Visualisierung der Mitophagie mit Fluoreszenzfarbstoffen für Mitochondrien und Lysosomen

Zusammenfassung

Mitophagie ist der primäre Mechanismus der mitochondrialen Qualitätskontrolle. Die Bewertung der Mitophagie in vivo wird jedoch durch das Fehlen zuverlässiger quantitativer Assays behindert. Hier wird ein Protokoll zur Beobachtung der Mitophagie in lebenden Zellen unter Verwendung eines zellpermierten grün-fluoreszierenden Mitochondrienfarbstoffs und eines rot fluoreszierenden Lysosomenfarbstoffs vorgestellt.

Zusammenfassung

Mitochondrien, die Kraftwerke der Zelle, spielen eine wichtige Rolle bei der Bioenergetik, der Erzeugung freier Radikale, der Kalziumhomöostase und der Apoptose. Mitophagie ist der primäre Mechanismus der mitochondrialen Qualitätskontrolle und wird im Allgemeinen durch mikroskopische Beobachtung untersucht, jedoch sind In-vivo-Mitophagie-Assays schwierig durchzuführen. Die Bewertung der Mitophagie durch Bildgebung lebender Organellen ist eine alternative und notwendige Methode für die mitochondriale Forschung. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Verwendung des zellpermierten grün-fluoreszierenden Mitochondrienfarbstoffs MitoTracker Green und des rot fluoreszierenden Lysosomenfarbstoffs LysoTracker Red in lebenden Zellen, einschließlich der Beladung der Farbstoffe, der Visualisierung der Mitochondrien und des Lysosoms sowie der erwarteten Ergebnisse. Detaillierte Schritte zur Bewertung der Mitophagie in lebenden Zellen sowie technische Hinweise zu den Einstellungen der Mikroskopsoftware werden ebenfalls bereitgestellt. Diese Methode kann Forschern helfen, Mitophagie mit lebender Zellfluoreszenzmikroskopie zu beobachten. Darüber hinaus kann es verwendet werden, um Mitochondrien und Lysosomen zu quantifizieren und die mitochondriale Morphologie zu beurteilen.

Einleitung

Mitochondrien sind die Kraftwerke fast aller eukaryotischen Zellen ^1,2. Neben der ATP-Produktion durch oxidative Phosphorylierung spielen Mitochondrien eine wichtige Rolle in anderen Prozessen wie Bioenergetik, Kalziumhomöostase, Erzeugung freier Radikale, Apoptose und zellulärer Homöostase ^3,4,5. Da Mitochondrien reaktive Sauerstoffspezies (ROS) aus mehreren Komplexen in der Elektronentransportkette erzeugen, werden sie ständig durch potenziellen oxidativen Stress stimuliert, der schließlich zu strukturellen Schäden und Funktionsstörungen führen kann, wenn das antioxidative Abwehrsystem kollabiert ^6,7. Es wurde festgestellt, dass mitochondriale Dysfunktion zu vielen Krankheiten beiträgt, einschließlich Stoffwechselstörungen, Neurodegeneration und Herz-Kreislauf-Erkrankungen⁸. Daher ist es wichtig, gesunde mitochondriale Populationen und ihre ordnungsgemäße Funktion zu erhalten. Mitochondrien sind hochplastische und dynamische Organellen; Ihre Morphologie und Funktion werden durch mitochondriale Qualitätskontrollmechanismen kontrolliert, einschließlich posttranslationaler Modifikationen (PTM) von mitochondrialen Proteinen, mitochondrialer Biogenese, Fusion, Spaltung und Mitophagie ^9,10. Die mitochondriale Spaltung, die durch das Dynamin-verwandte Protein 1 (DRP1), eine GTPase der Dynamin-Superfamilie von Proteinen, vermittelt wird, führt zu kleinen und runden Mitochondrien und isoliert die dysfunktionalen Mitochondrien, die durch Mitophagie^11,12 gereinigt und abgebaut werden können.

Mitophagie ist ein zellulärer Prozess, der Mitochondrien selektiv durch Autophagie abbaut, die normalerweise in beschädigten Mitochondrien nach Verletzungen, Alterung oder Stress auftritt. Anschließend werden diese Mitochondrien an Lysosomen zum Abbau^{abgegeben 10}. Daher ist die Mitophagie ein kataboler Prozess, der dazu beiträgt, die Quantität und Qualität der Mitochondrien in einem gesunden Zustand in einer Vielzahl von Zelltypen zu erhalten. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Wiederherstellung der zellulären Homöostase unter normalen physiologischen und Stressbedingungen^13,14. Zellen zeichnen sich durch einen komplexen Mitophagiemechanismus aus, der durch verschiedene Signale von zellulärem Stress und Entwicklungsveränderungen induziert wird. Mitophagie-Regulationswege werden als Ubiquitin-abhängig oder Rezeptor-abhängig klassifiziert^15,16; Die Ubiquitin-abhängige Autophagie wird durch die Kinase PINK1 und die Rekrutierung der Ubiquitin-Ligase Parkin E3 an die Mitochondrien^{vermittelt 17,18}, während die rezeptorabhängige Autophagie die Bindung von Autophagierezeptoren an die Mikrotubuli-assoziierte Protein-Leichtkette LC3 beinhaltet^, die Mitophagie als Reaktion auf mitochondriale Schäden vermittelt ¹⁹.

Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist die am häufigsten verwendete Methode und immer noch eine der besten Methoden zur Beobachtung und zum Nachweis der Mitophagie²⁰. Die morphologischen Merkmale der Mitophagie sind Autophagosomen oder Autolysosomen, die durch die Fusion von Autophagosomen mit Lysosomen gebildet werden, was aus elektronenmikroskopischen Bildern beobachtet werden kann²¹. Die Schwäche der Elektronenmikroskopie (EM) ist jedoch die Unfähigkeit, die dynamischen Prozesse der Mitophagie, wie mitochondriale Depolarisation, mitochondriale Spaltung und Fusion von Autophagosomen und Lysosomen, in der lebenden Zelle^{zu überwachen 20}. Daher ist die Bewertung der Mitophagie durch Bildgebung lebender Organellen eine attraktive alternative Methode für die mitochondriale Forschung. Die hier beschriebene Lebendzellbildgebungstechnik verwendet zwei Fluoreszenzfarbstoffe, um Mitochondrien und Lysosomen zu färben. Wenn Mitophagie auftritt, werden beschädigte oder überflüssige Mitochondrien, die von Autophagosomen verschlungen werden, durch den mitochondrialen Farbstoff grün gefärbt, während der rote Farbstoff die Lysosomen färbt. Die Verschmelzung dieser Autophagosomen und Lysosomen, die als Autolysosomen bezeichnet werden, bewirkt, dass sich die grüne und rote Fluoreszenz überlappen und sich als gelbe Punkte manifestieren, was auf das Auftreten von Mitophagie^{hinweist 22}. Der zellpermierte Mitochondrienfarbstoff (MitoTracker Green) enthält einen leicht thiolreaktiven Chlormethylanteil, um Mitochondrien²³ zu markieren. Um Mitochondrien zu markieren, werden Zellen einfach mit dem Farbstoff inkubiert, der passiv über die Plasmamembran diffundiert und sich in aktiven Mitochondrien ansammelt. Dieser Mitochondrienfarbstoff kann lebende Zellen leicht färben und ist weniger wirksam bei der Färbung von aldehydfixierten oder toten Zellen. Der Lysosomenfarbstoff (LysoTracker Red) ist eine fluoreszierende acidotrope Sonde, die zur Markierung und Verfolgung saurer Organellen in lebenden Zellen verwendet wird. Dieser Farbstoff weist eine hohe Selektivität für saure Organellen auf und kann lebende Zellen bei nanomolaren Konzentrationen effektiv markieren²⁴.

Die Verfahren zur Verwendung dieser Fluoreszenzfarbstoffe in lebenden Zellen, einschließlich der Beladung der Farbstoffe und der Visualisierung von Mitochondrien und Lysosomen, werden hier vorgestellt. Diese Methode kann Forschern helfen, Mitophagie mit lebender Zellfluoreszenzmikroskopie zu beobachten. Es kann auch verwendet werden, um Mitochondrien und Lysosomen zu quantifizieren und die mitochondriale Morphologie zu beurteilen.

Protokoll

1. Zellkultur und Passaging

HINWEIS: Das Protokoll wird am Beispiel routinemäßig kultivierter embryonaler Fibroblasten (MEFs) der Maus beschrieben.

1. Kultur von MEF-Zellen in 10 cm Zellkulturschalen mit 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Inkubieren Sie bei 37 °C und 5% CO₂ und überwachen Sie die Zellen unter dem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung.
2. Führen Sie routinemäßiges Zell-Passaging durch.
   1. Wenn die Zellen 80% -90% Konfluenz erreichen (alle 3 Tage), waschen Sie die Zellen mit 2 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS). Dann fügen Sie 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA für 1 Minute hinzu, um die Zellen zu dissoziieren, gefolgt von 2 ml DMEM, um die Wirkung von Trypsin-EDTA zu stoppen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 100 x g für 3 min und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml DMEM.
   2. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler und Objektträgern für die Zellzählkammer (siehe Materialtabelle) und impfen Sie dann 1,5 x 10⁶ Zellen in eine neue 10-cm-Zellkulturschale mit 10 ml DMEM.
3. Für den Mitophagietest wird eine Zellsuspension gemäß Schritt 1.2.1 hergestellt. Die Zellsuspension wird in frischem DMEM auf 1 x 10⁵ Zellen/ml verdünnt.
4. 2 ml der verdünnten Zellsuspension in eine 20 mm große konfokale Schale geben (siehe Materialtabelle) und die Kulturschale in einem "Kreuz" schütteln. Die Zellkulturschale in einem 37 °C, 5%_CO2 Inkubator für 24 h inkubieren.

2. Mitochondriale Färbung

1. Die Aliquots der Stammlösung des grün fluoreszierenden mitochondrialen Farbstoffs und des rot fluoreszierenden Lysosomenfarbstoffs (siehe Materialtabelle) werden aus dem Gefrierschrank bei -20 °C entfernt.
2. Bereiten Sie Arbeitslösungen der Farbstoffe vor, indem Sie die Stammlösungen 1:1.000 in DMEM verdünnen und gut mischen. Zum Beispiel fügen Sie jeweils 2 μL 1 mM mitochondrialen Farbstoff und Lysosomenfarbstoff zu 2 ml DMEM hinzu, um eine Arbeitskonzentration von 1 μM für beide Farbstoffe zu erhalten.
3. Entfernen Sie das Medium aus der konfokalen Kulturschale (Schritt 1.4). Fügen Sie 1 ml der Färbelösung (hergestellt in Schritt 2.2) hinzu, um die Zellen zu bedecken. Die Zellkulturschale für 20-30 min in einen Inkubator bei 37 °C, 5%_CO2 geben.

3. Konfokale Bildgebung

1. 1 l Krebs-Henseleit (KH)-Puffer (138,2 mM NaCl, 3,7 mM KCl, 0,25 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO 4,7H2O, 15 mM Glucose und 21,85 mM HEPES; End-pH_7,4) vorbereiten und bei₄ °C lagern (bis zu 1 Monat).
2. Am Tag der konfokalen Bildgebung den KH-Puffer vorab aus dem Kühlschrank nehmen und auf Raumtemperatur (20 bis 25 °C) vorwärmen.
3. Stellen Sie die Parameter der konfokalen Mikroskopie-Bildgebungssoftware ein (siehe Materialtabelle): Verwenden Sie für Bilder mit doppelter Anregung die sequentielle Anregung bei 488 nm und 543 nm und sammeln Sie die Emission bei 505-545 nm bzw. >560 nm.
   HINWEIS: Legen Sie die Imaging-Einstellungen wie folgt fest. Scan-Modus: Rahmen; Geschwindigkeit: 9; Durchschnitt: Anzahl, 1; Gewinn: 450 bis 600; Pinhole: 30 bis 200; Laser: <10%. Am besten starten Sie zuerst die Imaging-Software und schalten dann den 488-nm-Laser vollständig ein. Der 543-nm-Laser muss vor der Verwendung eingeschaltet und 3-5 Minuten lang stabilisiert werden (Abbildung 1A).
4. Entfernen Sie das Kulturmedium, das den Farbstoff enthält, aus dem Inkubator (Schritt 2.3) und geben Sie 1 ml KH-Puffer in die Schale.
5. Um die Mitophagie zu induzieren, behandeln Sie die Zellen mit Carbonylcyanid-4-(trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP) bei 1 μM (Endkonzentration) in KH-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur und fahren Sie sofort fort, die Zellen mit dem konfokalen Mikroskop abzubilden.
6. Tragen Sie eine entsprechende Menge Öl auf die Oberseite der 63-fachen Öllinse auf (siehe Materialtabelle). Legen Sie die Zellprobe auf den Probentisch des konfokalen Mikroskops und bewegen Sie sie direkt über die Objektivlinse.
7. Verwenden Sie die Imaging-Software, um das Beispiel zu finden, indem Sie auf die Registerkarte Locate (Suchen ) in der oberen linken Ecke der Softwareoberfläche klicken (Abbildung 1B). Wählen Sie einen grünen Filtersatz für das Experiment aus.
8. Verwenden Sie den groben Einstellknopf, um schnell zu fokussieren, indem Sie das Objektiv nach oben und unten bewegen. Nachdem die Zellprobe durch das Okular gut sichtbar ist, suchen und fokussieren Sie den Bereich einzelner Zellen und bewegen Sie ihn in die Mitte des Sichtfeldes.
9. Klicken Sie auf die Registerkarte Erfassung in der oberen linken Ecke der Softwareoberfläche, um Bilder aufzunehmen. Wählen Sie nur den 488-nm-Kanal und die Bildauflösung 1024 x 1024 für die Vorschau aus.
10. Klicken Sie auf die Registerkarte Live in der oberen linken Ecke, um einen Live-Scan zu starten. Stellen Sie das Sichtfeld auf das schärfste und die Laserleistung ein, indem Sie den Schieberegler nach links oder rechts bewegen (Abbildung 1A). Halten Sie die Verstärkungseinstellung unter 600, um eine Überbelichtung zu vermeiden.
11. Stellen Sie den Lochblendenwert auf 156, den Verstärkungswert auf 545 und den digitalen Offsetwert auf 0 ein.
12. Wählen Sie das beste Sichtfeld, überprüfen Sie die beiden Kanäle (488 nm und 543 nm) und wählen Sie die Bildauflösung 1024 x 1024. Klicken Sie auf Ausrichten , um 2D-Bilder aufzunehmen. Speichern Sie die aufgenommenen Bilder.
    HINWEIS: Der grüne Mitochondrienfarbstoff hat einen Anregungspeak bei 490 nm und einen Emissionspeak bei 516 nm; Es kann mit einem 488-nm-Laser angeregt werden. Der rote Lysosomenfarbstoff hat einen Anregungspeak bei 576 nm und einen Emissionspeak bei 590 nm; Es kann mit einem 543-nm-Laser angeregt werden.

4. Bildanalyse

1. Öffnen Sie das gespeicherte Bild mit ImageJ und importieren Sie das zusammengeführte Bild hinein.
2. Zählen Sie manuell die Anzahl der gelben Punkte in jeder Zelle, die anzeigen, dass das Lysosom Mitochondrien verschlingt.

Ergebnisse

MitoTracker Green ist eine grün fluoreszierende mitochondriale Färbung, die in der Lage ist, Mitochondrien genau zu lokalisieren. Der Farbstoff kann lebende Zellen leicht färben und ist weniger wirksam bei der Färbung aldehydfixierter oder toter Zellen (Abbildung 2). Der rot fluoreszierende Lysosomenfarbstoff LysoTracker Red ist in der Lage, saure lysosomale Organellen zu markieren und zu verfolgen und kann nur lebende Zellen färben (Abbildung 2). Die konfo...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine Methode zur Bewertung und Überwachung des dynamischen Prozesses der Mitophagie in lebenden Zellen, an dem Autophagosomen, Lysosomen und mitochondriale Spaltung beteiligt sind, durch Co-Färbung mit zellpermeierten Mitochondrien und Lysosomenfarbstoffen. Die Methode kann auch verwendet werden, um Mitochondrien zu identifizieren und die mitochondriale Morphologie zu beurteilen. Beide in dieser Studie verwendeten Farbstoffe sollten vor Licht geschützt werden, mehrere Gefrier-Tau...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated cell counter	Countstar	IC1000
Cell counting chamber slides	Countstar	12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish)	NEST	801002
Image J (Rasband, NIH)	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer			Self-prepared
LysoTracker Red	Invitrogen	1818430	100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green	Invitrogen	1842298	200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts			Self-prepared
Objective (63x oil lens)	ZEISS	ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibico	Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)	ZEISS	ZEN 2.1