JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mitofaji, mitokondriyal kalite kontrolünün birincil mekanizmasıdır. Bununla birlikte, in vivo mitofajinin değerlendirilmesi, güvenilir kantitatif tahlillerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, hücre pervasıtalı yeşil-floresan mitokondri boyası ve kırmızı-floresan lizozom boyası kullanılarak canlı hücrelerde mitofajinin gözlemlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Hücrenin güç merkezleri olan mitokondri, biyoenerjetik çalışmalarda, serbest radikal oluşumunda, kalsiyum homeostazında ve apoptozda önemli roller oynamaktadır. Mitofaji, mitokondriyal kalite kontrolün birincil mekanizmasıdır ve genellikle mikroskobik gözlem kullanılarak incelenir, ancak in vivo mitofi tahlillerinin yapılması zordur. Mitofajiyi canlı organelleri görüntüleyerek değerlendirmek, mitokondriyal araştırmalar için alternatif ve gerekli bir yöntemdir. Bu protokol, boyaların yüklenmesi, mitokondri ve lizozomun görselleştirilmesi ve beklenen sonuçlar dahil olmak üzere, hücre perkastı yeşil floresan mitokondri boyası MitoTracker Green ve kırmızı floresan lizozom boyası LysoTracker Red'in canlı hücrelerde kullanılmasına ilişkin prosedürleri açıklar. Canlı hücrelerde mitofajinin değerlendirilmesi için ayrıntılı adımlar ve mikroskop yazılım ayarları hakkında teknik notlar da sağlanmaktadır. Bu yöntem, araştırmacıların canlı hücreli floresan mikroskopi kullanarak mitofajiyi gözlemlemelerine yardımcı olabilir. Ek olarak, mitokondri ve lizozomları ölçmek ve mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için kullanılabilir.

Giriş

Mitokondri, neredeyse tüm ökaryotik hücrelerin güç merkezleridir 1,2. Oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimine ek olarak, mitokondri biyoenerjetik kalsiyum homeostazı, serbest radikal üretimi, apoptoz ve hücresel homeostaz 3,4,5 gibi diğer süreçlerde hayati bir rol oynamaktadır. Mitokondri, elektron taşıma zincirindeki çoklu komplekslerden reaktif oksijen türleri (ROS) ürettiğinden, antioksidan savunma sistemi çöktüğünde yapısal hasara ve işlev bozukluğuna yol açabilecek potansiyel oksidatif stres tarafından sürekli olarak uyarılırlar 6,7. Mitokondriyal disfonksiyonun metabolik bozukluklar, nörodejenerasyon ve kardiyovasküler hastalık8 dahil olmak üzere birçok hastalığa katkıda bulunduğu bulunmuştur. Bu nedenle, sağlıklı mitokondriyal popülasyonları ve bunların uygun işlevlerini korumak çok önemlidir. Mitokondri oldukça plastik ve dinamik organellerdir; morfolojileri ve fonksiyonları, mitokondriyal proteinlerin post-translasyonel modifikasyonları (PTM), mitokondriyal biyogenez, füzyon, fisyon ve mitofaji 9,10 dahil olmak üzere mitokondriyal kalite kontrol mekanizmaları tarafından kontrol edilir. Proteinlerin dinamin süper ailesinin bir GTPazı olan dinamin ile ilişkili protein 1'in (DRP1) aracılık ettiği mitokondriyal fisyon, küçük ve yuvarlak mitokondri ile sonuçlanır ve mitofaji11,12 tarafından temizlenebilen ve parçalanabilen işlevsiz mitokondrileri izole eder.

Mitofaji, mitokondrileri otofaji ile seçici olarak bozan, genellikle yaralanma, yaşlanma veya stresten sonra hasarlı mitokondrilerde ortaya çıkan hücresel bir süreçtir. Daha sonra, bu mitokondriler bozulma10 için lizozomlara verilir. Bu nedenle, mitofaji, mitokondrinin miktarını ve kalitesini çok çeşitli hücre tiplerinde sağlıklı bir durumda tutmaya yardımcı olan katabolik bir süreçtir. Normal fizyolojik ve stres koşulları altında hücresel homeostazın restorasyonunda çok önemli bir rol oynar13,14. Hücreler, farklı hücresel stres sinyalleri ve gelişimsel değişiklikler tarafından indüklenen karmaşık bir mitofaji mekanizması ile karakterizedir. Mitopaji düzenleyici yolakları ubikitine bağımlı veya reseptöre bağımlı15,16 olarak sınıflandırılır; ubikitin bağımlı otofajiye kinaz PINK1 ve ubikitin ligaz Parkin E3'ün mitokondri17,18'e alınması aracılık ederken, reseptöre bağımlı otofaji, otofaji reseptörlerinin mitokondriyal hasara yanıt olarak mitofajiye aracılık eden mikrotübül ile ilişkili protein hafif zincir LC3'e bağlanmasını içerir19.

İletim elektron mikroskobu (TEM), mitofaji20'yi gözlemlemek ve tespit etmek için en yaygın kullanılan yöntemdir ve hala en iyi yöntemlerden biridir. Mitofajinin morfolojik özellikleri, otofagozomların lizozomlarla füzyonu ile oluşan otofagozomlar veya otolizozomlardır ve elektron mikroskobu görüntülerinden gözlemlenebilir21. Bununla birlikte, elektron mikroskobunun (EM) zayıflığı, mitokondriyal depolarizasyon, mitokondriyal fisyon ve otofagozomların ve lizozomların füzyonu gibi mitofajinin dinamik süreçlerini canlı hücre20'de izleyememektir. Bu nedenle, canlı organelleri görüntüleme yoluyla mitofajiyi değerlendirmek, mitokondriyal araştırmalar için cazip bir alternatif yöntemdir. Burada açıklanan canlı hücre görüntüleme tekniği, mitokondri ve lizozomları boyamak için iki floresan boya kullanır. Mitofaji meydana geldiğinde, otofagozomlar tarafından yutulan hasarlı veya gereksiz mitokondri, mitokondriyal boya tarafından yeşile boyanırken, kırmızı boya lizozomları boyar. Otolizozomlar olarak adlandırılan bu otofagozomların ve lizozomların füzyonu, yeşil ve kırmızı floresanın üst üste binmesine ve sarı noktalar olarak tezahür etmesine neden olur, böylece mitofaji22'nin oluşumunu gösterir. Hücre perkastı mitokondri boyası (MitoTracker Green), mitokondri23'ü etiketlemek için hafif bir tiol-reaktif klorometil moiety içerir. Mitokondrileri etiketlemek için, hücreler plazma zarı boyunca pasif olarak yayılan ve aktif mitokondride biriken boya ile basitçe inkübe edilir. Bu mitokondri boyası canlı hücreleri kolayca lekeleyebilir ve aldehit ile sabitlenmiş veya ölü hücrelerin boyanmasında daha az etkilidir. Lizozom boyası (LysoTracker Red), canlı hücrelerdeki asidik organelleri etiketlemek ve izlemek için kullanılan floresan asidotropik bir probdur. Bu boya, asidik organeller için yüksek bir seçicilik sergiler ve canlı hücreleri nanomolar konsantrasyonlarda etkili bir şekilde etiketleyebilir24.

Bu floresan boyaların, boyaların yüklenmesi ve mitokondri ve lizozomların görselleştirilmesi de dahil olmak üzere canlı hücrelerde kullanılması için prosedürler burada sunulmuştur. Bu yöntem, araştırmacıların canlı hücreli floresan mikroskopi kullanarak mitofajiyi gözlemlemelerine yardımcı olabilir. Mitokondri ve lizozomları ölçmek ve mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için de kullanılabilir.

Protokol

1. Hücre kültürü ve pasaj

NOT: Protokol, örnek olarak rutin olarak kültürlenmiş fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) kullanılarak tanımlanmıştır.

  1. Kültür MEF hücreleri, 10 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile 10 cm hücre kültürü kaplarında. 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin ve hücreleri mikroskop altında 100x büyütmede izleyin.
  2. Rutin hücre geçişi gerçekleştirin.
    1. Hücreler% 80-90 akıcılığa ulaştığında (her 3 günde bir), hücreleri 2 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile yıkayın. Daha sonra hücreleri ayırmak için 1 dakika boyunca 2 mL% 0.05 tripsin-EDTA, ardından tripsin-EDTA'nın etkisini durdurmak için 2 mL DMEM ekleyin. Hücre süspansiyonunu 100 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj edin ve hücre peletini 1 mL DMEM'de yeniden askıya alın.
    2. Otomatik bir hücre sayacı ve hücre sayma odası slaytları kullanarak hücreleri sayın (bkz. Malzeme Tablosu) ve ardından 1.5 x 106 hücreleri, 10 mL DMEM içeren yeni bir 10 cm'lik hücre kültürü kabına aşılayın.
  3. Mitofaji testi için, adım 1.2.1'de olduğu gibi bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Hücre süspansiyonunu taze DMEM'de 1 x 105 hücre / mL'ye seyreltin.
  4. 20 mm'lik bir konfokal kaba 2 mL seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve kültür kabını bir "çapraz" içinde sallayın. Hücre kültürü kabını 37 °C, % 5 CO 2 inkübatöründe24 saat boyunca inkübe edin.

2. Mitokondriyal boyama

  1. Yeşil floresan mitokondriyal boya ve kırmızı floresan lizozom boyasının stok çözeltisi alikotlarını -20 °C dondurucudan çıkarın.
  2. DMEM'deki stok çözeltileri 1:1.000 oranında seyrelterek boyaların çalışma çözeltilerini hazırlayın ve iyice karıştırın. Örneğin, her iki boya için 1 μM'lik bir çalışma konsantrasyonu elde etmek için 1 mM mitokondriyal boyanın her birine 2 μL DMEM'e 2 μL mitokondriyal boya ve lizozom boyası ekleyin.
  3. Ortamı konfokal kültür kabından çıkarın (adım 1.4). Hücreleri örtmek için 1 mL boyama çözeltisi (adım 2.2'de hazırlanan) ekleyin. Hücre kültürü kabını 37 ° C'de bir inkübatöre, 20-30 dakika boyunca% 5 CO 2'ye yerleştirin.

3. Konfokal görüntüleme

  1. 1 L Krebs-Henseleit (KH) tamponu (138,2 mM NaCl, 3,7 mM KCl, 0,25 mM CaCl 2,1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4,7H2O, 15 mM glikoz ve 21,85 mM HEPES; son pH7,4) hazırlayın ve4 °C'de (1 aya kadar) saklayın.
  2. Konfokal görüntüleme gününde, KH tamponunu buzdolabından önceden çıkarın ve oda sıcaklığına (20 ila 25 ° C) önceden ısıtın.
  3. Konfokal mikroskopi görüntüleme yazılımının parametrelerini ayarlayın ( bkz. Malzeme Tablosu): Çift uyarma görüntüleri için, 488 nm ve 543 nm'de sıralı uyarma kullanın ve sırasıyla 505-545 nm ve >560 nm'de emisyon toplayın.
    NOT: Görüntüleme ayarlarını aşağıdaki gibi yapın. Tarama Modu: çerçeve; Hız: 9; Ortalama: sayı, 1; Kazanç: 450 ila 600; İğne deliği: 30 ila 200; lazer: %<10. Önce görüntüleme yazılımını başlatmak ve ardından 488 nm lazeri tamamen açmak en iyisidir. 543 nm lazerin kullanımdan önce 3-5 dakika boyunca açılması ve stabilize edilmesi gerekir (Şekil 1A).
  4. Boyayı içeren kültür ortamını inkübatörden çıkarın (adım 2.3) ve kaba 1 mL KH tamponu ekleyin.
  5. Mitofajiyi indüklemek için, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca KH tamponunda 1 μM'de (son konsantrasyon) karbonil siyanür-4-(triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) ile tedavi edin ve hemen konfokal mikroskop kullanarak hücreleri görüntülemeye devam edin.
  6. 63x yağlı lensin üst kısmına uygun miktarda yağ uygulayın (bkz. Hücre örneğini konfokal mikroskobun numune aşamasına yerleştirin ve doğrudan objektif lensin üzerine taşıyın.
  7. Yazılım arabiriminin sol üst köşesindeki Bul sekmesine tıklayarak örneği bulmak için görüntüleme yazılımını kullanın (Şekil 1B). Deneme için yeşil bir filtre kümesi seçin.
  8. Objektif lensi yukarı ve aşağı hareket ettirerek hızlı bir şekilde odaklanmak için kaba ayar düğmesini kullanın. Hücre örneği göz merceğinden açıkça görülebildikten sonra, tek hücrelerin alanını arayın ve odaklayın ve görüş alanının merkezine taşıyın.
  9. Görüntüleri almak için yazılım arayüzünün sol üst köşesindeki Edinme sekmesine tıklayın. Önizleme için yalnızca 488 nm kanalı ve kare çözünürlüğü 1024 x 1024'ü seçin.
  10. Canlı bir tarama başlatmak için sol üst köşedeki Canlı sekmesine tıklayın. Görüş alanını en keskin olana ayarlayın ve kaydırıcıyı sola veya sağa hareket ettirerek lazer gücünü ayarlayın (Şekil 1A). Aşırı pozlamayı önlemek için kazanç ayarını 600'ün altında tutun.
  11. İğne deliği değerini 156, kazanç değerini 545 ve dijital ofset değerini 0 olarak ayarlayın.
  12. En iyi görüş alanını seçin, iki kanalı (488 nm ve 543 nm) kontrol edin ve 1024 x 1024 kare çözünürlüğünü seçin. 2B görüntüler elde etmek için Tuttur'u tıklatın. Alınan görüntüleri kaydedin.
    NOT: Yeşil mitokondri boyasının 490 nm'de bir uyarma zirvesi ve 516 nm'de bir emisyon zirvesi vardır; 488 nm lazer kullanılarak uyarılabilir. Kırmızı lizozom boyası 576 nm'de bir uyarma zirvesine ve 590 nm'de bir emisyon zirvesine sahiptir; 543 nm lazer kullanılarak uyarılabilir.

4. Görüntü analizi

  1. Kaydedilen görüntüyü ImageJ ile açın ve birleştirilmiş görüntüyü içine aktarın.
  2. Her hücredeki sarı noktaların sayısını manuel olarak sayın, bu da lizozomun mitokondri yuttuğunu gösterir.

Sonuçlar

MitoTracker Green, mitokondriye doğru bir şekilde lokalize olabilen yeşil floresan mitokondriyal bir lekedir. Boya, canlı hücreleri kolayca lekeleyebilir ve aldehit ile sabitlenmiş veya ölü hücrelerin boyanmasında daha az etkilidir (Şekil 2). Kırmızı floresan lizozom boyası LysoTracker Red, asidik lizozomal organelleri etiketleyebilir ve izleyebilir ve sadece canlı hücreleri lekeleyebilir (Şekil 2). Konfokal mikroskop görüntüleme, uygun boya...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol, canlı hücrelerde otofagozomlar, lizozomlar ve mitokondriyal fisyonu içeren dinamik mitofaji sürecini, hücre perkastlı mitokondri ve lizozom boyaları ile birlikte boyama yoluyla değerlendirmek ve izlemek için bir yöntem sağlar. Yöntem ayrıca mitokondrileri tanımlamak ve mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu çalışmada kullanılan her iki boya da ışıktan korunmalı, çoklu donma-çözülme döngülerinden kaçınılmalı ve boyalar mümkün ol...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81970333,31901044) ve Şangay Yüksek Öğrenim Kurumlarında Özel Atama Profesörü Programı (GZ2020008) tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Automated cell counterCountstarIC1000
Cell counting chamber slidesCountstar12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)Corning10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Corning21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish)NEST801002
Image J (Rasband, NIH)NIHhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) bufferSelf-prepared
LysoTracker RedInvitrogen1818430100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker GreenInvitrogen1842298200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic FibroblastsSelf-prepared
Objective (63x oil lens)ZEISSZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25%GibicoCat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning MicroscopeZEISSZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)ZEISSZEN 2.1

Referanslar

  1. Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
  2. Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
  3. Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
  4. Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
  5. Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
  6. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  7. Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
  8. Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
  9. Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
  10. Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
  11. Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
  12. Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
  13. Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
  14. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
  15. Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
  16. Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
  17. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  18. Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
  19. Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
  20. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
  21. Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
  22. Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
  23. Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
  24. Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
  25. Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  26. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
  27. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  28. Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
  29. Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
  30. Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
  31. Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
  32. Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 189

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır