Récolte et désagrégation : une étape négligée dans la recherche sur les méthodes de biofilm

Résumé

Cet article détaille les méthodes qui démontrent trois techniques courantes de récolte et de désagrégation du biofilm sur deux types de surface, les tests de robustesse d’une méthode de récolte et les informations minimales à prendre en compte lors du choix et de l’optimisation des techniques de récolte et de désagrégation pour augmenter la reproductibilité.

Résumé

Les méthodes de biofilm se composent de quatre étapes distinctes: cultiver le biofilm dans un modèle pertinent, traiter le biofilm mature, récolter le biofilm de la surface et désagréger les amas, et analyser l’échantillon. Des quatre étapes, la récolte et la désagrégation sont les moins étudiées, mais néanmoins essentielles lorsqu’on considère le potentiel de biais des tests. Cet article présente les techniques de récolte et de désagrégation couramment utilisées pour le biofilm cultivé sur trois surfaces différentes. Les trois techniques de récolte et de désagrégation du biofilm, glanées dans une vaste revue de la littérature, comprennent le vortex et la sonication, le grattage et l’homogénéisation, ainsi que le grattage, le vortex et la sonication. Deux types de surface sont considérés: dur non poreux (polycarbonate et verre borosilicate) et poreux (silicone). De plus, nous fournissons des recommandations pour les informations minimales qui devraient être incluses lors de la déclaration de la technique de récolte suivie et une méthode d’accompagnement pour vérifier les biais.

Introduction

La définition du biofilm a évolué au cours des dernières décennies et englobe l’association microbienne avec une variété de surfaces biologiques et/ou non biologiques, l’inclusion de composants non ^cellulaires1 qui présentent une croissance et une expression génétique ^{différentes2} au sein d’une matrice. Le biofilm offre une protection contre les stress environnementaux tels que le séchage et peut rendre l’action des désinfectants chimiques moins efficace, ce qui entraîne la survie des microbes. Les survivants d’un biofilm peuvent potentiellement fournir une source de micro-organismes pathogènes qui constituent un problème de santé ^publique3.

Les méthodes de biofilm comprennent quatre étapes, la croissance, le traitement, l’échantillonnage (récolte et désagrégation) et l’analyse. La croissance, la première étape, où l’utilisateur détermine les conditions de croissance de l’organisme, la température, le milieu, etc., est la plus considérée et rapportée dans la littérature sur les biofilms4,5,6,7. L’étape du traitement évalue les antimicrobiens (p. ex. les désinfectants) afin de déterminer leur efficacité soit par rapport à un biofilm ^mature3,8,9, soit par l’antimicrobien qui peut être incorporé dans la surface pour déterminer la capacité du produit à prévenir ou à réduire la croissance du ^biofilm10. La troisième étape, l’échantillonnage, comprend des étapes pour récolter le biofilm de la surface sur laquelle il poussait et pour désagréger les touffes enlevées3,8,11. La quatrième étape, l’analyse, peut inclure le comptage de cellules viables, la microscopie, les mesures de fluorescence, les résultats moléculaires et/ou une évaluation des composants ^{matriciels8,9}. L’évaluation des données fournit des informations sur les résultats d’une expérience. Des quatre, l’échantillonnage est souvent l’étape la plus négligée car elle suppose que la technique de récolte et/ou de désagrégation du biofilm choisie est efficace à 100 %, souvent sans ^{vérification11}.

Les suspensions planctoniques de bactéries, souvent considérées comme homogènes, nécessitent un simple vortex avant l’analyse. Les biofilms, cependant, sont des communautés complexes composées de micro-organismes (procaryotes et/ou eucaryotes), d’exopolysaccharides, de protéines, de lipides, d’ADN extracellulaire et de cellules ^hôtes12. Des étapes au-delà des méthodes traditionnelles de culture microbiologique planctonique sont nécessaires pour récolter adéquatement le biofilm d’une surface, puis le désagréger en une suspension homogène à cellule unique. Une analyse approfondie de la littérature (informations non incluses dans cette publication) a démontré que le choix de la technique d’élimination et de désagrégation dépend d’un certain nombre de facteurs, notamment les espèces présentes dans le biofilm, la surface à laquelle le biofilm est attaché (non poreux ou poreux), l’accessibilité aux surfaces de croissance (coupon facilement amovible ou destruction physique de l’appareil dans lequel le biofilm se développe), la géométrie de surface (surface et forme), la densité du biofilm sur les surfaces de croissance et l’équipement de laboratoire disponible.

Lorsque le biofilm est récolté à partir d’une surface, la suspension cellulaire résultante est hétérogène. Si cette suspension non uniforme doit être énumérée avec précision, elle doit être désagrégée en cellules individuelles. Les comptages sur plaque viables supposent qu’une unité formant une colonie provient d’une bactérie. Si des agrégats de biofilm sont placés sur le milieu de croissance, il est impossible de distinguer les cellules individuelles, ce qui pourrait conduire à des estimations inexactes. Par exemple, lors des tests d’efficacité du désinfectant, si un traitement élimine très efficacement le biofilm d’une surface par rapport au témoin, la réduction logarithmique pourrait sembler artificiellement importante par rapport au témoin. D’autre part, un désinfectant chimique qui fixe le biofilm sur une surface par rapport au témoin semblera avoir une réduction logarithmique plus ^faible11. Ce type de scénario pourrait conduire à une interprétation biaisée des données expérimentales.

En préparation de la publication, une revue de la littérature a déterminé que les approches courantes de la récolte et du désagrégage du biofilm comprennent le grattage, l’écouvillonnage, la sonication, le vortex ou une combinaison de ceux-ci. Le grattage est défini comme l’élimination physique du biofilm des surfaces à l’aide d’un bâton stérile, d’une spatule ou d’un autre outil. L’écouvillonnage fait référence à l’élimination du biofilm des surfaces avec un bâton à pointe de coton ou un autre matériau absorbant fixe. La sonication fait référence à la perturbation du biofilm des surfaces par des ondes ultrasonores distribuées dans l’eau. Le vortex fait référence à l’utilisation d’un mélangeur pour obtenir un vortex liquide de l’échantillon à l’intérieur d’un tube. L’homogénéisation utilise des lames rotatives pour cisailler les amas de biofilm récoltés en une suspension à cellule unique. Dans cet article, nous présentons trois méthodes de récolte et de désagrégation pour deux types de surface différents, dur/non poreux et poreux.

Une liste des renseignements minimaux recommandés que les chercheurs devraient inclure dans les sections sur les méthodes des publications est fournie. Nous espérons que l’inclusion de ces informations permettra à d’autres chercheurs de reproduire leurs travaux. Il n’y a pas de méthode parfaite de récolte et de désagrégation, par conséquent, des recommandations sur la façon de vérifier la technique sont également fournies.

Trois méthodes courantes pour récolter et désagréger le biofilm à partir de surfaces de croissance communes sont démontrées dans cet article. Cette information permettra aux chercheurs de mieux comprendre la précision globale et le biais d’une méthode d’essai de biofilm. Les méthodes décrites sont les suivantes: (1) Un biofilm de Pseudomonas aeruginosa cultivé sur des coupons en polycarbonate (surface dure non poreuse) sous cisaillement fluide élevé dans le réacteur à biofilm CDC est récolté et désagrégé après une combinaison en cinq étapes de vortex et de sonication pour obtenir la récolte et la désagrégation du biofilm (2) A P. aeruginosa le biofilm cultivé sur des coupons de verre borosilicate (surface dure non poreuse) dans le réacteur à écoulement goutte à goutte sous faible cisaillement fluide est récolté et désagrégé par grattage et homogénéisation (3) Un biofilm d’Escherichia coli cultivé dans des tubes en silicone (surface poreuse) est récolté et désagrégé par grattage, suivi d’une sonication et d’un vortex.

Protocole

1. Vortex et sonication

1. Cultivez un biofilm mature de P. aeruginosa ATCC 15442 cultivé selon la norme ASTM E25622.
2. À la fin de la période de croissance de 48 h, préparez-vous à traiter le biofilm et échantillonnez les coupons conformément à la norme ASTM E28718
3. Insérer de manière aseptique des pare-éclaboussures autoclavés dans des tubes coniques stériles de 50 mL à l’aide de pinces stérilisées à la flamme. Répétez l’opération pour tous les tubes qui recevront un traitement. Les tubes pour coupons de contrôle n’ont pas besoin d’un pare-éclaboussures.
4. Retirez de manière aseptique une tige sélectionnée au hasard du réacteur à biofilm du CDC. Rincez les coupons pour enlever les cellules lâchement attachées en trempant doucement la tige dans 30 mL d’eau tamponnée stérile.
5. Maintenez la tige parallèlement à la paillasse, sur un tube conique vide et stérile de 50 mL et à l’aide d’une clé Allen stérilisée à la flamme, desserrez la vis pour laisser tomber un coupon enduit de biofilm dans le tube. Répétez l’opération pour le nombre de coupons souhaité. Retirez les pare-éclaboussures et placez-les dans un récipient séparé pour la stérilisation.
6. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, pipette lentement 4 mL du traitement ou de la commande dans les tubes afin que le liquide s’écoule à l’intérieur de la paroi du tube.
7. Tapotez doucement le fond du tube afin que toutes les bulles d’air sous le coupon soient déplacées. Prévoyez 30 à 60 s entre chaque ajout.
8. À la fin du temps de contact spécifié, pipette 36 mL de neutralisant dans les tubes dans le même ordre que le traitement (ou le contrôle) a été appliqué.
   REMARQUE: Le volume final de traitement combiné et de neutralisant est important pour déterminer avec précision la densité logarithmique du biofilm.
9. Vortex chaque tube sur le réglage le plus élevé pendant 30 ± 5 s. Assurez-vous qu’un vortex complet est atteint.
   REMARQUE: Il faut faire preuve de prudence lors du vortex de coupons lourds tels que l’acier inoxydable dans des flacons en verre où une rupture pourrait se produire.
10. Déterminez le nombre optimal de tubes par bain et par emplacement dans le rack de tubes à essai avant de traiter les échantillons réels. Si vous traitez plusieurs échantillons, vérifiez que la température de l’eau dans le bain de mesure est de 21 ± 2 ^oC.
11. Placez les tubes dans un rack à tubes suspendu dans un sonicateur dégazé de telle sorte que le niveau d’eau dans le bain soit égal au niveau de liquide dans les tubes. Sonicate à 45 kHz, puissance à 100% et fonction normale pendant 30 ± 5 s. Répétez les cycles de vortex et de sonication, puis terminez par un vortex final (5 cycles au total).
    REMARQUE: Ces tubes avec le biofilm récolté et désagrégé sont la dilution ¹⁰⁰ ou 0.
12. Diluer l’échantillon en série dans de l’eau tamponnée. Plaque sur gélose R2A en utilisant la méthode de placage appropriée. Incuber à 36 ± 2 ^oC pendant 24 h. Compter les colonies en fonction de la méthode de placage utilisée et enregistrer les données.

2. Raclage et homogénéisation

1. Cultivez un biofilm mature de P. aeruginosa ATCC 15442 selon la norme ASTM E264713.
2. Configurez la station d’échantillonnage pour inclure une planche d’échantillonnage, de l’éthanol à 95% dans un bécher, un brûleur à alcool, des hémostats, un outil de retrait de coupon, des béchers avec de l’eau de dilution stérile et des tubes de dilution pour rincer les coupons.
3. Éteignez la pompe. Retirez un couvercle de canal et utilisez un outil de retrait de coupon stérile et des hémostats pour retirer le coupon, en prenant soin de ne pas perturber le biofilm.
4. Rincer le coupon en immergeant doucement, avec un mouvement fluide, dans 45 mL d’eau de dilution stérile (contenue dans un tube centrifuge de 50 mL). Inversez immédiatement le mouvement pour retirer le coupon.
5. Placer le coupon dans un bécher contenant 45 mL d’eau de dilution stérile. Gratter la surface du coupon recouverte de biofilm dans une direction descendante pendant environ 15 s, à l’aide d’une spatule stérile ou d’un grattoir. Rincez la spatule ou le grattoir en le remuant dans le bécher. Répétez le processus de raclage et de rinçage 3-4 fois, en assurant une couverture complète de la surface du coupon.
6. Rincez le coupon en le maintenant à un angle de 60° sur le bécher stérile et en pipetant 1 mL d’eau de dilution stérile sur la surface du coupon. Répétez l’opération pour un total de 5 rinçages. Le volume final dans le bécher est de 50 mL.
   REMARQUE: Le volume final de traitement combiné et de neutralisant est important pour déterminer avec précision la densité logarithmique du biofilm.
7. Remplacez chaque couvercle de canal lorsque les coupons sont retirés.
8. En travaillant dans l’armoire de biosécurité, homogénéiser l’échantillon de biofilm gratté. Fixez une sonde d’homogénéisateur stérile à l’homogénéisateur, placez la pointe de la sonde dans le liquide, allumez l’homogénéisateur et montez jusqu’à 20 500 tr / min.
9. Homogénéiser l’échantillon pendant 30 s. Baissez les rpm et éteignez l’homogénéisateur.
10. Désinfecter la sonde entre les échantillons de biofilm en homogénéisant un blanc de dilution stérile de 9 mL à 20 500 tr/min pendant 30 s comme décrit ci-dessus. Homogénéiser un tube de 9 mL d’éthanol à 70% pendant 30 s, détacher la sonde et laisser reposer dans le tube d’éthanol pendant 1 min. Homogénéiser deux ébauches de dilution supplémentaires.
    REMARQUE: Une sonde d’homogénéisateur jetable peut être utilisée pour chaque échantillon.
11. Diluer en série les échantillons dans de l’eau tamponnée. Plaque sur gélose R2A en utilisant la méthode de placage appropriée. Incuber des plaques à 36 ± 2 ^oC pendant 24 h, compter les colonies en fonction de la méthode de placage utilisée et enregistrer les données.

3. Grattage, vortex et sonication

1. Cultivez un biofilm mature d’Escherichia coli ATCC 53498 dans un tube de cathéter en ^silicone10.
2. Préparer le matériel d’échantillonnage: tubes de rinçage, tube de centrifugeuse stérile, boîte de Petri stérile vide, hémostat et ciseaux en acier inoxydable stérilisé à la flamme, minuterie et règle.
3. Lorsque la pompe est en pause, utilisez 70% d’éthanol pour nettoyer l’extérieur du tube. Mesurez 2 cm de l’extrémité, en évitant la zone fixée au connecteur, et marquez le tube pour déterminer les emplacements de coupe.
4. Avec des ciseaux stérilisés à la flamme, coupez le tube sur la marque de 2 cm et placez le segment dans une boîte de Petri stérile vide. Essuyez le tube avec de l’éthanol à 70% et reconnectez l’extrémité distale au tube à déchets.
5. Segment de tuyauterie de rinçage pour éliminer les cellules planctoniques. Avec des pinces stérilisées à la flamme, immergez doucement le segment de tuyau dans 20 mL d’eau de dilution stérile, puis retirez-le immédiatement. Placez le segment dans 10 mL de neutralisant.
6. Avec les pinces stérilisées à la flamme, maintenez le segment de tube et grattez avec un bâton applicateur en bois stérile jusqu’à ce que toutes les zones intérieures du tube aient été grattées. Rincez de temps en temps le bâton dans les 10 mL de neutralisant et replacez le segment dans le tube d’échantillonnage. Le segment de tube raclé est la dilution ¹⁰⁰ ou 0.
   REMARQUE: Le volume final de traitement combiné et de neutralisant est important pour déterminer avec précision la densité logarithmique du biofilm.
7. Vortex chaque tube sur le réglage le plus élevé pendant 30 ± 5 s. Placez le tube dans un rack à tubes suspendu dans un sonicator de telle sorte que le niveau d’eau dans le bain soit égal au niveau de liquide dans les tubes. Sonicate à 45 kHz, puissance à 100% et fonction normale pendant 30 ± 5 secondes. Répétez les cycles de vortex et de sonication, puis terminez par un vortex final.
   REMARQUE: Ce tube avec le biofilm récolté et désagrégé est la dilution ¹⁰⁰ .
8. Diluer en série les échantillons dans de l’eau tamponnée. Plaque sur gélose de soja tryptique en utilisant la méthode de placage appropriée.
9. Incuber des plaques à 36 ± 2 ^oC pendant 24 h. Compter les colonies en fonction de la méthode de placage utilisée, enregistrer les données et calculer la moyenne arithmétique.

Résultats

Validation/Confirmation d’une méthode de récolte
Plusieurs études menées dans notre laboratoire ont examiné la capacité du vortex et de la sonication à récolter efficacement le biofilm cultivé dans le réacteur à biofilm (ASTM E2562)² en utilisant la méthode du tube unique (ASTM E2871)⁸.

Un biofilm P. aeruginosa ATCC 15442 a été cultivé selon la norme ASTM E25622 sur des coupons en verre borosilicate.<...

Discussion

Informations minimales pour les méthodes de récolte et de désagrégation
Pour créer des données reproductibles sur les biofilms dans l’ensemble de la communauté scientifique, il est impératif que les auteurs incluent autant de détails que possible concernant chacune des étapes de croissance, de traitement, d’échantillonnage et d’analyse d’une méthode de biofilm. La normalisation des méthodes de biofilm a aidé dans cette entreprise car elle permet au chercheur de référencer une m...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical vials	Thermo Scientific	339652
100 mL glass beakers	Fisher Scientific	FB102100
5 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-12D	For adding treatment to vials containing coupons.
50 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-14C	For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.
Applicator sticks	Puritan	807
Hemostats	Fisher Scientific	16-100-115
Metal spatula	Fisher Scientific	14-373
PTFE policemen	Saint-Gobain	06369-04
S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool	IKA	4446700	For homogenization of biofilm samples.
Scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Silicone Foley catheter, size 16 French	Medline Industries	DYND11502
Silicone tubing, size 16	Cole-Parmer	EW96400-16
Splash Guards	BioSurface Technologies, Inc.	CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser	IKA	3737001	For homogenization of biofilm samples.
Tubing connectors	Cole-Parmer	EW02023-86
Ultrasonic Cleaner	Elma	TI-H15
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder	Scientific Industries	SI-V506