Escherichia coli'nin Sürekli Akış-PCR Mikroakışkan Çipinde Amplifikasyonu ve Kapiler Elektroforez Sistemi ile Tespiti

Özet

Bu protokol, bir mikroakışkan çipe dayalı bir sürekli akışlı polimeraz zincir sisteminin nasıl oluşturulacağını ve laboratuvarda bir kapiler elektroforez sisteminin nasıl oluşturulacağını açıklar. Laboratuvarda nükleik asitlerin analizi için basit bir yöntem sunar.

Özet

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), biyomoleküler tanıda önemli bir rol oynayan bir hedef genin amplifikasyonu için kullanılan geleneksel bir yöntemdir. Bununla birlikte, geleneksel PCR, düşük sıcaklık varyasyon verimliliği nedeniyle çok zaman alıcıdır. Bu çalışma, mikroakışkan bir çipe dayalı bir sürekli akış-PCR (CF-PCR) sistemi önermektedir. Amplifikasyon süresi, PCR solüsyonunun farklı sıcaklıklara ayarlanmış ısıtıcılara yerleştirilen bir mikro kanala çalıştırılmasıyla büyük ölçüde azaltılabilir. Ayrıca, kapiler elektroforez (CE), pozitif ve yanlış pozitif PCR ürünlerini ayırt etmenin ideal bir yolu olduğundan, DNA fragmanlarının verimli bir şekilde ayrılmasını sağlamak için bir CE sistemi inşa edilmiştir. Bu makale, Escherichia coli'nin (E. coli) şirket içinde oluşturulan CF-PCR sistemi ile amplifikasyon sürecini ve PCR ürünlerinin CE ile tespitini açıklamaktadır. Sonuçlar, E. coli'nin hedef geninin 10 dakika içinde başarılı bir şekilde amplifiye edildiğini göstermektedir, bu da bu iki sistemin nükleik asitlerin hızlı amplifikasyonu ve tespiti için kullanılabileceğini göstermektedir.

Giriş

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), spesifik DNA fragmanlarını çoğaltmak için kullanılan bir moleküler biyoloji tekniğidir, böylece eser miktarda DNA'yı yüz milyonlarca kez çoğaltır. Klinik tanı, tıbbi araştırma, gıda güvenliği, adli kimlik tespiti ve diğer alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. PCR işlemi temel olarak üç adımdan oluşur: 90-95 °C'de denatürasyon, 50-60 °C'de tavlama ve 72-77 °C'de uzatma. Termal döngü, PCR sürecinin önemli bir parçasıdır; bununla birlikte, geleneksel PCR termal döngüleyici yalnızca hantal değil, aynı zamanda verimsizdir ve 25 döngüyü tamamlamak için yaklaşık 40 dakika gerektirir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, şirket içinde mikroakışkan bir çipe dayalı sürekli akışlı bir PCR (CF-PCR) sistemi kuruldu. CF-PCR, PCR solüsyonunu farklı sıcaklıklarda^{ısıtıcılara yerleştirilen mikro kanallara sürerek zamandan büyük} ölçüde tasarruf sağlayabilir 1,2,3,4,5.

Kapiler elektroforez (CE), yüksek çözünürlük, yüksek hız ve mükemmel tekrarlanabilirlik 6,7,8,9,10,11 gibi birçok avantaja sahip olduğundan, laboratuvarda nükleik asitlerin ve proteinlerin analizi için popüler bir araç haline gelmiştir. Bununla birlikte, çoğu laboratuvar, özellikle gelişmekte olan dünyadaki laboratuvarlar, CE cihazının yüksek fiyatı nedeniyle bu teknolojiyi karşılayamaz. Burada, CF-PCR mikroakışkan çipinin nasıl üretileceğine ve laboratuvarda çok yönlü bir CE sisteminin nasıl oluşturulacağına ilişkin protokolleri özetledik. Ayrıca, bu CF-PCR sistemi ile E. coli'nin amplifikasyon sürecini ve PCR ürünlerinin CE sistemi tarafından tespit edilmesini de gösteriyoruz. Bu protokolde açıklanan prosedürleri izleyerek, kullanıcılar mikroakışkan çipler üretebilmeli, PCR çözeltileri hazırlayabilmeli, nükleik asit amplifikasyonu için bir CF-PCR sistemi oluşturabilmeli ve DNA parçalarını ayırmak için sınırlı kaynaklarla bile basit bir CE sistemi kurabilmelidir.

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. CF-PCR mikroakışkan çipinin üretimi

1. Nemi gidermek için silikon gofreti 200 °C'de 25 dakika ısıtın.
2. Gofretin inç başına 1 mL SU-8-2075 fotorezist dağıtın. 100 rpm/s ivme ile 5-10 s boyunca 500 rpm'de ve ardından 500 rpm/s hızlanma ile 30 s boyunca 2.000 rpm'de bir spin kaplayıcı kullanarak silikon gofret üzerinde döndürün.
3. Silikon gofreti 65 °C'de 3 dakika, ardından 95 °C'de 15 dakika pişirin.
4. Fotolitografi makinesi için pozlama enerjisi olarak 150 - 215 mJ/cm² ayarlayın ve tasarlanan deseni bir fotolitografi maskesi ile fotorezist üzerine kazıyın. Silikon gofreti ve maskeyi pozlamaya hazır hale getirin.
5. Maruz kaldıktan sonra, silikon gofreti 65 °C'de 2 dakika ve ardından 95 °C'de 7 dakika pişirin.
6. Fazla fotorezisti çıkarmak için silikon gofreti geliştirici solüsyonuna daldırın ve mikrokanallar görülebildiğinde çıkarın (Şekil 1). Artık geliştirici solüsyonunu durulamak için izopropanol kullanın.
7. Polidimetilsiloksan (PDMS) prepolimerini ve sertleştirici maddeyi 10:1 oranında karıştırın. Karışık PDMS çözeltisini replika kalıba dökün ve 80 °C'de 60 dakika katılaştırın.
8. Bir plazma temizleyici kullanarak aktivasyondan sonra PDMS mikroakışkan çipini bir slayt üzerine yapıştırın ve mümkün olan en kısa sürede 80 ° C'de 30 dakika katılaştırın (Şekil 2).
   NOT: Çipin dış boyutları 80.0 mm × 30.0 mm × 0.4 mm'dir. Mikroakışkan çipte 40 adet serpantin kanalı (100 μm × 1.46 mm × 100 μm, genişlik × uzunluk × derinlik) bulunmaktadır.

2. PCR çözeltisinin hazırlanması

1. Yapılandırmadan önce reaktifleri tamamen çözün. Reaktiflerin iyice karıştığından emin olmak için bir vorteks karıştırıcı ve santrifüj kullanın.
2. Aşağıdaki bileşenleri bu sırayla ekleyerek bir santrifüj tüpü hazırlayın: 33.75 μL su, 1.0 μL DNA şablonu, 0.5 μL primer, 5.0 μL tampon, 4.0 μL dNTP karışımı, 1.5 μL Tween 20, 3.5 μL PVP ve son olarak 0.25 μL DNA polimeraz.
   NOT: Burada kullanılan DNA şablonu E. coli'dir. E. coli için primerler ve PCR çözeltisinin bileşenleri sırasıyla Tablo 1 ve Tablo 2'de listelenmiştir.
3. Çözeltiyi girdap yaparak karıştırın.

3. CF-PCR sisteminin yapısı

1. İki pozitif sıcaklık katsayısı (PTC) seramik ısıtıcı, iki katı hal rölesi, iki PID sıcaklık kontrol cihazı, iki sıcaklık sensörü ve bir güç kablosu hazırlayın.
   NOT: PTC seramik ısıtıcıların boyutu, mikroakışkan çipin boyutuna bağlıdır; uzunluk çip uzunluğundan büyük olmalıdır - burada kullanılan PTC seramik ısıtıcıların uzunluk-genişlik-yüksekliği 10 cm x 2 cm x 0,4 cm'dir.
2. Isıtıcıyı yarıiletken röleye bağlayın.
3. Katı hal rölesini PID sıcaklık kontrol cihazına bağlayın.
4. Sıcaklık sensörü probunu iki ısıtıcının altına takın ve terminali PID sıcaklık kontrol cihazına bağlayın.
5. İki katı hal rölesini seri olarak bağlayın ve güç kablosunu bağlayın.
6. 3D iki ısıtıcı için bir yuva yazdırın ve ısıtıcıları aynı düzlemde tutun (3D baskı için gereken STL dosyaları için Ek Dosya 1'e bakın).
   NOT: İki ısıtıcı arasında 12 mm hava boşluğu bırakın.
7. Mikroakışkan çipi iki ısıtıcının üzerine yerleştirin.
8. Bir şırınga pompası ve bir şırınga hazırlayın, şırıngayı şırınga pompasına sabitleyin, bir şırınga ile bir silikon boru (0.8 mm iç çap [ID]) bağlayın ve silikon borunun üstüne bir çelik iğne (0.7 mm ID) bağlayın (Şekil 3).
9. Çelik iğneyi mikroakışkan çipin girişine yerleştirin.
10. PCR ürünlerini toplamak için çipin çıkışına bir pipet ucu yerleştirin.

4. CE sisteminin inşası

1. Darbeli alanlı bir elektrik alanı oluşturmak için yüksek voltajlı bir güç kaynağı kullanın; Pozitif ve negatif elektrotlara dikkat edin.
2. Işık kaynağı olarak bir cıva lambası kullanın ve cıva lambasından gelen uyarma dalga boyunu bir filtreden geçirin.
3. Kılcal damarı mikroskop tablasına yerleştirin.
4. Floresan emisyonunu objektifle toplayın ve ardından bir R928 fotoçoğaltıcı tüp (PMT) kullanarak tespit edin. Mikroskobu ve kılcal damarı gözlemleyin. Karanlık oda koşullarında ışığı açın; Uyarma ışığı objektif tarafından toplanır.
5. Güç kaynağını kontrol etmek ve veri toplamayı tamamlamak için kendi geliştirdiği LABVIEW yazılımını kullanın (6.3-6.6 adımlarında açıklanmıştır). https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi bakın.
   NOT: Tüm deneyler karanlık bir odada gerçekleştirilmiştir ve CE sisteminin şeması Şekil 4'te gösterilmiştir.

5. PCR çözümünü çalıştırın

1. CF-PCR sisteminin ısıtıcılarının sıcaklığını 65 °C ve 95 °C'de önceden ayarlayın.
2. Mikroakışkan çipi iki ısıtma bloğuna yerleştirin.
3. Silikon tüpün ucunu 50 μL PCR solüsyonu içeren bir santrifüj tüpüne yerleştirin (adım 2.3'ten itibaren). Çözeltiyi yavaşça çekmek için şırınga pistonunu çekin. Şırıngayı bir şırınga pompasına sabitleyin. Çelik iğneyi mikroakışkan çipin girişine yerleştirin.
4. Pompanın akış hızını 10 μL/dk'ya ayarlayın ve çözeltiyi mikroçipin girişindeki mikrokanala itmek için başlat düğmesine basın.
5. PCR ürünlerini mikroakışkan çipin çıkışında toplayın.
   NOT: Kirleri gidermek için PCR'den önce ve sonra kanalı ultra saf suyla durulayın.

6. PCR ürünlerinin şirket içinde oluşturulan bu CE sistemi ile tespiti

1. Toplam uzunluğu 8 cm ve etkili uzunluğu 6 cm olan bir kılcal damar hazırlayın.
2. 100 μL %1 hidroksietilselüloz (HEC, a/h), 2 μL 100x SYBR Green I ve 98 μL ultra saf suyu karıştırarak 1x SYBR Green I içeren %0,5 HEC (a/h) elde ederek ayırma tamponunu hazırlayın.
3. Kılcal damarı bir vakum pompası kullanarak hazırlanan ayırma tamponu ile doldurun.
4. Yazılım arayüzünde enjeksiyon voltajını (800 V) ve enjeksiyon süresini (2.0 s) girin, başlat düğmesine tıklayın ve PCR ürünlerinin 100 V/cm'de (2.0 s) elektrodinamik olarak kılcal damara verilmesini bekleyin.
   NOT: Bu adımda, PCR ürünleri negatif elektrot üzerine yerleştirilir ve tampon pozitif elektrot üzerine yerleştirilir.
5. Yazılım arayüzüne DC voltajını (800 V) girin, başlat düğmesine tıklayın ve elektroforezi 100 V/cm elektrik alan gücünde çalıştırın.
   NOT: Bu adımda, hem pozitif hem de negatif elektrotlar tampon ile yerleştirilir.
6. Tüm DNA parçaları kılcal damarda ayrıldıktan sonra durdur düğmesine tıklayın.
7. Her çalıştırmadan sonra kılcal damarı 1 dakika sterilize suyla yıkayın.

Sonuçlar

Şekil 5, PCR ürünlerinin elektroferogramını ve DNA belirteçlerini temsil etmektedir. İz (Şekil 5A), CF-PCR ile çoğaltılmış ürünün CE sonucudur, iz (Şekil 5B), termal döngü ile çoğaltılan ürünün CE sonucudur ve iz (Şekil 5C), 100 bp DNA merdiveninin CE sonucudur. İlk olarak CF-PCR sisteminde E. coli'nin hedef genini çoğalttık; PCR çözeltisi, çipin girişinden ç?...

Tartışmalar

Hem PCR hem de CE, nükleik asitlerin analizinde iki popüler biyoteknolojidir. Bu makale, her ikisi de şirket içinde yerleşik olan CF-PCR ve CE sistemleri kullanılarak E. coli'nin amplifikasyonunu ve PCR ürünlerinin tespitini açıklamaktadır. E. coli'nin hedef geni, yüksek ısı transfer hızları nedeniyle 10 dakika içinde başarılı bir şekilde amplifiye edildi. 1.500 bp'den küçük DNA parçaları 8 dakika içinde ayrıldı (Şekil 5). Bu iki tekniğin en b...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp DNA ladder	Takara Bio Inc.	3422A
10x Fast Buffer I	Takara Bio Inc.	RR070A
10x TBE	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T1051
developer solution	Alfa Aesar, USA	L15459
dNTP mixture (2.5 μM)	Takara Bio Inc.	RR070A
EC-F	Sangon Biotech, Shanghai, China
EC-R	Sangon Biotech, Shanghai, China
HEC,1300K	Sigma-Aldrich, USA	9004-62-0
isopropanol	Aladdin, Shanghai, China	67-63-0
microscope	Olympus, Japan	BX51
photolithography	SUSS MicroTec, Germany	MJB4
photomultiplier tube	Hamamatsu Photonics, Japan	R928
photoresist	MicroChem, USA	SU-8 2075
PID temperature controllers	Shanghai, China	XH-W2023
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G-2
polyvinyl pyrrolidone (PVP)	Aladdin, Shanghai, China	P110608
pump	Harvard Apparatus	PHD2000
silicone tubing	BIO-RAD,USA	7318210
solid-state relays	KZLTD, China	KS1-25LA
SpeedSTAR HS DNA Polymerase	Takara Bio Inc.	RR070A
steel needle	zhongxinqiheng,Suzhou,China
SYBR GREEN	Solarbio, Beijing, China	SY1020
temperature sensors	EasyShining Technology, Chengdu, China	TCM-M207
Template (E. coli)	Takara Bio Inc.	AK601
Tween 20	Aladdin, Shanghai, China	T104863
voltage power supply	Medina, NY, USA	TREK MODEL 610E