Raccolta e disaggregazione: un passo trascurato nella ricerca sui metodi di biofilm

Riepilogo

Questo documento descrive i metodi che dimostrano tre comuni tecniche di raccolta e disaggregazione del biofilm su due tipi di superficie, test di robustezza di un metodo di raccolta e informazioni minime da considerare quando si scelgono e ottimizzano le tecniche di raccolta e disaggregazione per aumentare la riproducibilità.

Abstract

I metodi del biofilm consistono in quattro fasi distinte: far crescere il biofilm in un modello pertinente, trattare il biofilm maturo, raccogliere il biofilm dalla superficie e disaggregare i ciuffi e analizzare il campione. Delle quattro fasi, la raccolta e la disaggregazione sono le meno studiate, ma comunque critiche quando si considera il potenziale di distorsione dei test. Questo articolo dimostra le tecniche di raccolta e disaggregazione comunemente usate per il biofilm coltivato su tre diverse superfici. Le tre tecniche di raccolta e disaggregazione del biofilm, raccolte da un'ampia revisione della letteratura, includono vortice e sonicazione, raschiatura e omogeneizzazione e raschiatura, vortice e sonicazione. Vengono considerati due tipi di superficie: duro non poroso (policarbonato e vetro borosilicato) e poroso (silicone). Inoltre, forniamo raccomandazioni per le informazioni minime che dovrebbero essere incluse quando si segnala la tecnica di raccolta seguita e un metodo di accompagnamento per verificare la presenza di pregiudizi.

Introduzione

La definizione di biofilm si è evoluta negli ultimi decenni e comprende l'associazione microbica con una varietà di superfici biologiche e/o non biologiche, l'inclusione di componenti noncellulari1 che mostrano una crescita e un'espressione genetica ^diverse2 all'interno di una matrice. Il biofilm fornisce protezione dagli stress ambientali come l'essiccazione e può rendere l'azione dei disinfettanti chimici meno efficace con conseguente sopravvivenza dei microbi. I sopravvissuti all'interno di un biofilm possono potenzialmente fornire una fonte di microrganismi patogeni che sono un problema di salute ^pubblica3.

I metodi di biofilm sono composti da quattro fasi: crescita, trattamento, campionamento (raccolta e disaggregazione) e analisi. La crescita, il primo passo, in cui l'utente determina le condizioni di crescita dell'organismo, la temperatura, i mezzi, ecc., È il più considerato e riportato nella letteratura sui ^{biofilm4,5,6,7}. La fase di trattamento valuta gli antimicrobici (ad esempio, disinfettanti) per determinarne l'efficacia contro un biofilm maturo3,8,9 o l'antimicrobico può essere incorporato nella superficie per determinare la capacità del prodotto di prevenire o ridurre la crescita del ^biofilm10. La terza fase, il campionamento, include passaggi per raccogliere il biofilm dalla superficie su cui stava crescendo e per disaggregare i grumi rimossi3,8,11. La quarta fase, l'analisi, può includere conteggi cellulari vitali, microscopia, misurazioni di fluorescenza, esiti molecolari e/o una valutazione dei componenti della ^matrice8,9. La valutazione dei dati fornisce informazioni sull'esito di un esperimento. Dei quattro, il campionamento è spesso il passaggio più trascurato perché presume che la tecnica di raccolta e/o disaggregazione del biofilm scelta sia efficace al 100%, spesso senza ^verifica11.

Le sospensioni planctoniche di batteri, spesso considerate omogenee, richiedono un semplice vortice prima dell'analisi. I biofilm, invece, sono comunità complesse composte da microrganismi (procariotici e/o eucariotici), esopolisaccaridi, proteine, lipidi, DNA extracellulare e cellule ^ospiti12. Sono necessari passi oltre i tradizionali metodi di coltura microbiologica planctonica per raccogliere adeguatamente il biofilm da una superficie e quindi disaggregarlo in una sospensione monocellulare omogenea. Un'ampia rassegna della letteratura (informazioni non incluse in questa pubblicazione) ha dimostrato che la scelta della tecnica di rimozione e disaggregazione dipende da una serie di fattori, tra cui le specie presenti nel biofilm, la superficie a cui è attaccato il biofilm (non porosa o porosa), l'accessibilità alle superfici di crescita (cedola facilmente rimovibile o distruzione fisica dell'apparato in cui il biofilm sta crescendo), geometria della superficie (area e forma), densità del biofilm sulle superfici di crescita e attrezzature di laboratorio disponibili.

Quando il biofilm viene raccolto da una superficie, la sospensione cellulare risultante è eterogenea. Se questa sospensione non uniforme deve essere enumerata con precisione, deve essere disaggregata in singole celle. I conteggi delle piastre vitali presuppongono che un'unità formante una colonia provenga da un batterio. Se gli aggregati di biofilm sono posizionati sul terreno di crescita, è impossibile distinguere le singole cellule che potrebbero portare a stime imprecise. Ad esempio, durante i test di efficacia del disinfettante, se un trattamento rimuove il biofilm in modo molto efficace da una superficie rispetto al controllo, la riduzione del log potrebbe apparire artificialmente grande rispetto al controllo. D'altra parte, un disinfettante chimico che fissa il biofilm su una superficie rispetto al controllo sembrerà avere una riduzione del log ^inferiore11. Questo tipo di scenario potrebbe portare a un'interpretazione distorta dei dati sperimentali.

In preparazione alla pubblicazione, una revisione della letteratura ha determinato che gli approcci comuni alla raccolta e alla disaggregazione del biofilm includono raschiatura, tampone, sonicazione, vortice o una combinazione di questi. La raschiatura è definita come la rimozione fisica del biofilm dalle superfici con un bastone sterile, una spatola o un altro strumento. Il tampone si riferisce alla rimozione del biofilm dalle superfici con un bastoncino con punta di cotone o altro materiale assorbente fisso. La sonicazione si riferisce alla rottura del biofilm dalle superfici tramite onde ultrasoniche distribuite attraverso l'acqua. Il vortice si riferisce all'uso di un miscelatore per ottenere un vortice liquido del campione all'interno di un tubo. L'omogeneizzazione utilizza lame rotanti per tagliare i grumi di biofilm raccolti in una sospensione a singola cellula. In questo articolo, presentiamo tre metodi di raccolta e disaggregazione per due diversi tipi di superficie, dura / non porosa e porosa.

Viene fornito un elenco di informazioni minime raccomandate che i ricercatori dovrebbero includere nelle sezioni sui metodi delle pubblicazioni. Speriamo che l'inclusione di queste informazioni consenta ad altri ricercatori di riprodurre il loro lavoro. Non esiste un metodo di raccolta e disaggregazione perfetto, pertanto vengono fornite anche raccomandazioni su come controllare la tecnica.

Tre metodi comuni per raccogliere e disaggregare il biofilm da superfici di crescita comuni sono dimostrati in questo articolo. Queste informazioni consentiranno ai ricercatori di comprendere meglio la precisione complessiva e la distorsione di un metodo di prova del biofilm. I metodi descritti sono i seguenti: (1) Un biofilm pseudomonas aeruginosa coltivato su cedole di policarbonato (superficie dura non porosa) sotto elevato taglio fluido nel reattore a biofilm CDC viene raccolto e disaggregato seguendo una combinazione in cinque fasi di vortice e sonicazione per ottenere la raccolta e la disaggregazione del biofilm (2) A P. aeruginosa il biofilm coltivato su cedole di vetro borosilicato (superficie dura non porosa) nel reattore a flusso di gocciolamento sotto basso taglio fluido viene raccolto e disaggregato utilizzando raschiatura e omogeneizzazione (3) Un biofilm di Escherichia coli coltivato in tubi di silicone (superficie porosa) viene raccolto e disaggregato usando raschiatura, seguito da sonicazione e vortice.

Protocollo

1. Vortice e sonicazione

1. Coltivare un biofilm maturo di P. aeruginosa ATCC 15442 coltivato secondo lo standard ASTM E25622.
2. Alla fine del periodo di crescita di 48 ore, preparati a trattare il biofilm e i coupon campione secondo lo standard ASTM E28718
3. Inserire asetticamente paraspruzzi autoclavati in tubi conici sterili da 50 ml utilizzando pinze sterilizzate a fiamma. Ripetere per tutti i tubi che riceveranno il trattamento. I tubi per i coupon di controllo non hanno bisogno di un paraspruzzi.
4. Rimuovere asetticamente un'asta selezionata casualmente dal reattore a biofilm CDC. Risciacquare i tagliandi per rimuovere le cellule attaccate liberamente immergendo delicatamente l'asta in 30 ml di acqua tamponata sterile.
5. Tenere l'asta parallela al piano di lavoro, su un tubo conico vuoto e sterile da 50 ml e utilizzando una chiave a brugola sterilizzata a fiamma, allentare la vite per far cadere un coupon rivestito di biofilm nel tubo. Ripeti per il numero desiderato di coupon. Rimuovere i paraspruzzi e metterli in un contenitore separato per la sterilizzazione.
6. Utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml, pipettare lentamente 4 mL del trattamento o del controllo nei tubi in modo che il liquido scorra lungo l'interno della parete del tubo.
7. Picchiettare delicatamente il fondo del tubo in modo che eventuali bolle d'aria sotto il coupon vengano spostate. Consentire 30 - 60 s tra ogni aggiunta.
8. Alla fine del tempo di contatto specificato, pipettare 36 mL di neutralizzatore nei tubi nello stesso ordine in cui è stato applicato il trattamento (o il controllo).
   NOTA: Il volume finale del trattamento combinato e del neutralizzatore è importante per determinare con precisione la densità del log del biofilm.
9. Vortice ogni tubo sull'impostazione più alta per 30 ± 5 s. Assicurarsi che si raggiunga un vortice completo.
   NOTA: Si deve prestare attenzione quando si vorticolano tagliandi pesanti come l'acciaio inossidabile in flaconcini di vetro in cui potrebbe verificarsi la rottura.
10. Determinare il numero ottimale di provette per bagno e il posizionamento all'interno del rack della provetta prima di elaborare i campioni effettivi. Se si elaborano più campioni, verificare che la temperatura dell'acqua nel bagno sonicante sia di 21 ± 2 ^oC.
11. Posizionare i tubi nella cremagliera sospesa nel sonicatore degassato in modo tale che il livello dell'acqua nel bagno sia uguale al livello del liquido nei tubi. Sonicate a 45 kHz, potenza al 100% e funzione normale per 30 ± 5 s. Ripeti i cicli di vortice e sonicazione e poi termina con un vortice finale (5 cicli totali).
    NOTA: Questi tubi con il biofilm raccolto e disaggregato sono la diluizione ¹⁰⁰ o 0.
12. Campione diluito in serie in acqua tamponata. Piastra su agar R2A utilizzando il metodo di placcatura appropriato. Incubare a 36 ± 2 ^oC per 24 ore. Contare le colonie in base al metodo di placcatura utilizzato e registrare i dati.

2. Raschiatura e omogeneizzazione

1. Coltivare un biofilm maturo di P. aeruginosa ATCC 15442 secondo lo standard ASTM E264713.
2. Impostare la stazione di campionamento per includere il pannello di campionamento, l'etanolo al 95% in un becher, il bruciatore di alcol, gli emostati, lo strumento di rimozione dei coupon, i becher con acqua di diluizione sterile e i tubi di diluizione per il risciacquo dei coupon.
3. Spegnere la pompa. Rimuovere una copertura del canale e utilizzare uno strumento sterile per la rimozione del coupon e gli emostati per rimuovere il coupon, facendo attenzione a non disturbare il biofilm.
4. Risciacquare la cedola immergendola delicatamente, con un movimento fluido, in 45 ml di acqua di diluizione sterile (contenuta in un tubo centrifuga da 50 ml). Invertire immediatamente il movimento per rimuovere il coupon.
5. Inserire il coupon in un becher contenente 45 ml di acqua di diluizione sterile. Raschiare la superficie della cedola ricoperta di biofilm in direzione verso il basso per circa 15 s, usando una spatola sterile o un raschietto. Risciacquare la spatola o il raschietto mescolandolo nel becher. Ripetere il processo di raschiatura e risciacquo 3-4 volte, garantendo la copertura completa della superficie del coupon.
6. Risciacquare la cedola tenendola con un angolo di 60° sul becher sterile e pipettare 1 mL di acqua di diluizione sterile sulla superficie della cedola. Ripetere l'operazione per un totale di 5 risciacqui. Il volume finale nel becher è di 50 ml.
   NOTA: Il volume finale del trattamento combinato e del neutralizzatore è importante per determinare con precisione la densità del log del biofilm.
7. Sostituisci ogni copertina del canale man mano che i coupon vengono rimossi.
8. Lavorando nell'armadio di biosicurezza, omogeneizzare il campione di biofilm raschiato. Collegare una sonda omogeneizzatore sterile all'omogeneizzatore, posizionare la punta della sonda nel liquido, accendere l'omogeneizzatore e rampare fino a 20.500 giri / min.
9. Omogeneizzare il campione per 30 s. Abbassare gli RPM e spegnere l'omogeneizzatore.
10. Sanificare la sonda tra i campioni di biofilm omogeneizzando un vuoto di diluizione sterile di 9 ml a 20.500 giri / min per 30 s come descritto sopra. Omogeneizzare un tubo da 9 ml di etanolo al 70% per 30 s, staccare la sonda e lasciare riposare il tubo di etanolo per 1 minuto. Omogeneizzare due spazi vuoti di diluizione aggiuntivi.
    NOTA: per ogni campione può essere utilizzata una sonda omogeneizzatore monouso.
11. Diluire in serie i campioni in acqua tamponata. Piastra su agar R2A utilizzando il metodo di placcatura appropriato. Incubare le piastre a 36 ± ^2oC per 24 ore, contare le colonie come appropriato al metodo di placcatura utilizzato e registrare i dati.

3. Raschiatura, vortice e sonicazione

1. Coltivare un biofilm maturo Escherichia coli ATCC 53498 in tubo catetere ^siliconico10.
2. Preparare i materiali di campionamento: tubi di risciacquo, tubo centrifugo sterile, piastra di Petri sterile vuota, emostato e forbici in acciaio inossidabile sterilizzato a fiamma, timer e righello.
3. Con la pompa in pausa, utilizzare il 70% di etanolo per pulire l'esterno del tubo. Misurare 2 cm dall'estremità, evitando l'area attaccata al connettore, e contrassegnare il tubo per determinare le posizioni di taglio.
4. Con le forbici sterilizzate a fiamma, tagliare il tubo sul segno di 2 cm e posizionare il segmento in una capsula di Petri sterile vuota. Pulire il tubo con etanolo al 70% e ricollegare l'estremità distale al tubo di scarico.
5. Risciacquare il segmento del tubo per rimuovere le cellule planctoniche. Con una pinza sterilizzata a fiamma, immergere delicatamente il segmento del tubo in 20 ml di acqua di diluizione sterile e quindi rimuovere immediatamente. Posizionare il segmento in 10 ml di neutralizzatore.
6. Con una pinza sterilizzata a fiamma, tenere premuto il segmento del tubo e raschiare con un bastoncino applicatore di legno sterile fino a quando tutte le aree interne del tubo sono state raschiate. Risciacquare occasionalmente il bastoncino nei 10 ml di neutralizzatore e riposizionare il segmento nella provetta del campione. Il segmento dei tubi raschiati è la diluizione ¹⁰⁰ o 0.
   NOTA: Il volume finale del trattamento combinato e del neutralizzatore è importante per determinare con precisione la densità del log del biofilm.
7. Vortice ogni tubo sull'impostazione più alta per 30 ± 5 s. Posizionare il tubo nel rack del tubo sospeso nel sonicatore in modo tale che il livello dell'acqua nel bagno sia uguale al livello del liquido nei tubi. Sonicate a 45 kHz, potenza al 100% e funzione normale per 30 ± 5 secondi. Ripeti i cicli di vortice e sonicazione, quindi termina con un vortice finale.
   NOTA: Questo tubo con il biofilm raccolto e disaggregato è la diluizione ¹⁰⁰ .
8. Diluire in serie i campioni in acqua tamponata. Piastra su Tryptic Soy Agar utilizzando il metodo di placcatura appropriato.
9. Incubare le piastre a 36 ± 2 ^oC per 24 ore. Contare le colonie in base al metodo di placcatura utilizzato, registrare i dati e calcolare la media aritmetica.

Risultati

Validazione/Conferma di un metodo di raccolta
Diversi studi condotti nel nostro laboratorio hanno esaminato la capacità del vortice e della sonicazione di raccogliere efficacemente il biofilm coltivato nel reattore a biofilm (ASTM E2562)² utilizzando il metodo a tubo singolo (ASTM E2871)⁸.

Un biofilm P. aeruginosa ATCC 15442 è stato coltivato secondo ASTM E25622 su tagliandi di vetro borosilicato.^<...

Discussione

Informazioni minime per i metodi di raccolta e disaggregazione
Per creare dati riproducibili sul biofilm in tutta la comunità scientifica, è imperativo che gli autori includano il maggior numero possibile di dettagli su ciascuna delle fasi di crescita, trattamento, campionamento e analisi di un metodo di biofilm. La standardizzazione dei metodi del biofilm ha aiutato in questo sforzo in quanto consente al ricercatore di fare riferimento a un metodo specifico e ad eventuali modifiche rilevanti. Tutta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical vials	Thermo Scientific	339652
100 mL glass beakers	Fisher Scientific	FB102100
5 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-12D	For adding treatment to vials containing coupons.
50 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-14C	For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.
Applicator sticks	Puritan	807
Hemostats	Fisher Scientific	16-100-115
Metal spatula	Fisher Scientific	14-373
PTFE policemen	Saint-Gobain	06369-04
S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool	IKA	4446700	For homogenization of biofilm samples.
Scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Silicone Foley catheter, size 16 French	Medline Industries	DYND11502
Silicone tubing, size 16	Cole-Parmer	EW96400-16
Splash Guards	BioSurface Technologies, Inc.	CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser	IKA	3737001	For homogenization of biofilm samples.
Tubing connectors	Cole-Parmer	EW02023-86
Ultrasonic Cleaner	Elma	TI-H15
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder	Scientific Industries	SI-V506