Amplificazione di Escherichia coli in un chip microfluidico PCR a flusso continuo e sua rilevazione con un sistema di elettroforesi capillare

Riepilogo

Questo protocollo descrive come costruire un sistema a catena di polimerasi a flusso continuo basato su un chip microfluidico e come costruire un sistema di elettroforesi capillare in laboratorio. Presenta un metodo semplice per l'analisi degli acidi nucleici in laboratorio.

Abstract

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo tradizionale impiegato per l'amplificazione di un gene bersaglio che ha svolto un ruolo importante nella diagnostica biomolecolare. Tuttavia, la PCR tradizionale richiede molto tempo a causa dell'efficienza di variazione della bassa temperatura. Questo lavoro propone un sistema di PCR a flusso continuo (CF-PCR) basato su un chip microfluidico. Il tempo di amplificazione può essere notevolmente ridotto facendo scorrere la soluzione PCR in un microcanale posto su riscaldatori impostati a temperature diverse. Inoltre, poiché l'elettroforesi capillare (CE) è un modo ideale per differenziare i prodotti PCR positivi da quelli falsi positivi, è stato costruito un sistema CE per ottenere una separazione efficiente dei frammenti di DNA. Questo documento descrive il processo di amplificazione di Escherichia coli (E. coli) da parte del sistema CF-PCR costruito internamente e la rilevazione dei prodotti PCR da parte di CE. I risultati dimostrano che il gene bersaglio di E. coli è stato amplificato con successo entro 10 minuti, indicando che questi due sistemi possono essere utilizzati per la rapida amplificazione e rilevamento degli acidi nucleici.

Introduzione

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare specifici frammenti di DNA, amplificando così tracce di DNA centinaia di milioni di volte. È stato ampiamente utilizzato nella diagnosi clinica, nella ricerca medica, nella sicurezza alimentare, nell'identificazione forense e in altri campi. Il processo di PCR consiste principalmente in tre fasi: denaturazione a 90-95 °C, ricottura a 50-60 °C ed estensione a 72-77 °C. Il ciclo termico è una parte importante del processo di PCR; tuttavia, il termociclatore PCR tradizionale non è solo ingombrante ma anche inefficiente, richiedendo circa 40 minuti per completare 2....

Protocollo

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzati in questo protocollo.

1. Fabbricazione del chip microfluidico CF-PCR

1. Riscaldare il wafer di silicio a 200 °C per 25 minuti per rimuovere l'umidità.
2. Erogare 1 mL di fotoresist SU-8-2075 per pollice del wafer. Centrifugarlo sul wafer di silicio utilizzando uno spin coater a 500 giri/min per 5-10 s con un'accelerazione di 100 giri/min, e poi a 2.000 giri/min per 30 s con un'accelerazione di 500 giri/min/s.
3. Cuocere il wafer di silicio a 65 °C per 3 minuti, p....

Risultati

La Figura 5 rappresenta l'elettroferogramma dei prodotti della PCR e dei marcatori del DNA. La traccia (Figura 5A) è il risultato CE del prodotto amplificato CF-PCR, la traccia (Figura 5B) è il risultato CE del prodotto amplificato dal ciclo termico e la traccia (Figura 5C) è il risultato CE della scala del DNA a 100 bp. Per prima cosa abbiamo amplificato il gene bersaglio di E. coli nel sis.......

Discussione

Sia la PCR che la CE sono due biotecnologie popolari nell'analisi degli acidi nucleici. Questo documento descrive l'amplificazione di E. coli e la rilevazione dei prodotti PCR utilizzando i sistemi CF-PCR e CE, entrambi costruiti internamente. Il gene bersaglio di E. coli è stato amplificato con successo entro 10 minuti a causa delle elevate velocità di trasferimento del calore. I frammenti di DNA più piccoli di 1.500 bp sono stati separati entro 8 minuti (Figura 5). Il .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp DNA ladder	Takara Bio Inc.	3422A
10x Fast Buffer I	Takara Bio Inc.	RR070A
10x TBE	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T1051
developer solution	Alfa Aesar, USA	L15459
dNTP mixture (2.5 μM)	Takara Bio Inc.	RR070A
EC-F	Sangon Biotech, Shanghai, China
EC-R	Sangon Biotech, Shanghai, China
HEC,1300K	Sigma-Aldrich, USA	9004-62-0
isopropanol	Aladdin, Shanghai, China	67-63-0
microscope	Olympus, Japan	BX51
photolithography	SUSS MicroTec, Germany	MJB4
photomultiplier tube	Hamamatsu Photonics, Japan	R928
photoresist	MicroChem, USA	SU-8 2075
PID temperature controllers	Shanghai, China	XH-W2023
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G-2
polyvinyl pyrrolidone (PVP)	Aladdin, Shanghai, China	P110608
pump	Harvard Apparatus	PHD2000
silicone tubing	BIO-RAD,USA	7318210
solid-state relays	KZLTD, China	KS1-25LA
SpeedSTAR HS DNA Polymerase	Takara Bio Inc.	RR070A
steel needle	zhongxinqiheng,Suzhou,China
SYBR GREEN	Solarbio, Beijing, China	SY1020
temperature sensors	EasyShining Technology, Chengdu, China	TCM-M207
Template (E. coli)	Takara Bio Inc.	AK601
Tween 20	Aladdin, Shanghai, China	T104863
voltage power supply	Medina, NY, USA	TREK MODEL 610E