Ko-kültürlerden İnvaziv Hücre Alt Popülasyonlarının Gerçek Zamanlı Tespiti ve Yakalanması

Özet

İnvaziv hücre alt popülasyonlarını gerçek zamanlı olarak tespit etmek ve yakalamak için bir yaklaşım açıklıyoruz. Deneysel tasarım, hücrelerin elektrik empedansındaki değişiklikleri izleyerek Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz kullanır. Kompleks dokulardaki invaziv kanser, immün, endotel veya stromal hücreler yakalanabilir ve ko-kültürlerin etkisi değerlendirilebilir.

Özet

Kanser hücrelerinin invazyonu ve metastatik yayılımı kanserden ölümün başlıca nedenidir. Kanser hücresi popülasyonlarının invaziv potansiyelini ölçmek için erken geliştirilen testler, tipik olarak, farklı invaziv potansiyele sahip kanser hücresi alt popülasyonları arasında ayrım yapmayan tek bir son nokta ölçümü oluşturur. Ayrıca, tümör mikroçevresi, kanser hücrelerinin invaziv davranışını değiştiren ve bunlara katılan farklı yerleşik stromal ve bağışıklık hücrelerinden oluşur. Dokulara invazyon, bağışıklık hücresi alt popülasyonlarının mikroorganizmaları savuşturmada veya doku yeniden şekillenmesi ve anjiyogenez sırasında parankim ve endotel hücrelerinden hastalıklı hücreleri ortadan kaldırmada da rol oynar. Hücre invazyonunu izlemek için empedans biyosensörlerini kullanan Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz (RTCA), invazyonun son nokta ölçümünün ötesinde ileriye doğru atılmış büyük bir adımdı: bu, zaman içinde sürekli ölçümler sağlar ve böylece son nokta analizinde kaybolan istila oranlarındaki farklılıkları ortaya çıkarabilir. Mevcut RTCA teknolojisini kullanarak, stromal ve / veya bağışıklık hücreleri içerebilen ve zaman içinde ko-kültürlü stromal veya bağışıklık hücrelerinden salgılanan faktörlerin etkisi altında invazyon oranını ölçmeye izin veren başka bir oda ekleyerek çift odacıklı dizileri genişlettik. Bunun ötesinde, benzersiz tasarım, odaların herhangi bir zamanda ayrılmasına ve en invaziv kanser hücresinin veya test edilen tümör izolatlarının heterojen karışımlarında bulunan diğer hücre alt popülasyonlarının izole edilmesine izin verir. Bu en invaziv kanser hücreleri ve diğer hücre alt popülasyonları, metastatik hastalığa malign ilerlemeyi tetikler ve moleküler özellikleri, derinlemesine mekanik çalışmalar, tespitleri için tanısal probların geliştirilmesi ve kırılganlıkların değerlendirilmesi için önemlidir. Bu nedenle, küçük veya büyük moleküllü ilaçların dahil edilmesi, invaziv davranışı inhibe etmek (örneğin, kanser hücreleri) veya arttırmak (örneğin, bağışıklık hücreleri) amacıyla kanser ve / veya stromal hücre alt popülasyonlarını hedef alan tedavilerin potansiyelini test etmek için kullanılabilir.

Giriş

Hücre invazyonu, stromal hücreler tarafından sağlanan çevresel ipuçlarına yanıt olarak hücrelerin bazal membran bariyerlerini geçmesini sağlayan önemli bir süreçtir. Lokal lezyonlardan invaziv ve metastatik kanserlere ilerleyebilen immün yanıtlar, yara iyileşmesi, doku onarımı ve maligniteler için gelişimin çeşitli aşamalarında çok önemli bir adımdır¹. Hücre popülasyonlarının invaziv potansiyelini ölçmek için erken geliştirilen tahliller tipik olarak tek bir son nokta ölçümü oluşturur veya invaziv hücrelerin önceden etiketlenmesini gerektirir². Mikroelektronik ve mikroakışkan tekniklerinin entegrasyonu, mikroelektrotlar üzerindeki canlı hücrelerin elektrik empedansını kullanarak hücre biyolojisinin canlılık, hareket ve bağlanma gibi farklı yönlerini tespit etmek için geliştirilmiştir ^3,4. Empedans ölçümü, hücre durumunun etiketsiz, invaziv olmayan ve kantitatif bir değerlendirmesine izin verir³. Burada, Abassi ve ^ark.5 tarafından geliştirilen Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz (RTCA) sisteminin tasarımına dayanan üç odacıklı bir dizgeyi tanımlıyoruz. Üç odacıklı dizi, ek analizler veya genişleme için hücresel invazyon ve invaziv hücrelerin geri kazanımı üzerine ko-kültürlü hücrelerin değerlendirilmesine izin verir.

Hücre analizörü sisteminde, hücreler gözenekli bir zar üzerine kaplanmış hücre dışı bir matristen istila eder ve bariyerin karşı tarafına yerleştirilmiş interdijitasyonlu bir elektrot dizisine ulaşır. İnvaziv hücreler zamanla bu elektrot dizisini bağlamaya ve işgal etmeye devam ettikçe, elektriksel empedans paralel olarak değişir. Mevcut sistem, iki odacıklı bir hücre invazyonu ve göçü (CIM) 16 kuyucuklu plakadan oluşmaktadır. RTCA-DP (çift amaçlı) (bundan böyle çift amaçlı hücre analizörü olarak adlandırılacaktır) cihazı, empedans ölçümü için sensörler ve empedans verilerini analiz etmek ve işlemek için entegre yazılım içerir. Başlangıçtaki empedans değerleri, kuyucuklardaki ortamın iyonik gücüne bağlıdır ve hücreler elektrotlara bağlandıkça değişir. Empedans değişiklikleri, hücre sayısına, morfolojilerine ve hücrelerin elektrotlara ne ölçüde bağlandığına bağlıdır. Hücreler eklenmeden önce kuyucukların medya ile ölçülmesi, arka plan sinyali olarak kabul edilir. Arka plan, elektrotlara bağlanan ve yayılan hücrelerle dengeye ulaştıktan sonra empedans ölçümlerinden çıkarılır. Hücre İndeksi (CI) olarak adlandırılan bir elektrot üzerindeki hücrelerin durumunun birimsiz bir parametresi aşağıdaki gibi hesaplanır: CI = (dengeden sonra empedans - hücrelerin yokluğunda empedans) / nominal empedans değeri⁶. Farklı hücre çizgilerinin geçiş oranları karşılaştırıldığında, Delta CI, ilk birkaç ölçümde temsil edilen bağlanma farkından bağımsız olarak hücre durumunu karşılaştırmak için kullanılabilir.

Yeni tasarlanan üç odacıklı dizi, mevcut tasarıma dayanır ve elektrotları içeren çift amaçlı hücre analizörü sisteminin üst odacığını kullanır. Modifiye edilmiş orta ve alt odalar, entegre yazılım kullanılarak empedans ölçümü ve analizi için montajın çift amaçlı hücre analizörüne sığdırılması için uyarlanmıştır. Yeni tasarımın mevcut çift odacıklı CIM-plakası (bundan böyle hücre analizörü plakası olarak adlandırılacaktır) üzerinde sağladığı iki önemli gelişme şunlardır: i) heterojen hücre karışımlarında bulunan invaziv hücre alt popülasyonlarını kurtarma ve daha sonra analiz etme yeteneği ve ii) ko-kültürlü stromal veya bağışıklık hücrelerinden salgılanan faktörlerin hücre invazyonu üzerindeki etkisini değerlendirme seçeneği (Şekil 1).

Bu teknoloji, farklı invaziv kapasitelere sahip hücrelerin alt popülasyonlarını incelemede yararlı olabilir. Bu, (a) çevre dokuları veya kan ve lenfatik damarları istila eden veya uzak organlardaki metastatik tohumlama bölgelerinde ekstravazasyon yapan invaziv kanser hücrelerini, (b) patojenleri veya hastalıklı hücreleri ele almak için dokuları istila eden bağışıklık sisteminden hücreleri, (c) doku yeniden yapılanması veya yara iyileşmesi sırasında yeni kan damarları oluşturmak için dokuları istila eden endotel hücrelerini, ayrıca (d) kanser hücrelerini destekleyen ve istila eden tümör mikro ortamından stromal hücreler. Bu yaklaşım, hücre motilitesini ve invazyonunu modüle edebilen stromal çapraz konuşmanın dahil edilmesine izin verir. Burada gösterilen fizibilite çalışmaları, kanser hücresi invazyonuna ve kanser hücrelerinden gelen diferansiyel sinyallere yanıt olarak endotel invazyonu da dahil olmak üzere stroma ile etkileşime odaklanan bu modifiye diziyi model bir sistem olarak kullanmaktadır. Yaklaşım, kanser hücrelerini ve bağışıklık hücrelerinin alt popülasyonları, fibroblastlar veya endotel hücreleri gibi diğer hücre tiplerini izole etmek için tahmin edilebilir. İnvaziv ve non-invaziv yerleşmiş meme kanseri hücre hatlarını ilkenin bir kanıtı olarak test ettik. Ayrıca, klinik tanı ortamlarında da gelecekteki kullanım için fizibilite göstermek için insan kemik iliğinden bağışıklık hücrelerine yanıt olarak hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) invazyonundan elde edilen hücreleri kullandık. PDX, orijinal hasta için büyüme, progresyon ve tedavi seçeneklerinin incelenmesine izin vermek için bağışıklık sistemi baskılanmış veya insanlaştırılmış fareler modeline implante edilen hasta tümör dokularıdır ^7,8.

Protokol

Çalışma, Georgetown Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve "muaf" olarak kabul edilmiştir (IRB # 2002-022). Taze hasat edilmiş kemik iliği dokuları, tanımlanmamış olan atılmış sağlıklı insan kemik iliği toplama filtrelerinden toplandı.

1. Yeni oda tasarımı (Şekil 2)

1. Yeni bir çift odacıklı hücre analizörü plakası açın. Üst odayı elektrotlarla bir kenara koyun.
2. Bir freze makinesi kullanarak, hücre analizörü plakasının U şeklindeki alt kuyucuklarının 2 mm'sini tıraş edin.
3. UV küratörlüğünde yapıştırıcı kullanarak tıraşlı kuyucukların dibine 0,2 μm gözenek boyutuna sahip 2 cm x 7 cm polietersülfon (PES) membran takın. Tutkalın tamamen kürlendiğinden ve hareketsiz olduğundan emin olmak için 30 dakika kürasyon süresi bekleyin.
4. Bir freze makinesi kullanarak, yeni imal edilen üçüncü odanın sırtlarına yapışmak için yanlar boyunca iki uzunlamasına yarık (1,5 mm x 5,6 mm) kesin.
5. Bir freze makinesi kullanarak, hücre analizörü plakasının genel boyutlarını kopyalayan üçüncü bir polikarbonat hazne oluşturun; 72 mm x 18 mm (Malzeme Tablosu).
6. Hücre analizörü plakasının 16 delikli tasarımını çoğaltmak için 4,8 mm derinliğinde ve 4,75 mm çapında kuyular oluşturun. Bu, kuyu başına 90 μL hacme izin verir.
7. Yanlarda, iki üçgen sırt oluşturun, böylece oda adım 1.4'te oluşturulan orijinal yarıklara kilitlenir. Üçgenin yatay kısmı 1,5 mm, dikey 1,4 mm ve hipotenüs 2,052 mm'dir.
8. Kısa tarafta, orijinal plakanın çentiğine sığması için 50,8 mm çapında ve 1,397 mm yüksekliğinde bir düğme oluşturun (Şekil 2, Orta).
9. Sızdırmaz bir uyum sağlamak için her bir kuyucuk için 0,9 mm kalınlığında bir kauçuk yıkayıcı kullanın.

2. Hücre kültürü (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblastlar)

1. Yapışkan hücre kültürlerini (~% 70 birleşim) 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
2. Hücreleri kaldırmak için% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin.
3. Tripsin çözeltisini serum içeren hücre kültürü ortamı ile nötralize edin ve hücre süspansiyonunun bir aliquot'unu kullanarak hücreleri sayın.
   NOT: Belirli hücre kültürü ortamı Tablo 1'de bulunabilir.

3. Hasta kaynaklı ksenogreft ayrışması

1. Steril bir neşter kullanarak taze bir tümör parçasını (1^cm2) ince bir mantara doğrayın.
2. 3 mg / mL tripsin ve 2 mg / mL kollajenaz ile desteklenmiş 20 mL DMEM F12 ortamı içeren 50 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin.
3. 20 dakika boyunca 37 °C'de bir termal çalkalayıcıda (150 RPM) inkübe edin.
4. Tüpü 5 dakika boyunca 500 x g'de döndürün; süpernatanı çıkarın.
5. Hücreleri yıkamak için 20 μL DMEM F12 +% 2 FBS ekleyin; 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün ve süpernatanı çıkarın. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
6. Hücreleri saymak için 1 mL PDX ortamında (Tablo 1) yeniden askıya alın.

4. Kemik iliği hücresi ekstraksiyonu

1. Kemik iliği (BM) toplama filtresini 25 mL 1x PBS ile yıkayın.
   NOT: Bu çalışmada, filtrede kalan BM'yi toplamak için hastaneden kullanılmış bir BM toplama filtresine PBS eklenmiştir.
2. Yıkanmış BM'yi, katmanları mümkün olduğunca ayrı tutmaya özen göstererek, 25 mL yoğunluk gradyan ortamına sahip 50 mL'lik bir konik tüpe yavaşça ekleyin.
3. 18 °C'de 20 dakika boyunca 800 x g'de döndürün
4. Santrifüjlemeden (yağ / plazma) sonra üst katmanları sifonlayın ve BM hücrelerine sahip yoğunluk gradyanı ortamının üzerindeki beyaz tabakanın 5 mL'sini 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
   NOT: Alternatif olarak, 5 mL'lik bir pipeti orta katmana (BM) dokunana kadar üst tabakaya batırın ve pipeti hareket ettirmeden orta tabakadan çok yavaş bir şekilde pipet çekin.
5. 15 mL konik tüpü 1x PBS (~10 mL) ile doldurun ve 15 dakika boyunca 300 x g'de döndürün.
6. Süper natantı çıkarın; kalan beyaz pelet BM'dir.
7. Pelette kırmızı kan hücreleri gözlenirse, 5 mL RBC lizis çözeltisi (Malzeme Tablosu) ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika bekletin. 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün ve süpernatanı çıkarın.
8. Hücreleri yıkamak için 10 mL 1x PBS ekleyin, 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün ve süpernatanı çıkarın. Pelet beyaz olana kadar RBC lizisini (adım 4.7) tekrarlayın.

5. Hücre tohumlama ve montaj

1. Üç steril odacığı da doku kültürü başlığına yerleştirin.
2. Alt odanın kısa tarafındaki düğmeyi bulun. Alt odayı, düğme deneyciye bakacak şekilde yönlendirin.
3. Alt odanın her bir kuyucuğuna 90 μL ortamda 30.000-50.000 hücre ekleyin. Kabarcık oluşturmaktan kaçının. Bunlar, salgılanan faktörleri sağlayacak ancak üst odanın elektrotları tarafından tespit edilmeyecek stromal hücrelerdir.
4. Hücre hareketliliği için pozitif bir kontrol olarak iki alt oda kuyusunda% 5 fetal sığır serumu takviyeli ortam kullanın. Negatif kontrol olarak% 0 serum takviyeli ortam kullanın.
5. Hücrelerin bulunduğu alt odanın, yerleşmesi için kaputta 10-15 dakika oturmasına izin verin.
   NOT: Bu adım, hücreler yapışmışsa veya süspansiyonda büyüyorsa önerilir.
6. Alt odayı 90°'de döndürün ve orta odayı üste yerleştirin, böylece alt odadaki düğme orta odadaki çentiğin içine kayar.
   NOT: Alt bölmedeki düğme ve orta odadaki mavi nokta, düzeneğin zıt uçlarındadır.
7. Montajın uzun kenarlarının her birinden bir tıklama sesi duyulana kadar dikey olarak aşağı doğru itin.
8. Orta odanın tüm kuyularına 160 μL serumsuz ortam ekleyin.
9. Kuyular doldurulduktan sonra kubbe şeklinde bir menisküsün görünür olduğundan emin olun; aksi takdirde, pipet kalibrasyonuna bağlı olarak son ses seviyesini ayarlayın. Kabarcık oluşturmaktan kaçının.
10. Üst odacığı elektrotlar aşağı bakacak şekilde orta bölmeye yerleştirin ve mavi noktaları orta ve üst bölmelere hizaladığınızdan emin olun.
11. Montajın uzun kenarlarının her birinden bir tıklama sesi duyulana kadar dikey olarak aşağı doğru itin.
12. Üst odaya 25-50 μL serumsuz ortam ekleyin.
13. Düzeneği doku kültürü inkübatöründeki çift amaçlı hücre analizörüne monte edin ve arka planı ölçmeden önce 30 dakika bekleyin.
    NOT: Bu süre diziyi dengelemek için gereklidir ve üst bölmeye eklenecek hücre çizgilerini hazırlamak için kullanılabilir.
14. Arka planı ölçün (bkz. bölüm 6) ve tertibatı tekrar doku kültürü başlığına yerleştirin.
15. Üst odanın her bir kuyucuğuna 100 μL serumsuz ortamda 30.000-50.000 hücre ekleyin. Bunlar, elektrotun membrandan başarıyla göç ettikten sonra tespit edeceği hücrelerdir.
    NOT: Maksimum yanıt elde etmek için, tahlil yapılmadan önce serumsuz veya düşük serum ortamında 6-18 saat boyunca hücrelerin büyütülmesi önerilir.
16. Empedans ölçümü için çift amaçlı hücre analizörüne monte etmeden önce tertibatı 30 dakika boyunca kaputta bekletin.

6. Arka plan ve empedans ölçümü

1. Diziyi çift amaçlı hücre analizörü cihazındaki beşiğe yerleştirin.
2. Hücre analizörü yazılımını açın ve kullanılacak beşiği seçin.
3. Mesaj sekmesine tıklayın ve dizinin yuvaya iyi yerleştirildiğinden ve elektrotların sensörlerle iyi hizalandığından emin olmak için Bağlantılar Tamam yazdığından emin olun.
4. Deneme Notları sekmesini tıklayın ve deneme hakkında mümkün olduğunca fazla bilgi doldurun.
5. Düzen sekmesine tıklayın ve dizi düzeninin açıklamasını doldurun.
6. Program sekmesine tıklayın ve Adımlar menüsünden iki adım ekleyin; bir arka plan adımı (bir süpürme) ve 100 süpürme ile bir test adımı - her 15 dakikada bir, toplam 25 saatlik bir süpürme.
7. Dizi, 30 dakika boyunca çift amaçlı hücre analizörü inkübatöründe kaldıktan sonra, arka plan ölçümünü başlatmak için Oynat düğmesine tıklayın. Verileri kaydetmek için klasörü seçmenizi isteyen bir pencere açılacaktır.
8. Arka plan ölçümü yapıldıktan sonra, diziyi beşikten çıkarın ve hücre kültürü başlığına geri yerleştirin.
9. Adım 5.13'te açıklandığı gibi üst odaya hücreler ekleyin ve hücrelerin yerleşmesi için tertibatı doku kültürü davlumbazında 30 dakika tutun.
10. Diziyi tekrar çift amaçlı hücre çözümleyicisine yerleştirin ve Bağlantılar Tamam iletisi için İleti sekmesini kontrol edin.
11. Empedans ölçümünü başlatmak için Oynat düğmesine tıklayın.
12. Sinyalin ilerlemesini izlemek için Grafik sekmesine tıklayın.
13. Uç noktaya 25 saatten önce ulaşılırsa, Yürüt açılır menüsünden İptal adımına tıklayın.
14. Verileri dışa aktarmak için grafiğe sağ tıklayın, liste biçiminde kopyala'yı seçin ve ardından verileri bir elektronik tabloya yapıştırın.
    NOT: Veriler hücre dizini veya delta hücre dizini olarak dışa aktarılabilir. Grafik ve/veya mizanpaj bilgileri dışa aktarma için de seçilebilir.

7. Ayrılma ve hücre toplama

1. İlgilenilen durma noktasını (6-18 saat) belirlemek için çift amaçlı hücre analizöründe geçiş oranını gerçek zamanlı olarak izleyin.
   NOT: Durma noktası, hücrenin istila hızına ve negatif kontrolden farklı bir istila sinyalinin ne zaman elde edildiğine bağlıdır.
2. Elde edildikten sonra, tertibatı çift amaçlı hücre analizöründen çıkarın ve doku kültürü davlumbazına yerleştirin.
3. Hücreleri ilgilenilen kuyulardan toplamak için uygun sayıda 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın.
4. Odalar ayrıldığında sıvı içermesi için tertibatı 10 cm'lik bir kaba yerleştirin.
5. Bir tıklama sesi duyulana kadar orta odanın uzun tarafındaki esnek yapışma uçlarını içeri doğru itin.
6. Üst odayı sökün ve 10 cm'lik yeni bir kaba çevirin.
7. Aynı deneysel durumu (yani hücre tipi, ilaç tedavisi, vb.) barındıran tüm kuyulardan hücreleri toplamak için 13 mm'lik bir bıçağa sahip bir hücre kaldırıcı kullanın.
   NOT: Negatif kontrollerden istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik elde etmek için kurulumu her deneysel koşul için en az iki kuyuya sahip olacak şekilde tasarlayın.
8. Hücreleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde toplamak için bıçağı 1x fosfat tamponlu salin içinde durulayın veya daldırın.
9. Hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'de döndürün.
10. Toplanan hücreleri çoğaltın (bakınız bölüm 8) veya tek hücreli RNA-seq gibi uç nokta analizi yapın.
    NOT: Toplu RNA-seq için, düşük hücre numaralı RNA ekstraksiyon kiti kullanın.

8.3D hücre yayılımı ve geri alımı

NOT: Toplanan az sayıda hücre nedeniyle, canlılığı artırmak için hücreleri hücre dışı bir matris (ECM) kullanarak 3B olarak tohumlayın. Bununla birlikte, 2D kültür de bu noktada bir seçenektir, özellikle de kullanılan hücreler yerleşik hücre hatlarından geliyorsa.

1. Bodrum membran matrisinin bir alikotunu gece boyunca 4 ° C'de çözün. Bodrum membran matrisini kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
2. Toplanan canlı hücrelerin peletine 25 μL soğuk bazal membran matrisi ekleyin ve karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipet çekin. Kabarcık oluşturmaktan kaçının.
3. Hücre-bazal membran matris karışımını küçük bir doku kültürü kuyusunun dibine (yani 96 delikli bir plakada) ekleyin, bir kubbe oluşturun. Kuyunun duvarlarına dokunmamaya çalışın. Damla yönünde hafifçe 100 μL ortam eklemeden önce 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
4. Hücreleri almak için, ortamı aspire edin ve her bir kuyucuğa 100 μL dispase ekleyin.
5. RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin, ara sıra yukarı ve aşağı pipetleyin.
6. Hücreleri ve çözünmüş bazal membran matrisini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 1 mL 1x PBS ekleyin, 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün ve süpernatanı çıkarın. Yıkamayı bir kez tekrarlayın.
7. Süper natantı aspire edin. Peletteki hücreleri bölün veya uç nokta analizi yapın.

Sonuçlar

Yeni tasarlanan üç odacıklı dizi kullanılarak, hücrelerin istilası, fibroblastlar gibi stromal hücrelerin varlığında veya yokluğunda test edildi. MDA-MB-231 hücre invazyonu, ışınlanmış İsviçre 3T3 fibroblastları (J2 suşu) alt odaya tohumlandığında artmış ve iki hücre hattı arasındaki faktörlerin değişimine izin vermiştir. İlginç bir şekilde, MDA-MB-231 invazyonu, 3T3-J2 hücrelerinin sayısı iki katına çıkarıldığında artmıştır (Şekil 3A). Öte...

Tartışmalar

Çift odacıklı bir dizinin tasarımını, stromal hücrelerin varlığında hücre invazyonunu gerçek zamanlı olarak izlemek için üçüncü bir oda içerecek şekilde değiştirdik. Ko-kültürlü fibroblastların invaziv ve non-invaziv kanser hücreleri üzerindeki farklı etkilerini gözlemledik, bu da dizinin ko-kültürlü stromal hücreler tarafından üretilen faktörlere farklı yanıt veren kanser hücresi alt popülasyonları arasında ayrım yapmak için kullanılabileceğini gösteriyor. Dizi ayrıca, de...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher	25300-054
Adhesive	Norland Optical Adhesive	NOA63
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A9418
Cell lifter	Sarstedt	83.1832
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Thermofisher	12585-014
CIM-plate	Agilent	5665817001	Cell analyzer plate
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130
Dispase	StemCell	7913
DMEM	Thermofisher	11995-065
DMEM-F12	Thermofisher	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
HEPES	Thermofisher	15630106
Horse serum (HS)	Gibco	16050-122
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)	LONZA (RRID:CVCL_2959)	C-2517A
HUVEC media	LONZA	CC-3162
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)	Thermofisher	51500056
Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution	Sigma	C8052
J2 Fibroblasts	Stemcell (RRID:CVCL_W667)	100-0353
LymphoPrep	Stemcell	7851	Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells
Matrigel	Corning	354230	Basement membrane matrix
MCFDCIS.com cells ( DCIS)	RRID:CVCL_5552
MDA-MB-231 cells	RRID:CVCL_0062
Milling machine			Bridgeport Series 1 Vertical
Phosphate-buffered saline (1x)	Thermofisher	10010049
Polyethersulfone (PES) membrane	Sterlitech	PCTF029030
RBC lysis solution	Stemcell	7800
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004
RTCA DP analyzer	Agilent	3X16	Dual purpose cell analyzer
Trypsin	Sigma	T4799