Hasat ve Ayrıştırma: Biyofilm Yöntemleri Araştırmalarında Gözden Kaçan Bir Adım

Özet

Bu yazıda, iki yüzey tipinde üç yaygın biyofilm toplama ve ayrıştırma tekniğini gösteren yöntemler, bir hasat yönteminin sağlamlık testi ve tekrarlanabilirliği artırmak için hasat ve ayrıştırma tekniklerini seçerken ve optimize ederken göz önünde bulundurulması gereken minimum bilgiler açıklanmaktadır.

Özet

Biyofilm yöntemleri dört ayrı adımdan oluşur: biyofilmi ilgili bir modelde büyütmek, olgun biyofilmi işlemek, biyofilmi yüzeyden toplamak ve kümeleri ayırmak ve numuneyi analiz etmek. Dört adımdan, hasat ve ayrıştırma en az çalışılan, ancak test yanlılığı potansiyeli göz önüne alındığında yine de kritik olanıdır. Bu makalede, üç farklı yüzeyde yetiştirilen biyofilm için yaygın olarak kullanılan hasat ve ayrıştırma teknikleri gösterilmektedir. Kapsamlı bir literatür taramasından toplanan üç biyofilm toplama ve ayrıştırma tekniği, vorteks ve sonikasyon, kazıma ve homojenizasyon ve kazıma, vorteks ve sonikasyonu içerir. İki yüzey tipi göz önünde bulundurulur: sert gözeneksiz (polikarbonat ve borosilikat cam) ve gözenekli (silikon). Ek olarak, izlenen hasat tekniğini bildirirken dahil edilmesi gereken minimum bilgiler ve önyargıyı kontrol etmek için eşlik eden bir yöntem için önerilerde bulunuyoruz.

Giriş

Biyofilmin tanımı son birkaç on yılda gelişmiştir ve çeşitli biyolojik ve / veya biyolojik olmayan yüzeylerle mikrobiyal ilişkiyi, bir matris içinde farklı büyüme ve genetik ^ekspresyon2 gösteren hücresel olmayan ^{bileşenlerin1} dahil edilmesini kapsar. Biyofilm, kurutma gibi çevresel streslerden korunma sağlar ve kimyasal dezenfektanların etkisini mikropların hayatta kalmasına neden olacak şekilde daha az etkili hale getirebilir. Bir biyofilm içinde hayatta kalanlar, potansiyel olarak bir halk sağlığı sorunu olan patojenik mikroorganizmaların bir kaynağını ^{sağlayabilir3}.

Biyofilm yöntemleri büyüme, arıtma, örnekleme (hasat ve ayrıştırma) ve analiz olmak üzere dört adımdan oluşur. Kullanıcının organizma büyüme koşullarını, sıcaklığını, ortamını vb. belirlediği ilk adım olan büyüme, biyofilm literatüründe en çok düşünülen ve raporlanan adımdır4,5,6,7. Tedavi adımı, olgun bir biyofilme3,8,9 karşı etkinliklerini belirlemek için antimikrobiyalleri (örneğin, dezenfektanlar) değerlendirir veya antimikrobiyal^, ürünün biyofilm büyümesini önleme veya azaltma yeteneğini belirlemek için yüzeye dahil ^edilebilir10. Üçüncü adım olan örnekleme, biyofilmi üzerinde büyüdüğü yüzeyden toplama ve çıkarılan kümeleri ayrıştırma adımlarını içerir3,8,11. Dördüncü adım olan analiz, canlı hücre sayımlarını, mikroskopiyi, floresan ölçümlerini, moleküler sonuçları ve / veya bir matris bileşeni değerlendirmesini ^{içerebilir8,9}. Verilerin değerlendirilmesi, bir deneyin sonucu hakkında bilgi sağlar. Dördü arasında, örnekleme genellikle en çok göz ardı edilen adımdır, çünkü seçilen biyofilm toplama ve / veya ayrıştırma tekniğinin, genellikle doğrulama olmadan% 100 etkili olduğunu ^varsayar11.

Genellikle homojen olduğu düşünülen bakterilerin planktonik süspansiyonları, analizden önce basit vorteks gerektirir. Bununla birlikte, biyofilmler mikroorganizmalardan (prokaryotik ve / veya ökaryotik), ekzopolisakkaritlerden, proteinlerden, lipitlerden, hücre dışı DNA'dan ve konakçı hücrelerden oluşan karmaşık ^{topluluklardır12}. Biyofilmi bir yüzeyden yeterince hasat etmek ve daha sonra homojen bir tek hücreli süspansiyona ayırmak için geleneksel planktonik mikrobiyolojik kültür yöntemlerinin ötesine geçen adımlara ihtiyaç vardır. Kapsamlı bir literatür taraması (bu yayında yer almayan bilgiler), çıkarma ve ayrıştırma tekniğinin seçiminin, biyofilmde bulunan türler, biyofilmin bağlı olduğu yüzey (gözeneksiz veya gözenekli), büyüme yüzeylerine erişilebilirlik (kolayca çıkarılabilir kupon veya biyofilmin büyüdüğü aparatın fiziksel tahribatı) dahil olmak üzere bir dizi faktöre bağlı olduğunu göstermiştir. yüzey geometrisi (alan ve şekil), büyüme yüzeylerinde biyofilm yoğunluğu ve mevcut laboratuvar ekipmanları.

Biyofilm bir yüzeyden toplandığında, ortaya çıkan hücre süspansiyonu heterojendir. Bu düzgün olmayan süspansiyon doğru bir şekilde numaralandırılacaksa, tek tek hücrelere ayrıştırılmalıdır. Canlı plaka sayımları, koloni oluşturan bir birimin bir bakteriden kaynaklandığını varsayar. Biyofilm agregaları büyüme ortamına yerleştirilirse, yanlış tahminlere yol açabilecek bireysel hücreleri ayırt etmek imkansızdır. Örneğin, dezenfektan etkinlik testi sırasında, bir işlem biyofilmi kontrole kıyasla bir yüzeyden çok etkili bir şekilde çıkarırsa, kütük azaltma kontrole kıyasla yapay olarak büyük görünebilir. Öte yandan, biyofilmi kontrole kıyasla bir yüzeye sabitleyen kimyasal bir dezenfektan, daha düşük bir kütük azaltma oranına sahip gibi ^{görünecektir11}. Bu tür bir senaryo, deneysel verilerin önyargılı yorumlanmasına yol açabilir.

Yayına hazırlanırken, literatürün gözden geçirilmesi, biyofilmin toplanması ve ayrıştırılmasına yönelik yaygın yaklaşımların kazıma, sürüntü alma, sonikasyon, vorteks veya bunların bir kombinasyonunu içerdiğini belirlemiştir. Kazıma, biyofilmin steril bir çubuk, spatula veya başka bir aletle yüzeylerden fiziksel olarak uzaklaştırılması olarak tanımlanır. Swabbing, biyofilmin pamuklu uçlu bir çubuk veya başka bir sabit emici malzeme ile yüzeylerden uzaklaştırılmasını ifade eder. Sonikasyon, biyofilmin su yoluyla dağıtılan ultrasonik dalgalar yoluyla yüzeylerden bozulmasını ifade eder. Vorteksing, bir tüp içindeki numunenin sıvı vorteksini elde etmek için bir karıştırıcının kullanılmasını ifade eder. Homojenizasyon, hasat edilen biyofilm kümelerini tek bir hücre süspansiyonuna kesmek için döner bıçaklar kullanır. Bu yazıda, sert/gözeneksiz ve gözenekli olmak üzere iki farklı yüzey tipi için üç hasat ve ayrıştırma yöntemi sunulmuştur.

Araştırmacıların yayınların yöntemler bölümlerine dahil etmeleri gereken önerilen asgari bilgilerin bir listesi sağlanır. Bu bilgilerin dahil edilmesinin, diğer araştırmacıların çalışmalarını yeniden üretmelerini sağladığını umuyoruz. Mükemmel bir hasat ve ayrıştırma yöntemi yoktur, bu nedenle tekniğin nasıl kontrol edileceğine dair öneriler de sağlanmaktadır.

Bu makalede, biyofilmi ortak büyüme yüzeylerinden toplamak ve ayrıştırmak için üç yaygın yöntem gösterilmiştir. Bu bilgi, araştırmacıların bir biyofilm test yönteminin genel hassasiyetini ve önyargısını daha iyi anlamalarını sağlayacaktır. Açıklanan yöntemler şunlardır: (1) CDC Biyofilm Reaktöründe yüksek sıvı makası altında polikarbonat kuponlar (sert gözeneksiz yüzey) üzerinde yetiştirilen bir Pseudomonas aeruginosa biyofilmi, biyofilm hasadı ve ayrışması elde etmek için vorteks ve sonikasyonun beş adımlı bir kombinasyonunu takiben hasat edilir ve ayrıştırılır (2) A P. aeruginosa Düşük sıvı makası altında damlama akış reaktöründe borosilikat cam kuponlarda (sert gözeneksiz yüzey) yetiştirilen biyofilm, kazıma ve homojenizasyon kullanılarak toplanır ve ayrıştırılır (3) Silikon boruda (gözenekli yüzey) yetiştirilen bir Escherichia coli biyofilmi, kazıma kullanılarak hasat edilir ve ayrıştırılır, ardından sonikasyon ve vorteks yapılır.

Protokol

1. Vorteks ve sonication

1. ASTM Standardı E25622'ye göre yetiştirilen olgun bir P. aeruginosa ATCC 15442 biyofilmi yetiştirin.
2. 48 saatlik büyüme süresinin sonunda, biyofilm ve numune kuponlarını ASTM Standardı E28718'e göre işlemeye hazırlanın.
3. Otoklavlanmış sıçrama korumalarını, alevle sterilize edilmiş forseps kullanarak steril 50 mL konik tüplere aseptik olarak yerleştirin. Tedavi görecek tüm tüpler için tekrarlayın. Kontrol kuponları için tüplerin bir sıçrama korumasına ihtiyacı yoktur.
4. CDC Biyofilm Reaktöründen rastgele seçilen bir çubuğu aseptik olarak çıkarın. Çubuğu hafifçe 30 mL steril tamponlu suya batırarak gevşek bir şekilde tutturulmuş hücreleri çıkarmak için kuponları durulayın.
5. Çubuğu tezgah üstüne paralel olarak, boş, steril 50 mL konik bir tüp üzerinde tutun ve alevle sterilize edilmiş bir Allen anahtarı kullanarak, biyofilm kaplı bir kuponu tüpe düşürmek için vidayı gevşetin. İstediğiniz kupon sayısı için tekrarlayın. Sıçrama korumalarını çıkarın ve sterilizasyon için ayrı bir kaba yerleştirin.
6. 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, işlemin 4 mL'sini yavaşça pipetleyin veya tüplere kontrol edin, böylece sıvı tüpün duvarının iç kısmından aşağı akar.
7. Kuponun altındaki hava kabarcıklarının yer değiştirmesi için tüpün tabanına hafifçe dokunun. Her ekleme arasında 30 - 60 s izin verin.
8. Belirtilen temas süresinin sonunda, 36 mL nötrleştirici pipeti, tedavinin (veya kontrolün) uygulandığı sırayla tüplere girer.
   NOT: Kombine arıtma ve nötrleştiricinin son hacmi, biyofilm log yoğunluğunun doğru bir şekilde belirlenmesi için önemlidir.
9. Her tüpü 30 ± 5 s için en yüksek ayarda vorteksleyin. Tam bir girdabın elde edildiğinden emin olun.
   NOT: Kırılmanın meydana gelebileceği cam şişelerde paslanmaz çelik gibi ağır kuponları vortekslerken dikkatli olunmalıdır.
10. Gerçek numuneleri işlemeden önce banyo başına en uygun tüp sayısını ve test tüpü rafına yerleştirmeyi belirleyin. Birden fazla numune işliyorsanız, sonikasyon banyosundaki su sıcaklığının 21 ± 2 ^oC olduğunu onaylayın.
11. Tüpleri, gazdan arındırılmış sonikatörde asılı tüp rafına yerleştirin, böylece banyodaki su seviyesi tüplerdeki sıvı seviyesine eşit olur. 45 kHz'de sonikat,% 100 güç ve 30 ± 5 s için Normal işlev. Vorteks ve sonikasyon döngülerini tekrarlayın ve ardından son bir vorteks ile bitirin (toplam 5 döngü).
    NOT: Hasat edilmiş ve ayrıştırılmış biyofilm içeren bu tüpler ^{100 veya 0} seyreltmedir.
12. Numuneyi tamponlanmış suda seri olarak seyreltin. Uygun kaplama yöntemi kullanılarak R2A agar üzerine plaka. 24 saat boyunca 36 ± 2 ^oC'de inkübe edin. Kullanılan kaplama yöntemine uygun kolonileri sayın ve verileri kaydedin.

2. Kazıma ve homojenizasyon

1. ASTM Standardı E264713'e göre olgun bir P. aeruginosa ATCC 15442 biyofilm yetiştirin.
2. Numune alma istasyonunu, numune alma panosu, bir beherde% 95 etanol, alkol brülörü, hemostatlar, kupon çıkarma aracı, steril seyreltme suyu içeren beherler ve kuponları durulamak için seyreltme tüpleri içerecek şekilde ayarlayın.
3. Pompayı kapatın. Bir kanal kapağını çıkarın ve biyofilmi rahatsız etmemeye dikkat ederek kuponu çıkarmak için steril bir kupon çıkarma aleti ve hemostatlar kullanın.
4. Kuponu, akıcı bir hareketle, 45 mL steril seyreltme suyuna (50 mL'lik bir santrifüj tüpünde bulunur) hafifçe batırarak durulayın. Kuponu kaldırmak için hareketi hemen tersine çevirin.
5. Kuponu 45 mL steril seyreltme suyu içeren bir beherin içine yerleştirin. Biyofilm kaplı kupon yüzeyini, steril bir spatula veya kazıyıcı kullanarak yaklaşık 15 s boyunca aşağı doğru bir yönde kazıyın. Spatula veya kazıyıcıyı beherde karıştırarak durulayın. Kazıma ve durulama işlemini 3-4 kez tekrarlayın ve kupon yüzeyinin tam olarak kaplanmasını sağlayın.
6. Kuponu steril kabın üzerinde 60°'lik bir açıyla tutarak ve kuponun yüzeyine 1 mL steril seyreltme suyu pipetleyerek durulayın. Toplam 5 durulama için tekrarlayın. Beherdeki son hacim 50 mL'dir.
   NOT: Kombine arıtma ve nötrleştiricinin son hacmi, biyofilm log yoğunluğunun doğru bir şekilde belirlenmesi için önemlidir.
7. Kuponlar çıkarıldığında her kanal kapağını değiştirin.
8. Biyogüvenlik kabininde çalışarak, kazınmış biyofilm numunesini homojenize edin. Homojenizatöre steril bir homojenizatör probu takın, prob ucunu sıvıya yerleştirin, homojenizatörü açın ve 20.500 rpm'ye kadar yükseltin.
9. Numuneyi 30 saniye homojenize edin. RPM'leri kapatın ve homojenizatörü kapatın.
10. Yukarıda açıklandığı gibi 30 s boyunca 20.500 rpm'de 9 mL'lik bir steril seyreltme boşluğunu homojenize ederek biyofilm numuneleri arasındaki probu sterilize edin. 9 mL'lik bir %70 etanol tüpünü 30 s için homojenize edin, probu ayırın ve 1 dakika boyunca etanol tüpünde bekletin. İki ek seyreltme boşluğunu homojenize edin.
    NOT: Her numune için tek kullanımlık homojenizatör probu kullanılabilir.
11. Numuneleri tamponlanmış suda seri olarak seyreltin. Uygun kaplama yöntemini kullanarak R2A agar üzerine plaka. Plakaları 24 saat boyunca 36 ± ^2oC'de inkübe edin, kolonileri kullanılan kaplama yöntemine uygun olarak sayın ve verileri kaydedin.

3. Kazıma, vorteks ve sonikasyon

1. Silikon kateter tüpünde olgun bir Escherichia coli ATCC 53498 biyofilm ^{yetiştirin10}.
2. Numune alma malzemeleri hazırlayın: durulama tüpleri, steril santrifüj tüpü, boş steril Petri kabı, alevle sterilize edilmiş paslanmaz çelik hemostat ve makas, zamanlayıcı ve cetvel.
3. Pompa duraklatıldığında, borunun dışını temizlemek için% 70 etanol kullanın. Konektöre bağlı alandan kaçınarak uçtan 2 cm ölçün ve kesme yerlerini belirlemek için boruyu işaretleyin.
4. Alevle sterilize edilmiş makasla boruyu 2 cm işareti üzerinde kesin ve segmenti boş steril Petri kabına yerleştirin. Boruyu% 70 etanol ile silin ve distal ucu atık boruya yeniden bağlayın.
5. Planktonik hücreleri çıkarmak için boru segmentini durulayın. Alevle sterilize edilmiş forsepslerle, boru segmentini nazikçe 20 mL steril seyreltme suyuna batırın ve ardından hemen çıkarın. Segmenti 10 mL nötrleştiriciye yerleştirin.
6. Alevle sterilize edilmiş forsepslerle, boru segmentini tutun ve borunun tüm iç alanları kazınana kadar steril ahşap aplikatör çubuğu ile kazıyın. Bazen çubuğu 10 mL nötrleştirici içinde durulayın ve segmenti numune tüpüne geri yerleştirin. Kazınmış boru segmenti 100 veya ⁰ seyreltmedir.
   NOT: Kombine arıtma ve nötrleştiricinin son hacmi, biyofilm log yoğunluğunun doğru bir şekilde belirlenmesi için önemlidir.
7. Her tüpü 30 ± 5 s için en yüksek ayarda vorteksleyin. Tüpü sonikatörde asılı tüp rafına yerleştirin, böylece banyodaki su seviyesi tüplerdeki sıvı seviyesine eşit olur. 45 kHz'de,% 100 güçte ve 30 ± 5 saniye boyunca Normal işlevde sonikat. Vorteks ve sonikasyon döngülerini tekrarlayın, ardından son bir vorteks ile sona erin.
   NOT: Hasat edilmiş ve ayrıştırılmış biyofilm içeren bu tüp ¹⁰⁰ seyreltmedir.
8. Numuneleri tamponlanmış suda seri olarak seyreltin. Triptik Soya Agar üzerine uygun kaplama yöntemi kullanılarak plaka.
9. Plakaları 24 saat boyunca 36 ± 2 ^oC'de inkübe edin. Kullanılan kaplama yöntemine uygun kolonileri sayın, verileri kaydedin ve aritmetik ortalamayı hesaplayın.

Sonuçlar

Bir Hasat Yönteminin Doğrulanması/Onaylanması
Laboratuvarımızda yapılan çeşitli çalışmalar, Tek Tüp Yöntemi (ASTM E2871) ⁸ kullanılarak biyofilm reaktöründe (ASTM E2562)² yetiştirilen biyofilmi etkili bir şekilde hasat etmek için vorteks ve sonikasyon yeteneğini incelemiştir.

Bir P. aeruginosa ATCC 15442 biyofilmi, borosilikat cam kuponlar üzerinde ASTM E25622'ye göre yetiştirildi.

Tartışmalar

Hasat ve ayrıştırma yöntemleri için minimum bilgi
Bilimsel topluluk genelinde tekrarlanabilir biyofilm verileri oluşturmak için, yazarların bir biyofilm yönteminin büyüme, tedavi, örnekleme ve analiz adımlarının her biri ile ilgili mümkün olduğunca fazla ayrıntı içermesi zorunludur. Biyofilm yöntemlerinin standardizasyonu, araştırmacının belirli bir yönteme ve ilgili değişikliklere atıfta bulunmasına izin verdiği için bu çabaya yardımcı olmuştur. Bununla birlikte, ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical vials	Thermo Scientific	339652
100 mL glass beakers	Fisher Scientific	FB102100
5 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-12D	For adding treatment to vials containing coupons.
50 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-14C	For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.
Applicator sticks	Puritan	807
Hemostats	Fisher Scientific	16-100-115
Metal spatula	Fisher Scientific	14-373
PTFE policemen	Saint-Gobain	06369-04
S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool	IKA	4446700	For homogenization of biofilm samples.
Scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Silicone Foley catheter, size 16 French	Medline Industries	DYND11502
Silicone tubing, size 16	Cole-Parmer	EW96400-16
Splash Guards	BioSurface Technologies, Inc.	CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser	IKA	3737001	For homogenization of biofilm samples.
Tubing connectors	Cole-Parmer	EW02023-86
Ultrasonic Cleaner	Elma	TI-H15
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder	Scientific Industries	SI-V506