Amplificazione di Escherichia coli in un chip microfluidico PCR a flusso continuo e sua rilevazione con un sistema di elettroforesi capillare

Riepilogo

Questo protocollo descrive come costruire un sistema a catena di polimerasi a flusso continuo basato su un chip microfluidico e come costruire un sistema di elettroforesi capillare in laboratorio. Presenta un metodo semplice per l'analisi degli acidi nucleici in laboratorio.

Abstract

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo tradizionale impiegato per l'amplificazione di un gene bersaglio che ha svolto un ruolo importante nella diagnostica biomolecolare. Tuttavia, la PCR tradizionale richiede molto tempo a causa dell'efficienza di variazione della bassa temperatura. Questo lavoro propone un sistema di PCR a flusso continuo (CF-PCR) basato su un chip microfluidico. Il tempo di amplificazione può essere notevolmente ridotto facendo scorrere la soluzione PCR in un microcanale posto su riscaldatori impostati a temperature diverse. Inoltre, poiché l'elettroforesi capillare (CE) è un modo ideale per differenziare i prodotti PCR positivi da quelli falsi positivi, è stato costruito un sistema CE per ottenere una separazione efficiente dei frammenti di DNA. Questo documento descrive il processo di amplificazione di Escherichia coli (E. coli) da parte del sistema CF-PCR costruito internamente e la rilevazione dei prodotti PCR da parte di CE. I risultati dimostrano che il gene bersaglio di E. coli è stato amplificato con successo entro 10 minuti, indicando che questi due sistemi possono essere utilizzati per la rapida amplificazione e rilevamento degli acidi nucleici.

Introduzione

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare specifici frammenti di DNA, amplificando così tracce di DNA centinaia di milioni di volte. È stato ampiamente utilizzato nella diagnosi clinica, nella ricerca medica, nella sicurezza alimentare, nell'identificazione forense e in altri campi. Il processo di PCR consiste principalmente in tre fasi: denaturazione a 90-95 °C, ricottura a 50-60 °C ed estensione a 72-77 °C. Il ciclo termico è una parte importante del processo di PCR; tuttavia, il termociclatore PCR tradizionale non è solo ingombrante ma anche inefficiente, richiedendo circa 40 minuti per completare 25 cicli. Per superare queste limitazioni, è stato costruito internamente un sistema di PCR a flusso continuo (CF-PCR), basato su un chip microfluidico. La CF-PCR può far risparmiare molto tempo guidando la soluzione PCR in microcanali posti su riscaldatori a diverse temperature 1,2,3,4,5.

Poiché l'elettroforesi capillare (CE) presenta molti vantaggi, come l'alta risoluzione, l'alta velocità e l'eccellente riproducibilità 6,7,8,9,10,11^, è diventata uno strumento popolare in laboratorio per l'analisi di acidi nucleici e proteine. Tuttavia, la maggior parte dei laboratori, in particolare i laboratori nei paesi in via di sviluppo, non possono permettersi questa tecnologia a causa del prezzo elevato dello strumento CE. In questo articolo, abbiamo delineato i protocolli su come fabbricare il chip microfluidico CF-PCR e su come costruire un sistema CE versatile in laboratorio. Dimostriamo anche il processo di amplificazione di E. coli da parte di questo sistema CF-PCR e la rilevazione dei prodotti PCR da parte del sistema CE. Seguendo le procedure descritte in questo protocollo, gli utenti dovrebbero essere in grado di fabbricare chip microfluidici, preparare soluzioni PCR, costruire un sistema CF-PCR per l'amplificazione degli acidi nucleici e impostare un semplice sistema CE, anche con risorse limitate, per separare i frammenti di DNA.

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Protocollo

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzati in questo protocollo.

1. Fabbricazione del chip microfluidico CF-PCR

1. Riscaldare il wafer di silicio a 200 °C per 25 minuti per rimuovere l'umidità.
2. Erogare 1 mL di fotoresist SU-8-2075 per pollice del wafer. Centrifugarlo sul wafer di silicio utilizzando uno spin coater a 500 giri/min per 5-10 s con un'accelerazione di 100 giri/min, e poi a 2.000 giri/min per 30 s con un'accelerazione di 500 giri/min/s.
3. Cuocere il wafer di silicio a 65 °C per 3 minuti, poi a 95 °C per 15 minuti.
4. Impostare 150 - 215 mJ/cm² come energia di esposizione per la macchina fotolitografica e incidere il modello progettato sul fotoresist con una maschera per fotolitografia. Posizionare il wafer di silicio e la maschera pronti per l'esposizione.
5. Dopo l'esposizione, cuocere il wafer di silicio a 65 °C per 2 minuti e poi a 95 °C per 7 minuti.
6. Immergere il wafer di silicio nella soluzione di sviluppo per rimuovere il fotoresist in eccesso ed estrarlo quando i microcanali sono visibili (Figura 1). Utilizzare l'isopropanolo per risciacquare la soluzione di rivelatore residua.
7. Miscelare il prepolimero di polidimetilsilossano (PDMS) e l'agente indurente in un rapporto di 10:1. Versare la soluzione PDMS miscelata nello stampo replica e solidificarla a 80 °C per 60 min.
8. Incollare il chip microfluidico PDMS su un vetrino dopo l'attivazione utilizzando un pulitore al plasma e solidificarlo a 80 °C per 30 minuti il prima possibile (Figura 2).
   NOTA: Le dimensioni esterne del chip sono 80,0 mm × 30,0 mm × 0,4 mm. Nel chip microfluidico sono presenti 40 canali a serpentina (100 μm × 1,46 mm × 100 μm, larghezza × lunghezza × profondità).

2. Preparazione della soluzione PCR

1. Scongelare completamente i reagenti prima della configurazione. Utilizzare un miscelatore a vortice e una centrifuga per assicurarsi che i reagenti siano ben miscelati.
2. Preparare una provetta da centrifuga, aggiungendo i seguenti componenti in questo ordine: 33,75 μL di acqua, 1,0 μL di DNA stampo, 0,5 μL di primer, 5,0 μL di tampone, 4,0 μL di miscela dNTP, 1,5 μL di Tween 20, 3,5 μL di PVP e infine 0,25 μL di DNA polimerasi.
   NOTA: In questo caso, il modello di DNA utilizzato è E. coli. I primer per E. coli e i componenti della soluzione PCR sono elencati rispettivamente nella Tabella 1 e nella Tabella 2.
3. Mescolare la soluzione mediante vortice.

3. Costruzione del sistema CF-PCR

1. Preparare due riscaldatori ceramici a coefficiente di temperatura positivo (PTC), due relè a stato solido, due regolatori di temperatura PID, due sensori di temperatura e un cavo di alimentazione.
   NOTA: La dimensione dei riscaldatori ceramici PTC dipende dalla dimensione del chip microfluidico; la lunghezza dovrebbe essere maggiore della lunghezza del chip: la lunghezza-larghezza-altezza dei riscaldatori ceramici PTC utilizzati qui è di 10 cm x 2 cm x 0,4 cm.
2. Collegare il riscaldatore al relè a stato solido.
3. Collegare il relè a stato solido al regolatore di temperatura PID.
4. Collegare la sonda del sensore di temperatura alla parte inferiore dei due riscaldatori e collegare il terminale al regolatore di temperatura PID.
5. Collegare due relè a stato solido in serie e collegare il cavo di alimentazione.
6. Stampare in 3D uno slot per i due riscaldatori e mantenere i riscaldatori sullo stesso piano (vedere File supplementare 1 per i file STL necessari per la stampa 3D).
   NOTA: Lasciare un'intercapedine d'aria di 12 mm tra i due riscaldatori.
7. Posizionare il chip microfluidico sui due riscaldatori.
8. Preparare una pompa a siringa e una siringa, fissare la siringa sulla pompa a siringa, collegare un tubo in silicone (diametro interno di 0,8 mm [ID]) con una siringa e collegare un ago in acciaio (ID 0,7 mm) alla parte superiore del tubo in silicone (Figura 3).
9. Inserire l'ago in acciaio nell'ingresso del chip microfluidico.
10. Posizionare un puntale di pipetta all'uscita del chip per raccogliere i prodotti PCR.

4. Costruzione del sistema CE

1. Utilizzare un alimentatore ad alta tensione per generare un campo elettrico a campo pulsato; Notare gli elettrodi positivo e negativo.
2. Utilizzare una lampada al mercurio come sorgente luminosa e filtrare la lunghezza d'onda di eccitazione dalla lampada al mercurio attraverso un filtro.
3. Posizionare il capillare sul tavolino del microscopio.
4. Raccogliere l'emissione di fluorescenza con l'obiettivo, quindi rilevarla utilizzando un tubo fotomoltiplicatore R928 (PMT). Osservare il microscopio e il capillare. Accendi la luce in condizioni di stanza buia; La luce di eccitazione viene raccolta dall'obiettivo.
5. Utilizzare il software LABVIEW sviluppato internamente per controllare l'alimentazione e completare l'acquisizione dei dati (descritta nei passaggi 6.3-6.6). Vedi https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
   NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in una camera oscura e lo schema del sistema CE è mostrato nella Figura 4.

5. Eseguire la soluzione PCR

1. Preimpostare la temperatura dei riscaldatori del sistema CF-PCR a 65 °C e 95 °C.
2. Posizionare il chip microfluidico sui due blocchi riscaldanti.
3. Inserire la punta della provetta in silicone in una provetta da centrifuga contenente 50 μL di soluzione PCR (dal punto 2.3). Tirare lo stantuffo della siringa per prelevare lentamente la soluzione. Fissare la siringa su una pompa a siringa. Inserire l'ago in acciaio nell'ingresso del chip microfluidico.
4. Impostare la portata della pompa a 10 μL/min e premere il pulsante di avvio per spingere la soluzione nel microcanale all'ingresso del microchip.
5. Raccogliere i prodotti PCR all'uscita del chip microfluidico.
   NOTA: Sciacquare il canale con acqua ultrapura prima e dopo la PCR per rimuovere le impurità.

6. Rilevamento dei prodotti PCR da parte di questo sistema CE costruito internamente

1. Preparare un capillare con una lunghezza totale di 8 cm e una lunghezza effettiva di 6 cm.
2. Preparare il tampone di separazione mescolando 100 μL di idrossietilcellulosa all'1% (HEC, p/v), 2 μL di 100x SYBR Green I e 98 μL di acqua ultrapura per ottenere lo 0,5% di HEC (p/v) contenente 1x SYBR Green I.
3. Riempire il capillare con il tampone di separazione preparato utilizzando una pompa a vuoto.
4. Inserire la tensione di iniezione (800 V) e il tempo di iniezione (2,0 s) sull'interfaccia software, fare clic sul pulsante di avvio e attendere che i prodotti PCR vengano introdotti elettrodinamicamente nel capillare a 100 V/cm (2,0 s).
   NOTA: In questa fase, i prodotti PCR vengono posizionati sull'elettrodo negativo e il tampone viene posizionato sull'elettrodo positivo.
5. Immettere la tensione CC (800 V) sull'interfaccia software, fare clic sul pulsante di avvio ed eseguire l'elettroforesi a 100 V/cm di intensità del campo elettrico.
   NOTA: In questa fase, sia l'elettrodo positivo che quello negativo vengono posizionati con il tampone.
6. Fare clic sul pulsante di arresto dopo che tutti i frammenti di DNA sono stati separati nel capillare.
7. Sciacquare il capillare con acqua sterilizzata per 1 minuto dopo ogni corsa.

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Risultati

La Figura 5 rappresenta l'elettroferogramma dei prodotti della PCR e dei marcatori del DNA. La traccia (Figura 5A) è il risultato CE del prodotto amplificato CF-PCR, la traccia (Figura 5B) è il risultato CE del prodotto amplificato dal ciclo termico e la traccia (Figura 5C) è il risultato CE della scala del DNA a 100 bp. Per prima cosa abbiamo amplificato il gene bersaglio di E. coli nel sis...

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Discussione

Sia la PCR che la CE sono due biotecnologie popolari nell'analisi degli acidi nucleici. Questo documento descrive l'amplificazione di E. coli e la rilevazione dei prodotti PCR utilizzando i sistemi CF-PCR e CE, entrambi costruiti internamente. Il gene bersaglio di E. coli è stato amplificato con successo entro 10 minuti a causa delle elevate velocità di trasferimento del calore. I frammenti di DNA più piccoli di 1.500 bp sono stati separati entro 8 minuti (Figura 5). Il ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp DNA ladder	Takara Bio Inc.	3422A
10x Fast Buffer I	Takara Bio Inc.	RR070A
10x TBE	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T1051
developer solution	Alfa Aesar, USA	L15459
dNTP mixture (2.5 μM)	Takara Bio Inc.	RR070A
EC-F	Sangon Biotech, Shanghai, China
EC-R	Sangon Biotech, Shanghai, China
HEC,1300K	Sigma-Aldrich, USA	9004-62-0
isopropanol	Aladdin, Shanghai, China	67-63-0
microscope	Olympus, Japan	BX51
photolithography	SUSS MicroTec, Germany	MJB4
photomultiplier tube	Hamamatsu Photonics, Japan	R928
photoresist	MicroChem, USA	SU-8 2075
PID temperature controllers	Shanghai, China	XH-W2023
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G-2
polyvinyl pyrrolidone (PVP)	Aladdin, Shanghai, China	P110608
pump	Harvard Apparatus	PHD2000
silicone tubing	BIO-RAD,USA	7318210
solid-state relays	KZLTD, China	KS1-25LA
SpeedSTAR HS DNA Polymerase	Takara Bio Inc.	RR070A
steel needle	zhongxinqiheng,Suzhou,China
SYBR GREEN	Solarbio, Beijing, China	SY1020
temperature sensors	EasyShining Technology, Chengdu, China	TCM-M207
Template (E. coli)	Takara Bio Inc.	AK601
Tween 20	Aladdin, Shanghai, China	T104863
voltage power supply	Medina, NY, USA	TREK MODEL 610E