미토콘드리아와 리소좀을 위한 형광 염료로 미토파지 시각화

요약

미토파지는 미토콘드리아 품질 관리의 주요 메커니즘입니다. 그러나, 생체 내 미토파지의 평가는 신뢰할 수 있는 정량적 분석의 부족으로 인해 방해를 받는다. 여기에 제시된 것은 세포 투과성 녹색 형광 미토콘드리아 염료와 적색 형광 리소좀 염료를 사용하여 살아있는 세포에서 미토파지를 관찰하기위한 프로토콜입니다.

초록

세포의 발전소 인 미토콘드리아는 생체 에너지, 자유 라디칼 생성, 칼슘 항상성 및 세포 사멸에 중요한 역할을합니다. Mitophagy는 미토콘드리아 품질 관리의 주요 메커니즘이며 일반적으로 현미경 관찰을 사용하여 연구되지만 생체 내 미토파지 분석은 수행하기가 어렵습니다. 살아있는 세포 소기관을 이미징하여 미토파지를 평가하는 것은 미토콘드리아 연구를 위한 대안적이고 필요한 방법입니다. 이 프로토콜은 염료의 로딩, 미토콘드리아 및 리소좀의 시각화 및 예상 결과를 포함하여 살아있는 세포에서 세포 투과성 녹색-형광 미토콘드리아 염료 MitoTracker Green 및 적색 형광 리소좀 염료 LysoTracker Red를 사용하는 절차를 설명합니다. 살아있는 세포에서 미토파지 평가를 위한 자세한 단계와 현미경 소프트웨어 설정에 대한 기술 참고 사항도 제공됩니다. 이 방법은 연구자들이 살아있는 세포 형광 현미경을 사용하여 미토파지를 관찰하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 미토콘드리아와 리소좀을 정량화하고 미토콘드리아 형태를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

미토콘드리아는 거의 모든 진핵 세포의 발전소입니다 ^1,2. 산화적 인산화를 통한 ATP 생산 외에도 미토콘드리아는 생물 에너지, 칼슘 항상성, 자유 라디칼 생성, 세포 사멸 및 세포 항상성 ^3,4,5와 같은 다른 과정에서 중요한 역할을 합니다. 미토콘드리아는 전자 수송 사슬의 여러 복합체에서 활성 산소 종 (ROS)을 생성하기 때문에 잠재적 인 산화 스트레스에 의해 지속적으로 자극되어 항산화 방어 시스템이 붕괴 될 때 결국 구조적 손상과 기능 장애를 유발할 수 있습니다 ^6,7. 미토콘드리아 기능 장애는 대사 장애, 신경 변성 및 심혈관 질환을 비롯한 많은 질병에 기여하는 것으로 밝혀졌습니다⁸. 따라서 건강한 미토콘드리아 개체군과 적절한 기능을 유지하는 것이 중요합니다. 미토콘드리아는 매우 가소성적이고 역동적 인 세포 기관입니다. 이들의 형태와 기능은 미토콘드리아 단백질의 번역 후 변형 (PTM), 미토콘드리아 생물 발생, 융합, 핵분열 및 미토파지 ^9,10을 포함한 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘에 의해 제어됩니다. 다이나민 관련 단백질 1 (DRP1)에 의해 매개되는 미토콘드리아 분열은 다이나민 수퍼 패밀리의 GTPase로 작고 둥근 미토콘드리아를 생성하고 기능 장애 미토콘드리아를 분리하며, 이는 미토파지^11,12에 의해 제거되고 분해 될 수 있습니다.

Mitophagy는 자가포식에 의해 미토콘드리아를 선택적으로 분해하는 세포 과정으로, 일반적으로 손상, 노화 또는 스트레스 후 손상된 미토콘드리아에서 발생합니다. 이어서, 이들 미토콘드리아는 분해¹⁰을 위해 리소좀으로 전달된다. 따라서 미토파지는 다양한 세포 유형에서 미토콘드리아의 양과 질을 건강한 상태로 유지하는 데 도움이 되는 이화 과정입니다. 그것은 정상적인 생리적 및 스트레스 조건 하에서 세포 항상성의 회복에 결정적인 역할을합니다^13,14. 세포는 세포 스트레스와 발달 변화의 다른 신호에 의해 유도되는 복잡한 미토파지 메커니즘을 특징으로합니다. 미토파지 조절 경로는 유비퀴틴 의존성 또는 수용체 의존성^15,16으로 분류됩니다. 유비퀴틴 의존성 자가포식은 키나아제 PINK1 및 유비퀴틴 리가아제 Parkin E3의 미토콘드리아 17,18로의 동원에 의해 매개되는 반면^, 수용체-의존성 자가포식은 미토콘드리아 손상에 반응하여 미토포식을 매개하는 미세소관 관련 단백질 경쇄 LC3에 대한 자가포식 수용체의 결합을 포함합니다¹⁹.

투과 전자 현미경 (TEM)은 가장 일반적으로 사용되는 방법이며 여전히 mitophagy²⁰을 관찰하고 검출하는 가장 좋은 방법 중 하나입니다. 미토파지의 형태학적 특징은 자가포식소체와 리소좀의 융합에 의해 형성된 자가포식체 또는 자가소좀이며, 이는 전자 현미경 이미지(²¹)로부터 관찰될 수 있다. 그러나, 전자 현미경(EM)의 약점은 살아있는 세포(²⁰)에서 미토콘드리아 탈분극, 미토콘드리아 분열, 및 자가포식과 리소좀의 융합과 같은 미토포지의 동적 과정을 모니터링할 수 없다는 것이다. 따라서 살아있는 세포 기관 이미징을 통해 미토파지를 평가하는 것은 미토콘드리아 연구를 위한 매력적인 대안 방법입니다. 여기에 설명된 라이브 셀 이미징 기술은 두 가지 형광 염료를 사용하여 미토콘드리아와 리소좀을 염색합니다. 미토파지가 발생하면 자가포식소체에 의해 휩싸인 손상되거나 불필요한 미토콘드리아는 미토콘드리아 염료에 의해 녹색으로 염색되고 빨간색 염료는 리소좀을 염색합니다. 자가포식소체라고 하는 이러한 자가포식체와 리소좀의 융합은 녹색과 빨간색 형광이 겹쳐져 노란색 점으로 나타나 미토파지²²의 발생을 나타냅니다. 세포 투과성 미토콘드리아 염료(MitoTracker Green)는 미토콘드리아²³을 표지하기 위해 약한 티올 반응성 클로로메틸 잔기를 포함합니다. 미토콘드리아에 라벨을 붙이기 위해 세포는 단순히 염료와 함께 배양되며, 염료는 원형질막을 가로 질러 수동적으로 확산되어 활성 미토콘드리아에 축적됩니다. 이 미토콘드리아 염료는 살아있는 세포를 쉽게 염색 할 수 있으며 알데히드 고정 또는 죽은 세포를 염색하는 데 덜 효과적입니다. 리소좀 염료(LysoTracker Red)는 살아있는 세포에서 산성 소기관을 표지하고 추적하는 데 사용되는 형광 유산 탐침입니다. 이 염료는 산성 세포 기관에 대해 높은 선택성을 나타내며 나노몰 농도에서 살아있는 세포를 효과적으로 표지할 수 있습니다²⁴.

살아있는 세포에서 이러한 형광 염료를 사용하는 절차, 즉 염료 로딩 및 미토콘드리아 및 리소좀의 시각화가 여기에 나와 있습니다. 이 방법은 연구자들이 살아있는 세포 형광 현미경을 사용하여 미토파지를 관찰하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 미토콘드리아와 리소좀을 정량화하고 미토콘드리아 형태를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 세포 배양 및 계대 배양

참고: 프로토콜은 일상적으로 배양되는 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 예로 사용하여 설명됩니다.

1. MEF 세포를 10 mL의 Dulbecco의 변형 독수리 배지 (DMEM)로 10cm 세포 배양 접시에서 배양합니다. 37°C 및 5%_CO2 에서 인큐베이션하고, 세포를 100x 배율로 현미경으로 모니터링하였다.
2. 일상적인 세포 계대를 수행합니다.
   1. 세포가 80%-90% 컨플루언시(3일마다)에 도달하면 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 2mL로 세포를 세척합니다. 그런 다음 0.05% 트립신-EDTA 2mL를 추가하여 1분 동안 세포를 해리시킨 다음 DMEM 2mL를 추가하여 트립신-EDTA의 작용을 중지시킵니다. 세포 현탁액을 100 x g 에서 3분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 1mL의 DMEM에 재현탁합니다.
   2. 자동 세포 카운터 및 세포 계수 챔버 슬라이드( 재료 표 참조)를 사용하여 세포를 계수한 다음 1.5 x 10⁶ 세포를 10mL의 DMEM이 포함된 새로운 10cm 세포 배양 접시에 접종합니다.
3. 미토파지 분석을 위해, 단계 1.2.1에서와 같이 세포 현탁액을 제조한다. 세포 현탁액을 새로운 DMEM에서 1 x 10⁵ 세포/mL로 희석합니다.
4. 희석된 세포 현탁액 2mL를 20mm 공초점 접시( 재료 표 참조)에 넣고 배양 접시를 "십자가"로 흔듭니다. 세포 배양 접시를 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션한다.

2. 미토콘드리아 염색

1. 녹색 형광 미토콘드리아 염료 및 적색 형광 리소좀 염료 ( 재료 표 참조)의 스톡 용액 분취량을 -20°C 냉동고에서 제거합니다.
2. 원액을 DMEM에 1:1,000으로 희석하여 염료의 작업액을 준비하고 잘 섞는다. 예를 들어, 2mL의 DMEM에 1mM 미토콘드리아 염료와 리소좀 염료를 각각 2μL씩 추가하여 두 염료 모두에 대해 1μM의 작동 농도를 얻습니다.
3. 공초점 배양 접시로부터 배지를 제거한다(단계 1.4). 1mL의 염색 용액(단계 2.2에서 제조됨)을 추가하여 세포를 덮습니다. 세포 배양 접시를 37°C, 5%_CO2 의 인큐베이터에 20-30분 동안 둡니다.

3. 컨포칼 이미징

1. 1 L의 크렙스-헨셀라이트(KH) 완충액(138.2 mM NaCl, 3.7 mM KCl, 0.25 mM_CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4.7H2O, 15 mM 글루코스, 및 21.85 mM 헤페스; 최종 pH 7.4)을 준비하고 4°C에서 보관한다(최대 1개월 동안).
2. 컨포칼 이미징 당일에는 미리 냉장고에서 KH 버퍼를 제거하고 실온(20-25°C)으로 예열합니다.
3. 컨포칼 현미경 이미징 소프트웨어의 파라미터 설정( 재료 표 참조): 이중 여기 이미지의 경우 488nm 및 543nm에서 순차 여기를 사용하고 각각 505-545nm 및 >560nm에서 방출을 수집합니다.
   참고: 다음과 같이 이미징 설정을 지정합니다. 스캔 모드: 프레임; 속도: 9; 평균 : 숫자, 1; 이득: 450에서 600; 핀홀: 30 내지 200; 레이저 : <10 %. 먼저 이미징 소프트웨어를 시작한 다음 488nm 레이저를 완전히 켜는 것이 가장 좋습니다. 543nm 레이저는 사용하기 전에 3-5분 동안 켜고 안정화해야 합니다(그림 1A).
4. 배양기에서 염료가 포함된 배양액을 제거하고(단계 2.3) 1mL의 KH 완충액을 접시에 추가합니다.
5. 미토파지를 유도하기 위해, 세포를 실온에서 10분 동안 KH 완충액 중 1μM(최종 농도)의 카르보닐 시안화물-4-(트리플루오로메톡시) 페닐히드라존(FCCP)으로 처리하고 즉시 공초점 현미경을 사용하여 세포를 이미지화합니다.
6. 63x 오일 렌즈 상단에 적절한 양의 오일을 바르십시오( 재료 표 참조). 세포 샘플을 컨포칼 현미경의 샘플 스테이지에 놓고 대물 렌즈 바로 위로 이동합니다.
7. 이미징 소프트웨어를 사용하여 소프트웨어 인터페이스의 왼쪽 상단 모서리에 있는 찾기 탭을 클릭하여 샘플을 찾습니다(그림 1B). 실험에 사용할 녹색 필터 집합을 선택합니다.
8. 거친 조정 손잡이를 사용하여 대물 렌즈를 위아래로 움직여 빠르게 초점을 맞춥니다. 접안 렌즈를 통해 세포 샘플을 명확하게 볼 수있게되면 단일 세포 영역을 검색하고 초점을 맞추고 시야의 중심으로 이동합니다.
9. 소프트웨어 인터페이스의 왼쪽 상단 모서리에 있는 획득 탭을 클릭하여 이미지를 획득 합니다. 미리 보기를 위해 488nm 채널과 프레임 해상도 1024 x 1024만 선택합니다.
10. 왼쪽 상단 모서리에 있는 라이브 탭을 클릭하여 라이브 스캔을 시작합니다. 시야를 가장 선명하게 조정하고 슬라이더를 왼쪽 또는 오른쪽으로 움직여 레이저 출력을 조정합니다(그림 1A). 과다 노출을 방지하기 위해 게인 설정을 600 미만으로 유지하십시오.
11. 핀홀 값을 156으로, 게인 값을 545로, 디지털 오프셋 값을 0으로 조정합니다.
12. 최상의 시야각을 선택하고 두 채널(488nm 및 543nm)을 확인한 다음 프레임 해상도 1024 x 1024를 선택합니다. 스냅을 클릭하여 2D 이미지를 획득합니다. 획득한 이미지를 저장합니다.
    참고 : 녹색 미토콘드리아 염료는 490nm에서 여기 피크를 가지며 516nm에서 방출 피크를 갖습니다. 488nm 레이저를 사용하여 여기할 수 있습니다. 적색 리소좀 염료는 576nm에서 여기 피크를 가지며 590nm에서 방출 피크를 가지며; 543nm 레이저를 사용하여 여기할 수 있습니다.

4. 이미지 분석

1. ImageJ로 저장된 이미지를 열고 병합 된 이미지를 가져옵니다.
2. 각 세포의 노란색 점의 수를 수동으로 계산하면 리소좀이 미토콘드리아를 삼키고 있음을 나타냅니다.

결과

MitoTracker Green은 미토콘드리아에 정확하게 국한될 수 있는 녹색 형광 미토콘드리아 염색입니다. 염료는 살아있는 세포를 쉽게 염색할 수 있으며 알데히드 고정 또는 죽은 세포를 염색하는 데 덜 효과적입니다(그림 2). 적색 형광 리소좀 염료 LysoTracker Red는 산성 리소좀 소기관을 표지하고 추적할 수 있으며 살아있는 세포만 염색할 수 있습니다(그림 2). ?...

토론

여기에 설명된 프로토콜은 세포 투과성 미토콘드리아 및 리소좀 염료와의 공동 염색을 통해 자가포식, 리소좀 및 미토콘드리아 분열을 포함하는 살아있는 세포에서 미토파지의 동적 과정을 평가하고 모니터링하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 또한 미토콘드리아를 식별하고 미토콘드리아 형태를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 연구에 사용 된 두 염료는 빛으로부터 보호되어야하며, 여러 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated cell counter	Countstar	IC1000
Cell counting chamber slides	Countstar	12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish)	NEST	801002
Image J (Rasband, NIH)	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer			Self-prepared
LysoTracker Red	Invitrogen	1818430	100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green	Invitrogen	1842298	200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts			Self-prepared
Objective (63x oil lens)	ZEISS	ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibico	Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)	ZEISS	ZEN 2.1