Rilevamento e acquisizione in tempo reale di sottopopolazioni cellulari invasive da co-colture

Riepilogo

Descriviamo un approccio per rilevare e catturare sottopopolazioni cellulari invasive in tempo reale. Il progetto sperimentale utilizza l'analisi cellulare in tempo reale monitorando i cambiamenti nell'impedenza elettrica delle cellule. Il cancro invasivo, le cellule immunitarie, endoteliali o stromali nei tessuti complessi possono essere catturati e l'impatto delle co-colture può essere valutato.

Abstract

L'invasione e la diffusione metastatica delle cellule tumorali sono la principale causa di morte per cancro. I saggi sviluppati precocemente per misurare il potenziale invasivo delle popolazioni di cellule tumorali in genere generano una singola misurazione dell'endpoint che non distingue tra sottopopolazioni di cellule tumorali con diverso potenziale invasivo. Inoltre, il microambiente tumorale è costituito da diverse cellule stromali e immunitarie residenti che alterano e partecipano al comportamento invasivo delle cellule tumorali. L'invasione nei tessuti svolge anche un ruolo nelle sottopopolazioni di cellule immunitarie respingendo i microrganismi o eliminando le cellule malate dal parenchima e dalle cellule endoteliali durante il rimodellamento dei tessuti e l'angiogenesi. L'analisi cellulare in tempo reale (RTCA) che utilizza biosensori di impedenza per monitorare l'invasione cellulare è stato un importante passo avanti oltre la misurazione dell'invasione degli endpoint: fornisce misurazioni continue nel tempo e quindi può rivelare differenze nei tassi di invasione che vengono persi nel test dell'endpoint. Utilizzando l'attuale tecnologia RTCA, abbiamo ampliato gli array a doppia camera aggiungendo un'ulteriore camera che può contenere cellule stromali e / o immunitarie e consente di misurare il tasso di invasione sotto l'influenza di fattori secreti da cellule stromali o immunitarie co-coltivate nel tempo. Oltre a questo, il design unico consente di staccare le camere in qualsiasi momento e isolare la cellula tumorale più invasiva o altre sottopopolazioni cellulari presenti in miscele eterogenee di isolati tumorali testati. Queste cellule tumorali più invasive e altre sottopopolazioni cellulari guidano la progressione maligna verso la malattia metastatica e le loro caratteristiche molecolari sono importanti per studi meccanicistici approfonditi, lo sviluppo di sonde diagnostiche per la loro individuazione e la valutazione delle vulnerabilità. Pertanto, l'inclusione di farmaci a piccole o grandi molecole può essere utilizzata per testare il potenziale delle terapie che colpiscono il cancro e / o le sottopopolazioni di cellule stromali con l'obiettivo di inibire (ad esempio, le cellule tumorali) o migliorare (ad esempio, le cellule immunitarie) il comportamento invasivo.

Introduzione

L'invasione cellulare è un processo importante che consente alle cellule di attraversare le barriere della membrana basale in risposta ai segnali ambientali forniti dalle cellule stromali. È un passo cruciale durante diverse fasi di sviluppo per le risposte immunitarie, la guarigione delle ferite, la riparazione dei tessuti e le neoplasie maligne che possono progredire dalle lesioni locali ai tumori invasivi e metastatici¹. I saggi sviluppati precocemente per misurare il potenziale invasivo delle popolazioni cellulari in genere generano una singola misurazione del punto finale o richiedono la pre-etichettatura delle cellule invasive². L'integrazione di tecniche di microelettronica e microfluidica è ora sviluppata per rilevare diversi aspetti della biologia cellulare come la vitalità, il movimento e l'attaccamento utilizzando l'impedenza elettrica delle cellule vive sui microelettrodi ^3,4. La misurazione dell'impedenza consente una valutazione senza etichette, non invasiva e quantitativa dello stato cellulare³. Qui descriviamo un array a tre camere basato sul progetto del sistema Real-Time Cellular Analysis (RTCA) sviluppato da Abassi et ^al.5. L'array a tre camere consente la valutazione di cellule co-coltivate sull'invasione cellulare e il recupero di cellule invasive per ulteriori analisi o espansioni.

Nel sistema di analisi cellulare, le cellule invadono attraverso una matrice extracellulare rivestita su una membrana porosa e raggiungono un array di elettrodi interdigitati posizionati sul lato opposto della barriera. Mentre le cellule invasive continuano ad attaccare e occupare questo array di elettrodi nel tempo, l'impedenza elettrica cambia in parallelo. Il sistema attuale comprende una piastra di invasione e migrazione cellulare (CIM) a 16 pozzetti con due camere. Lo strumento RTCA-DP (dual purpose) (chiamato d'ora in poi analizzatore di celle a doppio scopo) contiene sensori per la misurazione dell'impedenza e software integrato per analizzare ed elaborare i dati di impedenza. I valori di impedenza al basale dipendono dalla forza ionica dei mezzi nei pozzetti e vengono modificati quando le celle si attaccano agli elettrodi. I cambiamenti di impedenza dipendono dal numero di cellule, dalla loro morfologia e dalla misura in cui le cellule si attaccano agli elettrodi. Una misurazione dei pozzetti con i media prima che le celle vengano aggiunte è considerata come il segnale di fondo. Lo sfondo viene sottratto dalle misurazioni dell'impedenza dopo aver raggiunto l'equilibrio con le celle che si attaccano e si diffondono sugli elettrodi. Un parametro unitless dello stato delle celle su un elettrodo chiamato Cell Index (CI) è calcolato come segue: CI = (impedenza dopo l'equilibrio - impedenza in assenza di celle) / valore di impedenza nominale⁶. Quando vengono confrontati i tassi di migrazione di diverse linee cellulari, l'IC Delta può essere utilizzato per confrontare lo stato della cella indipendentemente dalla differenza di attaccamento rappresentata nelle prime misurazioni.

L'array a tre camere di nuova concezione si basa sul progetto esistente e utilizza la camera superiore del sistema di analisi delle celle a doppio scopo che contiene gli elettrodi. Le camere centrali e inferiori modificate sono adattate per adattare l'assemblaggio all'analizzatore di celle a doppio scopo per la misurazione e l'analisi dell'impedenza utilizzando il software integrato. I due principali progressi che il nuovo progetto fornisce rispetto alla piastra CIM a doppia camera esistente (chiamata piastra di analisi cellulare d'ora in poi) sono: i) la capacità di recuperare e quindi analizzare sottopopolazioni cellulari invasive presenti in miscele cellulari eterogenee e ii) l'opzione per valutare l'impatto dei fattori secreti da cellule stromali o immunitarie co-coltivate sull'invasione cellulare (Figura 1).

Questa tecnologia può essere utile nello studio delle sottopopolazioni di cellule con diverse capacità invasive. Ciò include (a) cellule tumorali invasive che invadono i tessuti circostanti o vasi sanguigni e linfatici o stravasano in siti di semina metastatica in organi distanti, (b) cellule del sistema immunitario che invadono i tessuti per affrontare agenti patogeni o cellule malate, (c) cellule endoteliali che invadono i tessuti per formare nuovi vasi sanguigni durante la riorganizzazione dei tessuti o la guarigione delle ferite, così come (d) le cellule stromali del microambiente tumorale che supportano e invadono insieme alle cellule tumorali. L'approccio consente l'inclusione di cross-talk stromali in grado di modulare la motilità e l'invasione cellulare. Gli studi di fattibilità mostrati qui utilizzano questo array modificato focalizzato sull'invasione delle cellule tumorali e sull'interazione con lo stroma come sistema modello, compresa l'invasione endoteliale in risposta a segnali differenziali dalle cellule tumorali. L'approccio può essere estrapolato per isolare le cellule tumorali e altri tipi di cellule come sottopopolazioni di cellule immunitarie, fibroblasti o cellule endoteliali. Abbiamo testato linee cellulari di cancro al seno stabilite invasive e non invasive come prova di principio. Abbiamo anche usato cellule dall'invasione di xenotrapianti derivati dal paziente (PDX) in risposta alle cellule immunitarie del midollo osseo umano per mostrare la fattibilità per un uso futuro anche in contesti diagnostici clinici. I PDX sono tessuti tumorali del paziente che vengono impiantati in un modello di topi immunocompromessi o umanizzati per consentire lo studio della crescita, della progressione e delle opzioni di trattamento per il paziente originale ^7,8.

Protocollo

Lo studio è stato esaminato e considerato "esente" dall'Institutional Review Board della Georgetown University (IRB # 2002-022). I tessuti del midollo osseo appena raccolti sono stati raccolti da filtri di raccolta del midollo osseo umano sano scartati che erano stati de-identificati.

1. Nuovo design della camera (Figura 2)

1. Aprire una nuova piastra di analisi cellulare a doppia camera. Mettere da parte la camera superiore con gli elettrodi.
2. Utilizzando una fresatrice, radere via 2 mm dei pozzetti inferiori a forma di U della piastra dell'analizzatore di celle.
3. Fissare una membrana di polietersolfone (PES) di 2 cm x 7 cm con pori di 0,2 μm sul fondo dei pozzetti rasati utilizzando un adesivo curato ai raggi UV. Lasciare 30 minuti di cura per garantire che la colla sia completamente indurita e inerte.
4. Utilizzando una fresatrice, ritagliare due fessure longitudinali (1,5 mm x 5,6 mm) lungo i lati per agganciarsi alle creste della terza camera appena fabbricata.
5. Utilizzando una fresatrice, creare una terza camera in policarbonato che replica gli ingombri della piastra dell'analizzatore di celle; 72 mm x 18 mm (Tabella dei materiali).
6. Creare pozzi di 4,8 mm di profondità e 4,75 mm di diametro per replicare il design a 16 pozzetti della piastra dell'analizzatore di celle. Ciò consente 90 μL di volume per pozzetto.
7. Sui lati, create due creste triangolari in modo che la camera si blocchi nelle fessure originali create nel passaggio 1.4. La parte orizzontale del triangolo è di 1,5 mm, la verticale è di 1,4 mm e l'ipotenusa è di 2,052 mm.
8. Create una manopola sul lato corto di 50,8 mm di diametro e 1,397 mm di altezza per adattarla alla tacca della piastra originale (Figura 2, al centro).
9. Utilizzare una rondella in gomma spessa 0,9 mm per ogni pozzo per fornire una vestibilità sigillata.

2. Coltura cellulare (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblasti)

1. Lavare colture cellulari aderenti (~ 70% di confluenza) con 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
2. Aggiungere la soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05% per rimuovere le cellule.
3. Neutralizzare la soluzione di tripsina con terreni di coltura cellulare contenenti siero e contare le cellule usando un'aliquota della sospensione cellulare.
   NOTA: i terreni di coltura cellulare specifici sono disponibili nella Tabella 1.

3. Dissociazione dello xenotrapianto derivata dal paziente

1. Tritare un pezzo di tumore fresco (1 cm²) in poltiglia fine usando un bisturi sterile.
2. Posto in un tubo conico da 50 mL con 20 mL di DMEM F12 media integrato con 3 mg/mL di tripsina e 2 mg/mL di collagenasi.
3. Incubare in uno shaker termico (150 RPM) a 37 °C per 20 min.
4. Ruotare il tubo a 500 x g per 5 minuti; rimuovere il surnatante.
5. Aggiungere 20 μL di DMEM F12 + 2% FBS per lavare le cellule; girare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Ripeti il lavaggio altre due volte.
6. Risospesare in 1 mL di supporti PDX (Tabella 1) per contare le cellule.

4. Estrazione delle cellule del midollo osseo

1. Lavare il filtro di raccolta del midollo osseo (BM) con 25 mL di 1x PBS.
   NOTA: In questo studio, PBS è stato aggiunto a un filtro di raccolta BM usato dall'ospedale per raccogliere il BM rimanente nel filtro.
2. Aggiungere lentamente il BM lavato a un tubo conico da 50 ml con 25 mL di gradiente di densità medio, avendo cura di mantenere gli strati il più separati possibile.
3. Rotazione a 800 x g per 20 minuti a 18 °C
4. Sifonare gli strati superiori dopo la centrifugazione (grasso/plasma) e trasferire 5 mL dello strato bianco sopra il mezzo gradiente di densità che ha le celle BM in un tubo conico da 15 mL.
   NOTA: in alternativa, immergere una pipetta da 5 ml nello strato superiore fino a quando non tocca lo strato intermedio (BM) e pipettare lo strato intermedio molto lentamente senza spostare la pipetta.
5. Riempire il tubo conico da 15 mL con 1x PBS (~10 mL) e ruotare a 300 x g per 15 min.
6. Rimuovere il surnatante; il restante pellet bianco è il BM.
7. Se nel pellet si osservano globuli rossi, aggiungere 5 ml di soluzione di lisi RBC (Tabella dei materiali) e lasciarla riposare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Girare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
8. Aggiungere 10 ml di 1x PBS per lavare le cellule, girare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Ripetere la lisi RBC (punto 4.7) fino a quando il pellet è bianco.

5. Semina e assemblaggio delle cellule

1. Posizionare tutte e tre le camere sterili nella cappa di coltura del tessuto.
2. Posizionare la manopola sul lato corto della camera inferiore. Orientare la camera inferiore in modo che la manopola sia rivolta verso lo sperimentatore.
3. Aggiungere 30.000-50.000 celle in 90 μL di fluido a ciascun pozzetto della camera inferiore. Evitare di formare bolle. Queste sono le cellule stromali che forniranno fattori secreti ma non saranno rilevati dagli elettrodi della camera superiore.
4. Utilizzare il 5% di mezzi integrati con siero bovino fetale in due pozzetti a camera inferiore come controllo positivo per la motilità cellulare. Utilizzare 0% di media integrati con siero come controllo negativo.
5. Lasciare riposare la camera inferiore con le celle per 10-15 minuti nel cappuccio.
   NOTA: questo passaggio è consigliato se le cellule sono aderenti o crescono in sospensione.
6. Ruotare la camera inferiore a 90° e posizionare la camera centrale in alto in modo che la manopola sulla camera inferiore scorra nella tacca sulla camera centrale.
   NOTA: la manopola sulla camera inferiore e il punto blu sulla camera centrale si trovano alle estremità opposte dell'assieme.
7. Spingere verticalmente verso il basso fino a quando non si sente un suono di clic da ciascuno dei lati lunghi dell'assieme.
8. Aggiungere 160 μL di fluidi privi di siero a tutti i pozzetti della camera centrale.
9. Assicurati che un menisco a forma di cupola sia visibile dopo che i pozzetti sono stati riempiti; in caso contrario, regolare il volume finale in base alla calibrazione della pipetta. Evitare di formare bolle.
10. Posizionare la camera superiore con gli elettrodi rivolti verso il basso sulla camera centrale assicurandosi di allineare i punti blu sulle camere centrale e superiore.
11. Spingere verticalmente verso il basso fino a quando non si sente un suono di clic da ciascuno dei lati lunghi dell'assieme.
12. Aggiungere 25-50 μL di fluidi privi di siero alla camera superiore.
13. Montare il gruppo sull'analizzatore cellulare a doppio scopo nell'incubatore di colture tissutali e attendere 30 minuti prima di misurare lo sfondo.
    NOTA: questo tempo è necessario per equilibrare l'array e può essere utilizzato per preparare le linee cellulari da aggiungere alla camera superiore.
14. Misurare lo sfondo (vedere paragrafo 6) e riposizionare l'assemblaggio nella cappa di coltura del tessuto.
15. Aggiungere 30.000-50.000 cellule in 100 μL di mezzi privi di siero a ciascun pozzetto della camera superiore. Queste sono le cellule che l'elettrodo rileverà una volta che migrano con successo attraverso la membrana.
    NOTA: Per ottenere la massima risposta, si raccomanda di far crescere le cellule in mezzi sierici privi di siero o a basso siero per 6-18 ore prima di eseguire il test.
16. Lasciare riposare il gruppo nella cappa per 30 minuti prima di montarlo sull'analizzatore di celle a doppio scopo per la misurazione dell'impedenza.

6. Misurazione dello sfondo e dell'impedenza

1. Posizionare l'array nella base nello strumento di analisi cellulare a doppio scopo.
2. Aprire il software dell'analizzatore di celle e selezionare la base da utilizzare.
3. Fare clic sulla scheda Messaggio e assicurarsi che sia indicato Connessioni OK per garantire che l'array sia ben posizionato nella base e che gli elettrodi siano ben allineati con i sensori.
4. Fai clic sulla scheda Note dell'esperimento e inserisci quante più informazioni possibili sull'esperimento.
5. Fare clic sulla scheda Layout e compilare la descrizione del layout dell'array.
6. Fare clic sulla scheda Pianificazione e aggiungere due passaggi dal menu Passaggi ; una fase di sfondo (una sweep) e una fase di test con 100 sweep, una sweep ogni 15 minuti, per un totale di 25 ore.
7. Dopo che l'array è stato nell'incubatore dell'analizzatore di celle a doppio scopo per 30 minuti, fare clic sul pulsante Riproduci per avviare la misurazione in background. Apparirà una finestra che chiede di scegliere la cartella in cui salvare i dati.
8. Al termine della misurazione in background, rimuovere l'array dalla culla e riposizionarlo nella cappa di coltura cellulare.
9. Aggiungere le cellule alla camera superiore come descritto nel passaggio 5.13 e mantenere l'assemblaggio nella cappa di coltura del tessuto per 30 minuti affinché le cellule si depositino.
10. Riposizionare l'array nell'analizzatore di celle a doppio scopo e selezionare la scheda Messaggio per il messaggio Connessioni OK .
11. Fare clic sul pulsante Riproduci per avviare la misurazione dell'impedenza.
12. Fare clic sulla scheda Plot per monitorare l'avanzamento del segnale.
13. Se l'endpoint viene raggiunto prima delle 25 ore, fare clic sul passaggio Interrompi dal menu a discesa Esegui .
14. Per esportare i dati, fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico, scegliere Copia nel formato elenco e quindi incollare i dati in un foglio di calcolo.
    NOTA: i dati possono essere esportati come indice di cella o indice di cella delta. Le informazioni sul grafico e/o sul layout possono anche essere scelte per l'esportazione.

7. Distacco e raccolta cellulare

1. Monitorare il tasso di migrazione in tempo reale sull'analizzatore di celle a doppio scopo per determinare il punto di interesse di arresto (6-18 ore).
   NOTA: Il punto di arresto dipende dal tasso di invasione della cellula e quando si ottiene un segnale di invasione distinto dal controllo negativo.
2. Una volta raggiunto, smontare l'assemblaggio dall'analizzatore cellulare a doppio scopo e posizionarlo nella cappa di coltura del tessuto.
3. Preparare un numero appropriato di tubi microcentrifuga da 1,5 ml per raccogliere le cellule dai pozzetti di interesse.
4. Posizionare l'assemblaggio in un piatto di 10 cm per contenere liquidi quando le camere si staccano.
5. Spingere le estremità di scatto flessibili sul lato lungo della camera centrale verso l'interno fino a quando non si sente un suono di clic.
6. Smontare la camera superiore e capovolgerla in un nuovo piatto da 10 cm.
7. Utilizzare un sollevatore di cellule con una lama di 13 mm per raccogliere le cellule da tutti i pozzi che ospitano la stessa condizione sperimentale (ad esempio, tipo di cellula, trattamento farmacologico, ecc.).
   NOTA: progettare la configurazione in modo che disponga di almeno due pozzetti per ogni condizione sperimentale per ottenere cambiamenti statisticamente significativi rispetto ai controlli negativi.
8. Risciacquare o immergere la lama in 1x soluzione salina tamponata con fosfato per raccogliere le cellule in tubi microcentrifuga da 1,5 ml.
9. Abbassare le celle a 500 x g per 5 minuti.
10. Propagare le cellule raccolte (vedere paragrafo 8) o eseguire analisi end point come RNA-seq a singola cellula.
    NOTA: per l'RNA-seq di massa, utilizzare un kit di estrazione dell'RNA a basso numero di cellule.

8.3D propagazione e recupero delle cellule

NOTA: A causa del piccolo numero di cellule raccolte, seminare le cellule in 3D utilizzando una matrice extracellulare (ECM) per migliorare la vitalità. Detto questo, la coltura 2D è anche un'opzione a questo punto, specialmente se le cellule utilizzate provengono da linee cellulari stabilite.

1. Scongelare un'aliquota della matrice della membrana basale a 4 °C durante la notte. Mantenere la matrice della membrana basale su ghiaccio fino al momento dell'uso.
2. Aggiungere 25 μL di matrice di membrana basale fredda al pellet di cellule vive raccolte e pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Evitare di formare bolle.
3. Aggiungere la miscela di matrice di membrana cellula-basamento sul fondo di un piccolo pozzo di coltura tissutale (cioè in una piastra a 96 pozzetti), formando una cupola. Cerca di non toccare le pareti del pozzo. Incubare a 37 °C per 20 minuti prima di aggiungere delicatamente 100 μL di fluido a goccia.
4. Per recuperare le cellule, aspirare il mezzo e aggiungere 100 μL di dispase a ciascun pozzetto.
5. Incubare a RT per 10 minuti, pipettare su e giù di tanto in tanto.
6. Trasferire le cellule e la matrice della membrana basale disciolta in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere 1 mL di 1x PBS, ruotare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Ripetere il lavaggio una volta.
7. Aspirare il surnatante. Dividere le celle nel pellet o eseguire l'analisi degli endpoint.

Risultati

Utilizzando l'array a tre camere di nuova concezione, l'invasione delle cellule è stata testata in presenza o assenza di cellule stromali come i fibroblasti. L'invasione cellulare MDA-MB-231 è stata potenziata quando i fibroblasti svizzeri 3T3 irradiati (ceppo J2) sono stati seminati nella camera inferiore, consentendo lo scambio di fattori tra le due linee cellulari. È interessante notare che l'invasione MDA-MB-231 è aumentata quando le cellule 3T3-J2 sono state raddoppiate in numero (Figura 3A<...

Discussione

Abbiamo modificato il design di un array a doppia camera per includere una terza camera per il monitoraggio dell'invasione cellulare in tempo reale in presenza di cellule stromali. Abbiamo osservato effetti distinti dei fibroblasti co-coltivati su cellule tumorali invasive e non invasive, indicando che l'array può essere utilizzato per distinguere tra sottopopolazioni di cellule tumorali che rispondono in modo diverso ai fattori prodotti da cellule stromali co-coltivate. L'array è stato utilizzato anche per monitorare ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher	25300-054
Adhesive	Norland Optical Adhesive	NOA63
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A9418
Cell lifter	Sarstedt	83.1832
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Thermofisher	12585-014
CIM-plate	Agilent	5665817001	Cell analyzer plate
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130
Dispase	StemCell	7913
DMEM	Thermofisher	11995-065
DMEM-F12	Thermofisher	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
HEPES	Thermofisher	15630106
Horse serum (HS)	Gibco	16050-122
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)	LONZA (RRID:CVCL_2959)	C-2517A
HUVEC media	LONZA	CC-3162
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)	Thermofisher	51500056
Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution	Sigma	C8052
J2 Fibroblasts	Stemcell (RRID:CVCL_W667)	100-0353
LymphoPrep	Stemcell	7851	Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells
Matrigel	Corning	354230	Basement membrane matrix
MCFDCIS.com cells ( DCIS)	RRID:CVCL_5552
MDA-MB-231 cells	RRID:CVCL_0062
Milling machine			Bridgeport Series 1 Vertical
Phosphate-buffered saline (1x)	Thermofisher	10010049
Polyethersulfone (PES) membrane	Sterlitech	PCTF029030
RBC lysis solution	Stemcell	7800
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004
RTCA DP analyzer	Agilent	3X16	Dual purpose cell analyzer
Trypsin	Sigma	T4799