. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre yoğunluğunu (hücreler/mL) belirleyin.
    3. 0,3 x 106 makrofaj hücrelerini 6 kuyulu hücre kültür plakasının tek bir kuyusuna aktarın.
    4. Antibiyotik takviyeli ortam kullanarak toplam kuyu hacmini 1 mL'ye ayarlayın (adım 2.1.1).
    5. 8 kuyu doldurulana kadar (iki ayrı plakaya doldurulmuş 4 kuyu) 2.4.3 ve 2.4.4 adımlarını tekrarlayın.
    6. İsteğe bağlı olarak, kuluçka sırasında nem seviyelerini korumak için kalan iki kuyuyu 1 mL oda sıcaklığı pbs ile doldurun.
    7. Enfeksiyondan önce 2 d için 2.2.8 adımında belirtilen kuluçka koşullarında hücrelerin büyümesine izin verin.
  5. Enfeksiyon gününde makrofaj hücrelerinin tohumlama
    1. Geçiş protokolü adımları 2.3.1 ile 2.3.7 arasında gerçekleştirin.
    2. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre yoğunluğunu (hücreler/mL) belirleyin.
    3. Tohum 1.2 x 106 makrofaj hücresi, 6 kuyulu bir hücre kültür plakasının tek bir kuyusuna.
    4. Antibiyotik takviyeli ortam (2.1.1) kullanarak toplam kuyu hacmini 1 mL'ye ayarlayın.
    5. 8 kuyu doldurulana kadar 2.4.3 ve 2.4.4'i tekrarlayın (iki ayrı plakaya doldurulmuş 4 kuyu).
    6. İsteğe bağlı olarak, kuluçka sırasında nem seviyelerini korumak için kalan iki kuyuyu 1 mL oda sıcaklığı pbs ile doldurun.
    7. Hücrelerin kuyulara yapışmasını sağlamak için 3 saat boyunca 2.2.8 adımda belirtilen koşullar altında hücreleri kuluçkaya yatırın.

3. Makrofaj hücrelerinin C. neoformans ile enfeksiyonu

NOT: %70-80 izdihama ulaştıktan sonra kuyu başına yaklaşık 1,2 x10 6 makrofaj hücresi olacaktır. 100:1 enfeksiyon (MOI) istenen çokluğu elde etmek için, her reaksiyon için 1.2 x10 8 mantar hücresi gereklidir. Kültürler biyolojik dörtgen olarak buna göre ayarlanmalıdır.

YASAL UYARI: 100:1 moi araştırma grubumuzda arzu edilen sonuçlar elde etti ve okuyuculara bir öneri olarak tasarlanmıştır. Daha bulaşıcı C. neoformans suşları veya daha az dirençli makrofaj hücre hatları için daha düşük bir MOI gerekebilir. Enfeksiyonun doğrulanması (bölüm 3.5), belirli C. neoformanlar için ideal MOI'yi belirlemek için kullanılabilir - makrofaj kombinasyonları.

  1. Mantar hücrelerinin hazırlanması
    1. C. neoformanların orta günlük aşamasına büyümesi için 1.
    2. Hücreleri 10 dakika boyunca 1.500 x g'da toplayın ve santrifüjleyin, peleti steril oda sıcaklığında PBS ile hafifçe yıkayın ve toplam üç yıkama için tekrarlayın.
    3. 1.2 x 108 hücre/mL konsantrasyon elde etmek için antibiyotiksiz hücre kültürü ortamında (adım 2.1.2) hücreleri yeniden biriktirin.
  2. Makrofaj hücrelerinin hazırlanması
    1. Hücrelerin% 70-80 birleşmeye ulaştığından emin olmak için her bir kuyuyu 6 kuyu plakasında görselleştirin. Alternatif olarak, hücreler kuyu başına yaklaşık 1,2 x 106 makrofaj hücresi elde etmek için ölçülebilir.
    2. 2.3.1 ile 2.3.4 arasında olan adımları izleyin.
  3. C. neoformans ve makrofaj hücrelerinin ortak kültürü
    1. Bölüm 3.2'de hazırlanan makrofaj hücrelerini içeren 4 kuyuya resüspended C. neoformans hücrelerinin 1 mL'lik kısmını (adım 3.1.3) ekleyin.
      NOT: Deneye başlamadan önce gerekli plaka sayısının hesaplanmaları gerekecektir. Boş kuyulara 1 mL antibiyotiksiz ortam (adım 2.1.2) ekleyin.
    2. Hücrelerin listelenen koşullar altında (adım 2.2.8) 3 saat boyunca kuluçkaya yatmasına izin verin.
    3. Hücre kültürü ortamını serolojik pipet veya vakum aspiratörü ile plakadan çıkarın.
    4. Yavaşça 1 mL steril oda sıcaklığında PBS ekleyin.
    5. Bağlı olmayan veya fagositoz dışı C. neoformans hücrelerini yıkamak için plakayı hafifçe eğin.
    6. Serolojik pipet veya vakum aspiratör kullanarak PBS'yi çıkarın, toplam üç yıkama için tekrarlayın. 3.3.4 ile 3.3.5'i iki kez daha tekrarlayın.
  4. Bulaşmamış makrofajlar
    1. Aynı şekilde, sadece makrofaj örnekleri olarak hizmet etmek için 6 kuyu plakasının 4 kuyusunu kullanın. Bu kuyulara 1 mL antibiyotiksiz ortam (adım 2.1.2) ekleyin.
    2. 3.3.2 ile 3.3.6 arasında olan adımları yineleyin.
  5. Enfeksiyonun doğrulanması
    NOT: Sitotoksiklik testi kullanılarak enfeksiyon yeterliliği ölçülebilir. Aşağıdaki protokol, LDH (laktat dehidrogenaz) salınımını ölçmek için bir sitotoksisite ürününün uygulanmasını vurgulayacaktır. Diğer sitotoksiklik ürünleri de kullanılabilir.
    1. Makrofaj hücrelerinin C. neoformans enfeksiyonunun hazırlanması
      1. 1, 2 ve 3'ü (3,5'e kadar) yineler. LDH tahlili, tercih edilirse üç taraflı olarak yapılabilir.
      2. 3.3.6 adımını takiben, 6 kuyu plakasındaki her kuyuya 1 mL antibiyotiksiz ortam (2.1.2) ekleyin.
      3. 3 kuyu artı 3n kuyu doldurulana kadar 2.4.3 ve 2.4.4 adımlarını tekrarlayın (burada n ölçülen zaman puanı sayısıdır).
      4. 2.2.8. adımda listelenen koşullar altında hücreleri kuluçkaya yatır.
      5. Seçilen zaman noktalarında (örneğin, 1, 3, 6, 12 ve 24 saat) üreticinin talimatlarına göre LDH sürümünün ölçümü için süpernatant toplayın
      6. Aynı zamanda, enfekte olmayan makrofaj hücreleri maksimum sitotoksiklik için belirlenen değere göre lysed edilecektir.
      7. Sitotoksisiteyi aşağıdaki gibi hesaplayın:
        figure-protocol-11290

4. Örnek toplama

  1. Ortak kültür ve bozulmamış makrofaj toplama
    1. Hücrelere 1 mL soğuk PBS ekleyin (3.3.6 ve 3.4.2'den itibaren) ve oda sıcaklığında 1 dakika oturmaya izin verin.
    2. Plakaya hafifçe dokunarak veya hücrelere karşı soğuk PBS'yi hafifçe pipetleyarak hücreleri plakadan serbest bırakın.
      NOT: Hücrelerin lizizine neden olabileceği için hücre kazıyıcıdan kaçınılmalıdır.
    3. Pipet hücreleri 15 mL'lik bir tüpe yeniden biriktirdi.
    4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj hücreleri santrifüj ve süpernatantı çıkarın.
    5. Proses hücreleri (adım 5'te ayrıntılı olarak belirtildiği gibi) hemen veya sıvı nitrojende dondurulmuş ve daha sonra işlenmek üzere -80 °C'de saklanır.

5. Hücresel proteom

NOT: Analiz edilen hücre tipi için yeterli liziz optimize edilmelidir (yani, döngülerin ve genliklerin miktarı hücre pelet boyutuna ve prob sonicator modelinin güç yüzdesi bağlıdır).

  1. Enfekte makrofaj hücresi lizisi
    1. Taze çözünmüş proteaz inhibitörü kokteyl tabletten oluşan 100 mM Tris-HCl'nin (pH 8.5) 300 μL'sinde peletlenmiş hücreleri (adım 4.1.5) yeniden biriktirin.
      NOT: Deneye başlamadan önce 10 mL buz soğuğu 100 mM Tris-HCl'ye (pH 8.5) bir proteaz inhibitörü kokteyl tableti eklenir.
    2. Sonda, hücreleri yoklamak için 30 s açık ve 30 s kapalı 15 döngü boyunca bir buz banyosundaki hücreleri sonale eder.
    3. Santrifüj hücreleri 400 x g'da30 s için kısa bir süre , bir pelet oluşturmamaya dikkat edin, sadece tüplerin yanlarındaki sıvıyı çıkarmak ve ardından numunenin 2 mL Lo-bind mikrosantrifüj tüpüne aktarılması.
    4. %2'lik son konsantrasyona %20 SDS'nin 1:10 hacmini ekleyin.
    5. 10 mM'lik son konsantrasyona 1:100 hacimli 1 M dithiothreitol (DTT) ekleyin ve numuneyi pipetleme ile iyice karıştırın, ardından 800 rpm ajitasyonda 10 dakika boyunca 95 °C'de bir termal ısıtma bloğunda inkübasyon. Daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğutun (soğutma buz üzerinde yapılabilir).
    6. 55 mM'lik son bir konsantrasyon elde etmek için 1:10 hacimli 0,55 M iodoasetamid (IAA) ekleyin ve pipetleme ile numuneyi iyice karıştırın. 20 dakika boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
    7. %80 asetonluk son konsantrasyon elde etmek için %100 aseton ekleyin ve proteinleri çökeltmek için numuneyi gece boyunca -20°C'de saklayın.
  2. Protein sindirimi
    1. Ertesi gün, 10.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile çökeltme peletini toplayın. Süpernatant atın ve peleti% 80 aseton 500 μL ile yıkayın. Toplam iki yıkama için tekrarlayın. Yıkamaları takiben oda sıcaklığında hava kuru pelet.
    2. Protein peletini 100 μL 8 M üre/40 mM HEPES'te yeniden çözün, bir buzlu su banyosunda 30 sn ve 30 s kapalı 15 döngü boyunca tam çözünürlük, girdap veya sonicate sağlamak için.
      NOT: Üre/HEPES hacminin ayarlanması çökmekte olan hücre peletinin boyutuna göre belirlenir, değişiklikler meydana gelirse tüm aşağı akış hacimleri uygun şekilde ayarlanmalıdır.
    3. Üreticinin talimatlarına göre protein testini (örneğin BCA protein tahlilini) kullanarak protein konsantrasyonu ölçün ve 8 M üre/40 mM HEPES ile boş normalleşme ile arka plan ölçümü için ayarlayın.
    4. Son 2 M üre konsantrasyonu elde etmek için 300 μL 50 mM amonyum bikarbonat ekleyin.
      NOT: Aşağı akış ölçümleri için protein konsantrasyonunun normalleştirilmesi fırsatı, 100 μg proteinin sindirilmesi ve kalan sindirilmemiş numunenin sıvı nitrojende flaş dondurma ile saklanması önerilir, daha sonra kısa süreli olarak -20 °C'de veya daha uzun süreli olarak -80 °C'de depolayın.
    5. Buz üzerine trypsin/Lys-C proteaz karışımının 2:50 (v/w) enzim-protein oranını ekleyin ve karıştırmak için tüpe hafifçe dokunun, oda sıcaklığında gece boyunca kuluçkaya yatırın.
    6. Kuluçkadan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10.000 x g'da 1:10 hacim durdurma çözeltisi (%20 asetonitril, %6 trifluoroasetik asit) ve santrifüj örnekleri ekleyerek sindirimi durdurun.
    7. Süpernatant toplayın(sindirilmiş peptitlerden oluşur)ve herhangi bir peletlenmiş döküntüğü veya çökeltiyi atın.
  3. Peptit tuzdan arındırma
    1. 2 dakika boyunca 100 μL%100 asetonitril ve santrifüj ekleyerek bir C18 Stop And Go Ekstraksiyonu (STAGE) ucunu (200 μL pipet ucunda 3 katman C18 reçineden oluşur) etkinleştirin.
    2. C18 STAGE ucunu 50 μL Tampon B (%80 (v/v) asetonitril, %0,5 (v/v) asetik asit) ve 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj ekleyerek dengelayın.
    3. C18 STAGE ucunu 200 μL Tampon A (%2 (v/v) asetonitril, %0,1 (v/v) trifluoroasetik asit, %0,5 (v/v) asetik asit) ve 3-5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj ekleyerek dengelayın.
    4. C18 STAGE ucuna ~50 μg sindirilmiş numune ekleyin ve 3-5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj veya numune spin sütunundan geçene kadar santrifüj ekleyin. Geri kalan sindirilmiş numuneyi sıvı nitrojende flaşla dondurun ve ihtiyaç duyulana kadar -20°C'de saklayın.
    5. C18 STAGE ucunu 200 μL Tampon A ve santrifüj ile 1.000 x g'da 3-5 dakika yıkayın.
    6. C18 STAGE ucuna 50 μL Tampon B ve 2 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj ekleyin. 0,2 mL PCR tüplerinde eluted peptitleri toplayın.
    7. Eluted peptidleri vakumlu santrifüjde maksimum hızda 30-40 dakika kurutun. Tamamen kurutulmuş numuneler işlenene kadar oda sıcaklığında veya -20 °C'de saklanabilir.
      NOT: Kurutulmuş ve tuzdan arındırılmış peptitler, işlenmek üzere kütle spektrometresi tesislerine uygun numune gönderimleridir ve ortam sıcaklığında sevk edilebilir.

6. Kütle spektrometresi

  1. 10 μL Tampon A'da peptitleri yeniden inşa edin ve MS sütununa ~1,5 ila 3 μg peptit enjekte etmek için gerekli konsantrasyonu ölçün. Numune miktarı enstrümantasyona bağlı olacaktır.
  2. Önceden belirlenmiş bir asetonitrile gradyani kullanın (yaklaşık% 5-60) peptitleri yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayırmak için istenen bir süre boyunca (örneğin, 2 saat) % 0,5 asetik asitte, ardından kütle spektrometresine elektrospray iyonizasyonu.
  3. Veriye bağımlı toplama modunda(m/z 300 ila 1650) yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanarak MS taramaları alın.
    NOT: Degrade yüzdesi ve uzunluğu deneme ve kullanıcı tarafından belirlenir. Hassas kütle spektrometresi ayarları enstrümantasyona, denemeye ve kullanıcı tercihine bağlıdır.

7. Veri analizi

NOT: MS verileri çok sayıda biyoinformatik işlem hattı ile işlenebilir. Bu protokolde, herkese açık MaxQuant ve Perseus platformlarını kullanarak işlemeyi açıklıyoruz, ancak bireysel kullanıcılara analiz, tercih ve kullanıma uygun biyoinformatik araçları değerlendirmelerini öneririz.

  1. MaxQuant yazılımını kullanarak işlenmemiş veri dosyalarını (doğrudan MS cihazından) yükleyin. Modifiye MaxQuant arama parametreleri altındaki proteinleri tanımlayın; %1'lik sahte bir keşif oranı için hedef yem yaklaşımı kullanarak protein tanımlaması için gerekli iki benzersiz peptit minimumu, çalıştırmalar arasında eşleştirme ile etiketsiz nicelik uygulayın, Andromeda arama motoru ile mevcut peptitleri tanımlamak ve ölçmek için UniProt veritabanından elde edilen FASTA dosyasını (örneğin, Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus)içeren organizmaları dahil edin. Ayrıntılı öğreticiler için herkese açık MaxQuant çevrimiçi araçlarına bakın (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. MaxQuant çıktı dosyasını ('proteingroups.txt') Perseus'a yükleyin.
  3. Olası yanlış pozitifler ve kirleticiler içeren satırları filtreleyin ve yalnızca 'Kategorik sütuna dayalı satırları filtrele' ile site peptitleri tarafından değiştirilir.
  4. Veri değerlerini günlük2 ölçeğinde dönüştürün.
  5. Satırlara kategorik ek açıklama sağlayarak veri kümesi grupları oluşturun.
  6. Protein algılama için bir kesme tanımlamak için veri kümesini geçerli değerlere göre filtreleyin.
    NOT: Sıkı ve sağlam bir analiz için %50 tanımlama oranı önerilir. Örneğin, dört çoğaltma işlenmişse, en az üç geçerli değer sayısı seçilir.
  7. Tercih edilirse, normal dağılımdaki eksik değerleri değiştirerek verileri impute.
    NOT: Imputed değerleri normal dağılım temel alınarak optimize edilmiştir ve tipik bolluk ölçümlerini simüle etmek için 'NaN' yer tutucularının yerini almak için rastgele bir LFQ yoğunluğu sağlar. Bu imputation, ölçülebilir veriler gerektiren aşağı akış istatistiksel analizi için bir platform sağlar.
  8. Protein satırlarına ek açıklamalar ekleyin (örneğin protein adları, Gen Ontoloji terimleri).
    NOT: Oluşturulan bu Perseus iş akışı artık daha fazla biyoinformatik işleme, istatistiksel analiz ve veri görselleştirme için sağlam bir çerçevedir, ayrıntılı öğreticiler için herkese açık Perseus çevrimiçi araçlarına bakın (bkz. Malzeme Tablosu).

Sonuçlar

Yukarıda özetlenen protokol, hem mantar patojeninden, hem C. neoformanlardanhem de konak makrofaj hücrelerinden elde edilen proteinlerin tek bir deneyde tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlar. Ortak kültürü takiben, hücreler toplanır ve birlikte işlenir ve her türe özgü peptit profillerine göre biyoinformatik olarak ayrılır. Bu, enfeksiyon sırasında konak-patojen ilişkisinin etkileşimini tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. Deneyden tanımlanan proteinlerin sayısı başla...

Tartışmalar

Protokoldeki kritik adımlar arasında makrofaj hücrelerinin hazırlanması ve hücrelerde minimum bozulma ile protein işleme için ortak kültür örneklerinin toplanması yer almaktadır. Toplamadan önce hücrelerin gereksiz lizizini önlemek için yapışkan makrofaj hücrelerini hafifçe ve dikkatlice yıkama, aşılama ve çıkarma adımlarını gerçekleştirmek önemlidir. Deney için doğru MOI'nin oluşturulması da kritik öneme sahiptir, çünkü aşırı yüksek bir MOI ile aşılamak hızlı makrofaj hüc...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Yazarlar, temsili deneyler için kütle spektrometresini çalıştırdıkları için Bioinformatics Solutions Inc.'den Dr. Jonathan Krieger'e ve deneysel kurulum ve el yazması geri bildirimlerine yardımcı olan Geddes-McAlister grubunun üyelerine teşekkür ediyor. Yazarlar, kısmen Banting Araştırma Vakfı'ndan - Jarislowsky Burs Keşif Ödülü' nden fon desteğini kabul ediyorlar, New Frontiers Araştırma Fonu – Keşif (NFRFE-2019-00425) ve J.G..M için Kanada İnovasyon Vakfı (JELF 38798) yanı sıra NSERC Kanada Lisansüstü Bursu – Yüksek Lisans ve Ontario Yüksek Lisans Bursu B.B.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mM Tris-HCl, pH 8.5Fisher ScientificBP152-1Maintain at 4°C
60 x 15 mm Dish, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific174888
6-well cell culture plateThermoFisher Scientific140675
Acetonitrile, MS gradePierceTS-51101
Acetic AcidSigma Aldrich1099510001
AcetoneSigma Aldrich34850-1L
Ammonium bicarbonate (ABC)ThermoFisher ScientificA643-500Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month.
Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection SystemFisher Scientific13-717-300Not essential, serological pipettes can be used to remove media.
C18 resin3M Empore3M2215
Cell ScrapersVWR10062-906Not essential, other methods to release macrophage cells can be used.
Centrifugal vaccuum concentratorEppendorf07-748-15
Complete Filtration UnitVWR10040-436
Conical falcon tubes (15 mL)Fisher Scientific05-539-12
Countess II Automated Cell CounterThermoFisher ScientificAMQAX1000Not essential, haemocytometer can be used as an alternative.
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity AssayPromegaG1780
Dithiothreitol (DTT)ThermoFisher ScientificR0861Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
DMEM, high glucose, GlutaMAX SupplementThermoFisher Scientific10566016
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher Scientific12483020Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation
HaemocytometerVWR15170-208
HEPESSigma AldrichH3375Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
High-performance liquid chromatography systemThermoFisher ScientificLC140Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples.
High-resolution mass spectrometerThermoFisher Scientific726042
Iodoacetamide (IAA)Sigma AldrichI6125Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
L-glutamineThermoFisher Scientific25030081Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
LoBind Microcentrifuge tubesEppendorf13-698-794
MaxQuanthttps://maxquant.org/MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets
MicrocentrifugeEppendorf13864457
Penicillin : Streptomycin 10k/10kVWRCA12001-692Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
Peptide separation columnsThermoFisher ScientificES803
Perseus Softwarehttp://maxquant.net/perseus/
Phosphate Buffered SalineVWRCA12001-676Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use.
Pierce BCA Protein AssayThermoFisher Scientific 23225
Pipette, Disposable Serological (10 mL)Fisher Scientific13-678-11E
Pipette, Disposable Serological (25 mL) BasixFisher Scientific14955235
Probe sonciatorThermoFisher Scientific100-132-894
Protease inhibitor cocktail tabletRoche4693159001
Sodium dodecyl sulfateThermoFisher Scientific2836420% (w/v)
Spectrophotometer (Nanodrop)ThermoFisher ScientificND-2000
STAGE tipping centrifugeSonationSTC-V2
Thermal ShakerVWRNO89232-908
Trifluoroacetic acidThermoFisher Scientific85183
Trypsin/Lys-C protease mix, MS gradePierceA40007Maintain at -20 °C.
Ultrasonic bathBransonicA89375-450Stored in cold room (4C)
UreaSigma AldrichU1250-1KGPrepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
Yeast-extract peptone dextrose brothBD DifcoBM20

Referanslar

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
  2. Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
  3. Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
  4. Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
  5. Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
  6. Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
  7. Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
  8. Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
  9. Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
  10. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  11. Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
  12. Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  13. Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
  14. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  15. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  16. Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
  17. Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
  18. Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
  19. Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
  20. Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
  21. Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
  22. Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
  23. Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
  24. Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  25. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  26. Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling - A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
  27. Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
  28. Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
  29. Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
  30. Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 164K tle spektrometresi bazl proteomiketiketsiz nicelemekonak patojen etkile imlerimemeli h cre k lt rmantar patojeniCryptococcus neoformans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır