Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen

Zusammenfassung

Wir beschreiben einen Ansatz zum Nachweis und zur Erfassung invasiver Zellsubpopulationen in Echtzeit. Das experimentelle Design verwendet die Echtzeit-Zellanalyse, indem Änderungen in der elektrischen Impedanz von Zellen überwacht werden. Invasive Krebs-, Immun-, Endothel- oder Stromazellen in komplexen Geweben können eingefangen und die Auswirkungen von Kokulturen beurteilt werden.

Zusammenfassung

Invasion und metastasierende Ausbreitung von Krebszellen sind die Haupttodesursache durch Krebs. Assays, die früh entwickelt wurden, um das invasive Potenzial von Krebszellpopulationen zu messen, erzeugen typischerweise eine Einzelendpunktmessung, die nicht zwischen Krebszellsubpopulationen mit unterschiedlichem invasivem Potenzial unterscheidet. Außerdem besteht die Tumormikroumgebung aus verschiedenen residenten Stroma- und Immunzellen, die das invasive Verhalten von Krebszellen verändern und daran teilnehmen. Das Eindringen in Gewebe spielt auch eine Rolle bei Immunzellsubpopulationen, die Mikroorganismen abwehren oder erkrankte Zellen aus dem Parenchym und den Endothelzellen während des Gewebeumbaus und der Angiogenese eliminieren. Die Echtzeit-Zellanalyse (Real-Time Cellular Analysis, RTCA), die Impedanz-Biosensoren zur Überwachung der Zellinvasion verwendet, war ein wichtiger Schritt über die Endpunktmessung der Invasion hinaus: Sie ermöglicht kontinuierliche Messungen im Laufe der Zeit und kann somit Unterschiede in den Invasionsraten aufdecken, die im Endpunktassay verloren gehen. Mit der aktuellen RTCA-Technologie haben wir Zweikammer-Arrays erweitert, indem wir eine weitere Kammer hinzugefügt haben, die Stroma- und / oder Immunzellen enthalten kann und es ermöglicht, die Invasionsrate unter dem Einfluss von sezernierten Faktoren aus kokultivierten Stroma- oder Immunzellen im Laufe der Zeit zu messen. Darüber hinaus ermöglicht das einzigartige Design jederzeit das Ablösen von Kammern und die Isolierung der invasivsten Krebszelle oder anderer Zellsubpopulationen, die in heterogenen Mischungen von getesteten Tumorisolaten vorhanden sind. Diese invasivsten Krebszellen und andere Zellsubpopulationen treiben das maligne Fortschreiten zu metastasierenden Erkrankungen voran, und ihre molekularen Eigenschaften sind wichtig für eingehende mechanistische Studien, die Entwicklung diagnostischer Sonden für ihre Erkennung und die Bewertung von Schwachstellen. So kann die Einbeziehung von nieder- oder großmolekularen Medikamenten genutzt werden, um das Potenzial von Therapien zu testen, die auf Krebs und/oder Stromazellsubpopulationen abzielen, mit dem Ziel, invasives Verhalten zu hemmen (z. B. Krebszellen) oder zu verstärken (z. B. Immunzellen).

Einleitung

Die Zellinvasion ist ein wichtiger Prozess, der es Zellen ermöglicht, Basalmembranbarrieren als Reaktion auf Umwelthinweise von Stromazellen zu überwinden. Es ist ein entscheidender Schritt in mehreren Entwicklungsstadien für Immunantworten, Wundheilung, Gewebereparatur und Malignome, die von lokalen Läsionen zu invasiven und metastasierenden Krebsarten übergehen können¹. Assays, die früh entwickelt wurden, um das invasive Potenzial von Zellpopulationen zu messen, erzeugen typischerweise eine Einzelendpunktmessung oder erfordern eine Vormarkierung invasiver Zellen². Die Integration von Mikroelektronik- und Mikrofluidik-T....

Protokoll

Die Studie wurde vom Institutional Review Board der Georgetown University (IRB # 2002-022) überprüft und als "befreit" betrachtet. Frisch geerntetes Knochenmarkgewebe wurde aus entsorgten gesunden menschlichen Knochenmarksammelfiltern entnommen, die de-identifiziert worden waren.

1. Neues Kammerdesign (Abbildung 2)

1. Öffnen Sie eine neue Zweikammer-Zellanalysatorplatte. Stellen Sie die obere Kammer mit Elektroden beiseite.
2. Rasieren Sie mit einer Fräsmaschine 2 mm der U-förmigen Bodenvertiefungen der Zellanalysatorplatte ab.
3. Befestigen Sie eine 2 cm x....

Ergebnisse

Unter Verwendung des neu entwickelten Dreikammer-Arrays wurde die Invasion der Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Stromazellen wie Fibroblasten getestet. Die MDA-MB-231-Zellinvasion wurde verstärkt, als bestrahlte Schweizer 3T3-Fibroblasten (J2-Stamm) in der Bodenkammer ausgesät wurden, was den Austausch von Faktoren zwischen den beiden Zelllinien ermöglichte. Interessanterweise nahm die MDA-MB-231-Invasion zu, wenn die Anzahl der 3T3-J2-Zellen verdoppelt wurde (Abbildung 3A). Auf d.......

Diskussion

Wir haben das Design eines Zweikammer-Arrays modifiziert, um eine dritte Kammer zur Überwachung der Zellinvasion in Echtzeit in Gegenwart von Stromazellen aufzunehmen. Wir haben deutliche Auswirkungen von kokultivierten Fibroblasten auf invasive und nicht-invasive Krebszellen beobachtet, was darauf hindeutet, dass das Array verwendet werden kann, um zwischen Krebszellsubpopulationen zu unterscheiden, die unterschiedlich auf Faktoren reagieren, die von kokultivierten Stromazellen produziert werden. Das Array wurde auch v.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher	25300-054
Adhesive	Norland Optical Adhesive	NOA63
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A9418
Cell lifter	Sarstedt	83.1832
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Thermofisher	12585-014
CIM-plate	Agilent	5665817001	Cell analyzer plate
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130
Dispase	StemCell	7913
DMEM	Thermofisher	11995-065
DMEM-F12	Thermofisher	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
HEPES	Thermofisher	15630106
Horse serum (HS)	Gibco	16050-122
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)	LONZA (RRID:CVCL_2959)	C-2517A
HUVEC media	LONZA	CC-3162
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)	Thermofisher	51500056
Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution	Sigma	C8052
J2 Fibroblasts	Stemcell (RRID:CVCL_W667)	100-0353
LymphoPrep	Stemcell	7851	Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells
Matrigel	Corning	354230	Basement membrane matrix
MCFDCIS.com cells ( DCIS)	RRID:CVCL_5552
MDA-MB-231 cells	RRID:CVCL_0062
Milling machine			Bridgeport Series 1 Vertical
Phosphate-buffered saline (1x)	Thermofisher	10010049
Polyethersulfone (PES) membrane	Sterlitech	PCTF029030
RBC lysis solution	Stemcell	7800
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004
RTCA DP analyzer	Agilent	3X16	Dual purpose cell analyzer
Trypsin	Sigma	T4799