JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Karmaşık genetik devrelerin tasarlanması, test edilmesi ve optimize edilmesi zaman alıcıdır. Bu işlemi kolaylaştırmak için, memeli hücreleri, devre bileşenlerinin çoklu stokiyometrilerinin tek bir kuyuda test edilmesine izin verecek şekilde transfekte edilir. Bu protokol, deneysel planlama, transfeksiyon ve veri analizi adımlarını özetlemektedir.

Özet

Memeli genetik devreleri, çok çeşitli hastalık durumlarını algılama ve tedavi etme potansiyelini göstermiştir, ancak devre bileşenlerinin seviyelerinin optimizasyonu zorlu ve emek yoğun olmaya devam etmektedir. Bu süreci hızlandırmak için laboratuvarımız, geleneksel memeli transfeksiyonunun yüksek verimli bir uzantısı olan poli-transfeksiyonu geliştirdi. Poli-transfeksiyonda, transfekte popülasyondaki her hücre esasen farklı bir deney yapar, devrenin davranışını farklı DNA kopya numaralarında test eder ve kullanıcıların tek bir pot reaksiyonunda çok sayıda stokiyometriyi analiz etmelerine izin verir. Şimdiye kadar, tek bir hücre kuyucuğundaki üç bileşenli devrelerin oranlarını optimize eden poli-transfeksiyonlar gösterilmiştir; Prensip olarak, aynı yöntem daha büyük devrelerin geliştirilmesi için de kullanılabilir. Poli-transfeksiyon sonuçları, geçici devreler için DNA'nın ko-transfekt'e optimal oranlarını bulmak veya kararlı hücre hatlarının oluşturulması için devre bileşenleri için ekspresyon seviyelerini seçmek için kolayca uygulanabilir.

Burada, üç bileşenli bir devreyi optimize etmek için poli-transfeksiyonun kullanımını gösteriyoruz. Protokol, deneysel tasarım ilkeleriyle başlar ve poli-transfeksiyonun geleneksel ko-transfeksiyon yöntemlerine nasıl dayandığını açıklar. Daha sonra, hücrelerin poli-transfeksiyonu gerçekleştirilir ve birkaç gün sonra akış sitometrisi ile takip edilir. Son olarak, veriler, belirli bileşen oranlarına sahip hücrelerin alt kümelerine karşılık gelen tek hücreli akış sitometri verilerinin dilimleri incelenerek analiz edilir. Laboratuvarda, hücre sınıflandırıcılarını, geri besleme ve besleme denetleyicilerini, iki kararlı motifleri ve daha fazlasını optimize etmek için poli-transfeksiyon kullanılmıştır. Bu basit ama güçlü yöntem, memeli hücrelerindeki karmaşık genetik devreler için tasarım döngülerini hızlandırır.

Giriş

Memeli sentetik biyolojisi alanı, kültürlenmiş hücre hatlarında basit duyu ve tepki parçaları geliştirmekten, teşhis ve terapötiklerdeki gerçek dünyadaki zorlukları ele almak için karmaşık gen ağlarının optimizasyonuna kadar hızla ilerlemiştir1. Bu sofistike devreler, mikroRNA profillerinden sitokinlere ve küçük moleküllü ilaçlara kadar biyolojik girdileri algılayabilir ve transistörler, bant geçiş filtreleri, geçiş anahtarları ve osilatörler dahil olmak üzere mantık işleme devrelerini uygulayabilir. Ayrıca kanser, artrit, diyabetve daha birçok 1,2,3,4,5 gibi hastalıkların hayvan modellerinde umut verici sonuçlar göstermiştir. Bununla birlikte, bir devrenin karmaşıklığı arttıkça, bileşenlerinin her birinin seviyelerini optimize etmek giderek daha zor hale gelir.

Özellikle yararlı bir genetik devre türü, hücresel durumları algılamak ve bunlara yanıt vermek için programlanabilen bir hücre sınıflandırıcıdır. Belirli hücresel durumlarda protein veya RNA çıktılarının seçici üretimi, hücrelerin ve organoidlerin farklılaşmasını yönlendirmek ve programlamak, hastalıklı hücreleri ve / veya istenmeyen hücre tiplerini tanımlamak ve yok etmek ve terapötik hücrelerin işlevini düzenlemek için güçlü bir araçtır 1,2,3,4,5 . Bununla birlikte, memeli hücrelerinde, hücre durumlarını çoklu hücresel RNA ve / veya protein türlerinden doğru bir şekilde sınıflandırabilen devreler oluşturmak oldukça zor olmuştur.

Bir hücre sınıflandırma devresi geliştirmenin en çok zaman alan adımlarından biri, devre içindeki sensörler ve işleme faktörleri gibi bireysel bileşen genlerinin göreceli ekspresyon seviyelerini optimize etmektir. Devre optimizasyonunu hızlandırmak ve daha sofistike devrelerin inşasına izin vermek için, son çalışmalar optimal kompozisyonları ve topolojileri tahmin etmek için hücre sınıflandırıcı devrelerinin ve bileşenlerinin matematiksel modellemesini kullanmıştır 6,7. Bu şimdiye kadar güçlü sonuçlar göstermiş olsa da, matematiksel analiz, devredeki bileşen genlerinin giriş-çıkış davranışını sistematik olarak karakterize etme ihtiyacı ile sınırlıdır ve bu da zaman alıcıdır. Ayrıca, karmaşık genetik devrelerde bağlama bağlı sayısız problem ortaya çıkabilir ve bu da tam bir devrenin davranışının bireysel parça karakterizasyonlarına dayanan tahminlere meydan okumasına neden olabilir 8,9.

Hücre durumu sınıflandırıcıları gibi karmaşık memeli devrelerini daha hızlı geliştirmek ve test etmek için laboratuvarımız, plazmid ko-transfeksiyon protokollerinin bir evrimi olan poli-transfeksiyon10 adı verilen bir teknik geliştirdi. Ko-transfeksiyonda, çoklu plazmid DNA türleri, pozitif yüklü bir lipit veya polimer reaktifi ile birlikte kompleksleştirilir, daha sonra hücrelere korelasyonlu bir şekilde verilir (Şekil 1A). Poli-transfeksiyonda, plazmidler reaktif ile ayrı ayrı komplekslenir, böylece her transfeksiyon kompleksinden gelen DNA, hücrelere ilişkisiz bir şekilde iletilir (Şekil 1B). Bu yöntemi kullanarak, transfekte popülasyondaki hücreler, farklı devre bileşenleri taşıyan iki veya daha fazla DNA yükünün oranlarının sayısız kombinasyonuna maruz kalır.

Her hücreye verilen devre bileşenlerinin oranlarını ölçmek için, bir poli-transfeksiyon içindeki her transfeksiyon kompleksi, kompleksin hücresel alımı için bir vekil görevi gören yapısal olarak ifade edilen bir floresan muhabiri içerir. Bir memeli hücresi içinde aktif olan herhangi bir element içermeyen dolgu DNA'sı, tek bir transfeksiyon kompleksinde bir hücreye verilen floresan muhabirin ve devre bileşenlerinin nispi miktarını ayarlamak için kullanılır ve tartışmada daha ayrıntılı olarak tartışılır. Weiss laboratuvarında kullanılan dolgu DNA'sının bir örneği, bir sonlandırıcı dizisi içeren, ancak promotor, kodlama dizisi vb. İçermeyen bir plazmiddir. Farklı devre bileşenleri oranlarına sahip hücreler daha sonra gen devresi fonksiyonu için en uygun oranları bulmak için karşılaştırılabilir. Bu da, devre bileşenlerini genetik entegrasyon için tek bir vektörde (örneğin, bir lentivirüs, transpozon veya iniş pedi) birleştirirken optimum gen ekspresyon seviyelerine ulaşmak için promotörleri ve diğer devre elemanlarını seçmek için yararlı tahminler verir. Bu nedenle, sezgiye dayalı olarak veya zaman alıcı bir deneme yanılma süreci yoluyla devre bileşenleri arasındaki oranları seçmek yerine, poli-transfeksiyon, tek hazneli bir reaksiyonda genetik parçalar arasındaki çok çeşitli stokiyometrileri değerlendirir.

Laboratuvarımızda çoklu transfeksiyon, hücre sınıflandırıcıları, geri besleme ve besleme kontrolörleri ve iki kararlı motifler dahil olmak üzere birçok genetik devrenin optimizasyonunu sağlamıştır. Bu basit ama güçlü yöntem, memeli hücrelerindeki karmaşık genetik devreler için tasarım döngülerini önemli ölçüde hızlandırır. Poli-transfeksiyon o zamandan beri çok boyutlu giriş-çıkış transfer fonksiyonlarını yüksek çözünürlükte10'da ortaya çıkarmak, hücre durumu sınıflandırması 11 için alternatif bir devre topolojisini optimize etmek ve çeşitli yayınlanmış12,13 ve devam eden projeleri hızlandırmak için birkaç genetik devreyi karakterize etmek için kullanılmıştır.

Burada, bir genetik devreyi hızlı bir şekilde optimize etmek için çoklu transfeksiyon kullanma iş akışını açıklıyor ve tasvir ediyoruz (Şekil 2). Protokol, yüksek kaliteli poli-transfeksiyon verilerinin nasıl oluşturulacağını ve poli-transfeksiyon protokolünde ve veri analizinde birkaç yaygın hatadan nasıl kaçınılacağını göstermektedir (Şekil 3). Daha sonra, basit devre bileşenlerini karakterize etmek için poli-transfeksiyonun nasıl kullanılacağını gösterir ve bu süreçte, poli-transfeksiyon sonuçlarını ko-transfeksiyona karşı karşılaştırır (Şekil 4). Son olarak, poli-transfeksiyon sonuçları kanser sınıflandırıcı devresinin optimizasyonunu göstermektedir (Şekil 5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Tablo 1 ve Tablo 2 bu protokol için önemli referanslar olarak hizmet vermektedir. Tablo 1 , reaksiyonlar için reaktif ölçeklemesini gösterir ve Tablo 2 , protokolde (üst yarı) açıklanan örnek bir poli-transfeksiyon ve olası bir takip deneyi (alt yarı) için DNA oranı aritmetiğini gösterir.

1. Hücrelerin transfeksiyon için hazırlanması

  1. Protokolü başlatmadan önce insan embriyonik böbrek (HEK293) hücrelerinin kültürünün% 60 -% 80 oranında akıcı olduğundan emin olun. Bunu yapmak için, 2 gün önce 100 mm x 15 mm doku kültürü Petri kabında 1 x 106 hücre tohumlayın ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Protokolümüz HEK293 hücrelerine odaklansa da, diğer hücre tipleri ikame edilebilir.
  2. Ortamı ve hücreleri aşağıda açıklandığı gibi transfeksiyonlar için hazırlayın.
    1. Dulbecco'nun modifiye kartal besiyeri (DMEM) çözeltisinin en az 20 mL'sini% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA; bakınız Malzeme Tablosu) ile 37 ° C'ye kadar önceden ısıtın. En az 2.4 mL Tripsin ve 2.4 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 37 ° C'ye kadar önceden ısıtın. Ön ısıtma serum ortamını ~ 16 ° C'ye düşürdü.
      NOT: Tüm doku kültürü çalışmaları bir biyogüvenlik kabininde özenle yapılmalıdır.
  3. DMEM çözeltisindeki hücreleri aşağıda açıklandığı gibi yeniden askıya alın.
    1. Mevcut medyayı aspire edin ve elden çıkarın. Hücreleri yıkamak için HEK293 hücre kültürüne 2 mL PBS dağıtın. PBS'yi aspire edin ve bertaraf edin.
    2. HEK293 hücre kültürüne 2 mL Tripsin dağıtın. Petri kabını 37 ° C'de bir inkübatöre 3 dakika boyunca veya hücreler artık yemeğe yapışmayana kadar yerleştirin. Çanağı biyogüvenlik kabinine geri koyun ve plakaya 8 mL DMEM çözeltisi dağıtarak hücre çözeltisini seyreltin.
    3. Çözeltiyi birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Tüm medyayı aspire edin ve 15 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin.
  4. Hücreleri pelet haline getirmek için 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Medyayı aspire edin (hücreleri aspire etmemeye özen göstererek) ve atın. Hücreleri 5 mL DMEM çözeltisi içinde tekrar askıya alın, hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
  5. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak geçerli hücre konsantrasyonunu tahmin edin ( Malzeme Tablosunda listelenmiştir). Altı kuyucuğu (bu örnekte) 1 x 105 hücreli 24 delikli bir plakaya (50.000 hücre/cm2 tohumlama yoğunluğu için) tohumlayın.
  6. DMEM çözeltisini 500 μL'ye kadar ekleyin (önce kuyucuklara DMEM çözeltisi ekleyin) ve ardından işlem başına bir kuyucuğu aşağıdaki gibi etiketleyin: renk kontrolü yok, mKO2 kontrolü, TagBFP kontrolü, NeonGreen kontrolü, tüm renk kontrolü ve çoklu transfeksiyon 1. TagBFP, mKO2 ve NeonGreen kontrol kuyuları, poli-transfeksiyona dahil olan tüm floresan proteinleri için tek renkli kontrollerdir.

2. Transfeksiyon yapılması

  1. Her DNA agregası için tüpler hazırlayın. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini bir kenara bırakın ve tüpleri şu şekilde etiketleyin: renk kontrolü yok, mKO2 kontrolü, TagBFP kontrolü, NeonGreen kontrolü, tüm renk kontrolü, çoklu transfeksiyon karışımı 1 ve poli-transfeksiyon karışımı 2.
    1. Renk kontrolü, mKO2 kontrolü, TagBFP kontrolü, NeonGreen kontrolü ve tüm renk kontrol tüplerine 36 μL azaltılmış serum ortamı ekleyin. Poli-transfeksiyon karışımı 1 ve poli-transfeksiyon karışımı 2 tüplerinin her birine 18 μL indirgenmiş serum ortamı ekleyin.
      NOT: Plazmid konsantrasyonlarının 150 ng/μL olduğu varsayılmaktadır.
    2. Renk kontrol tüpüne 600 ng dolgu plazmidi ekleyin. mKO2 renk kontrol tüpüne 300 ng mKO2 ve 300 ng dolgu plazmidi ekleyin. TagBFP renk kontrol tüpüne 300 ng TagBFP ve 300 ng dolgu plazmidi ekleyin.
    3. NeonGreen renk kontrol tüpüne 300 ng yapısal NeonGreen plazmid ve 300 ng dolgu plazmidi ekleyin. Tüm renk kontrol tüpüne mKO2, TagBFP ve kurucu NeonGreen'in her biri 100 ng ve ayrıca 300 ng dolgu plazmidi ekleyin.
    4. Poli-transfeksiyon karışımı 1 tüpüne 150 ng mKO2 ekleyin. Poli-transfeksiyon karışımı 1 tüpüne 75 ng muhabir NeonGreen plazmid ve 75 ng dolgu plazmidi ekleyin.
    5. Poli-transfeksiyon karışımı 2 tüpüne 150 ng TagBFP ekleyin. Poli-transfeksiyon karışımı 2 tüpüne 75 ng L7ae plazmid ve 75 ng dolgu plazmidi ekleyin.
  2. 216 μL indirgenmiş serum ortamını 9,48 μL transfeksiyon reaktifi ile birleştirerek 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde transfeksiyon ana karışımını oluşturun (reaktif oranları ve reaksiyon ölçeklemesi için Tablo 1'e bakınız). Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın ve bir kenara koyun.
  3. Renk kontrolü, tek renk kontrolü ve tüm renk kontrol tüplerinin her birine 1,58 μL arttırıcı reaktif ekleyin. Poli-transfeksiyon karışım tüplerinin her birine 79 μL arttırıcı reaktif ekleyin. Pipetleyerek her tüpü ayrı ayrı karıştırın.
  4. Transfeksiyon ana karışımını DNA içeren her tüpe ekleyin.
    1. Renk kontrolü olmayan, tek renk kontrolü ve tüm renk kontrol tüplerinin her birine 37,58 μL transfeksiyon ana karışımı ekleyin. Pipetleyerek her tüpü ayrı ayrı karıştırın.
    2. Poli-transfeksiyon karışım tüplerinin her birine 18.79 μL transfeksiyon ana karışımı ekleyin. Pipetleyerek her tüpü ayrı ayrı karıştırın.
  5. Transfeksiyon karışımlarını kuyucuklara dağıtın.
    1. Pipet, renksiz, tek renk ve tüm renk kontrolleri için her transfeksiyonun 65,97 μL'sini ilgili kuyucuklara karıştırır.
    2. Poli-transfeksiyonun 32.98 μL'lik pipeti, 1'i poli-transfeksiyon kuyusuna karıştırın ve kompleksleri etkili bir şekilde dağıtmak için plakayı düz bir yüzey boyunca sıkı bir şekilli sekiz şekilli desende hızlı ama nazikçe döndürün. Daha sonra, poli-transfeksiyonun 32.98 μL'lik pipeti, 2'yi aynı poli-transfeksiyon kuyusuna karıştırır ve plakayı aynı şekilde döndürür.
  6. Plakayı 37 ° C'de,% 5 CO2 ile ve sallamadan, 48 saatlik bir süre boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
    NOT: Hücre canlılığını arttırmak için, hücre ortamı transfeksiyondan sonra her 6 saatte bir değiştirilebilir (bu her zaman gerekli olmasa da ve HEK293 hücreleri ve türevleri ile, ortamı değiştirirken hücreleri plakadan ayırmamaya dikkat edilmelidir).
ReaktifMiktarÖlçekleme
DNA karışımı için azaltılmış serum ortamıKontrol tüpü başına 36 μL, poli-transfeksiyon tüpü başına 18 μL0,05 μL Pipetlemeyi hesaba katmak için %10-20 ekstra hacimle tüp başına azaltılmış serum ortam/ng DNA'sı
DNATüp başına 300-600 ng
P3000Kontrol tüpü başına 1.58 μL, poli-transfeksiyon tüpü başına 0.79 μLTüp başına 0,0022 μL P3000/ng DNA, %10-20 ekstra
Lipo master mix için azaltılmış serum ortamıKontrol tüpü başına 36 μL, poli-transfeksiyon tüpü başına 18 μL0,05 μL, serum ortam/ng toplam DNA'sını azalttı ve pipetlemeyi hesaba katmak için %10-20 ekstra hacim sağladı
Transfeksiyon ve arttırıcı reaktifKontrol tüpü başına 1.58 μL, poli-transfeksiyon tüpü başına 0.79 μL0.0022 μL Lipofectamine 3000/ng DNA, %10-20 ekstra ile

Tablo 1: Transfeksiyonlar için reaktif ölçekleme. Tablo, tek bir kuyucukta bulunan DNA miktarı için dahil edilecek reaktifin doğru oranını göstermektedir. Bu, reaksiyonları etkili bir şekilde ölçeklendirmek ve ana karışımlar oluşturmak için kullanılabilir. Reaktif miktarları% 20'lik bir fazlalık içerecek şekilde ölçeklendirilmiştir.

3. Hücrelerin akış sitometrisi için hazırlanması

  1. DMEM çözeltisinin en az 4,2 mL'sini önceden 37 °C'ye ısıtın. En az 4.2 mL Tripsin ve 4.2 mL PBS'yi 37 °C'ye kadar önceden ısıtın. Floresan ile aktive hücre sıralama (FACS) tampon çözeltisini kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de tutun.
  2. Topaklanmayı azaltmak için FACS tampon çözeltisindeki hücreleri (PBS% 1 BSA, 5 mM etilendiamintetraasetik asit [EDTA] ve% 0.1 sodyum azid [NaN3] ile desteklenmiş; Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden askıya alın.
    1. Mevcut medyayı her bir kuyucuğa aspire edin ve bertaraf edin. Hücreleri yıkamak için her bir kuyucuğa 5 mL PBS dağıtın. PBS'yi aspire edin ve bertaraf edin.
    2. Her bir kuyucuğa 5 mL Tripsin dağıtın. Plakayı 3 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin veya hücreler artık yemeğe yapışmayana kadar. Plakayı biyogüvenlik kabinine geri koyun ve her bir kuyucuğa 5 mL DMEM çözeltisi dağıtarak hücre çözeltilerini seyreltin.
    3. Her bir kuyucuk için, çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek karıştırın. Her kuyu için, tüm medyayı aspire edin ve 15 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin.
  3. Hücreleri pelet haline getirmek için 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Medyayı aspire edin, hücreleri aspire etmemeye ve atmamaya özen gösterin. Her tüpte, hücreleri 5 mL FACS tampon çözeltisi içinde yeniden askıya alın, yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
  4. Her hücre süspansiyon çözeltisini bir süzgeçten geçirin (kümeleri çıkarmak için) ayrı akış sitometrisi konik tüplerine geçirin. Bu tüpleri buz üzerinde en fazla 1 saat tutun ve mümkün olan en kısa sürede akış sitometrisi yapın.

4. Akış sitometrisinin yapılması

NOT: Bir akış sitometresinin çalıştırılması, gerekli görevler hakkında uygun eğitim ve bilgi gerektirir. Yazılım ve ekipman değişiklik gösterebileceğinden ve kullanıcıların genel olarak eğitilmesi gerektiğinden, bu bölüm gerçekleştirilmesi yararlı olan belirli işlemleri ifade eder.

  1. İlk olarak, hücre özelliklerini seçmek ve anormalliklerden (agregalar, döküntüler vb. Dahil) kaçınmak için dolgu plazmid kontrolü (renk kontrolü yok) ile transfekte edilen hücreleri inceleyin. Hücreleri ayırt etmek için birçok parametre kombinasyonu olsa da, ayırt edici özellikleri görselleştirmek için iyi bir yol olarak aşağıdaki üç genel seçeneği kullanın.
    1. İleri saçılma alanına (doğrusal ölçek) karşı yan saçılma alanına (tercih/hücre tipi başına log veya doğrusal ölçek) bakın.
    2. Yan saçılma yüksekliğine (günlük ölçeği) ve yan saçılma genişliğine (doğrusal ölçek) bakın.
    3. İleri saçılma genişliğine (doğrusal ölçek) karşı ileri saçılma yüksekliğine (doğrusal ölçek) bakın.
  2. Ardından, tek renk denetimlerine bakın. Cihaz voltajlarını ayarlamak için tüm renk kontrolünü kullanın, böylece her floresan proteininden gelen sinyaller eşdeğer rastgele floresan birimlerine (a.u.) normalleştirilir. Ardından, kompanzasyon matrisini ayarlamak için kullanılan her floresan proteini için tek renk kontrollerini çalıştırın ve bu da taşma düzeltmesine izin verir.
    NOT: İdeal olarak, floresan değerlerinin tam dinamik aralığı görünür olmalıdır. Floresan protein sinyallerinin daha da normalleştirilmesi, standartlaştırılmış birimlere (örneğin, eşdeğer floresein molekülleri [MEFL'ler; bakınız Beal ve ark.15]) dönüştürülerek yapılabilir. Analiz sırasında MEFL dönüşümünü etkinleştirmek için gökkuşağı kalibrasyon boncuklarını çalıştırın. Bu kalibrasyon aynı zamanda cihazdan cihaza ve günlük sinyal değişimini azaltmak için de yararlıdır16.
  3. Poli-transfeksiyon numune tüpünü çalıştırın.
    NOT: Mümkün olduğunda, 1.000 x 10^ (^ = karışımlar) hücrelerin çalıştırılması önerilir, çünkü daha yüksek boyutlu çoklu transfeksiyonların analiz sırasında daha fazla kutuya bölünmesi gerekir ve her bölmenin istatistiksel olarak anlamlı karşılaştırmalar yapmak için yeterli hücreye (ideal olarak >10) ihtiyacı vardır.

5. Deney sonrası analiz gerçekleştirme

  1. Başlangıçta, doğru sonuçlar elde etmek için kontrollerden (ve varsa boncuklardan) gelen verileri kullanın. Canlı hücre geçidi (yukarıda özetlenen kapıları kullanarak), telafi ve otomatik floresan düzeltmesi gerçekleştirmek için mevcut yazılım araçlarından birini kullanın.
    NOT: Genellikle hem grafiksel bir kullanıcı arayüzüne hem de ön işleme aşaması ve çoklu transfeksiyon analizi için uygun bir python kütüphanesine sahip özel MATLAB kodunu (örneğin, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis veya Cytoflow17) kullanırız.
YöntemKarmaşıkng Floresan Markerng L7ae (fraksiyon)ng Reporter (kesir)ng Dolgu DNA'sı (fraksiyon)Toplam (ng)
Poli-transfeksiyon 1600
→115075 (½)75 (½)300
→215075 (½)75 (½)300
Poli-transfeksiyon 2600
→115025 (1/6)125 (5/6)300
→2150125 (5/6)25(1/6)300

Tablo 2: Protokolde gösterilen poli-transfeksiyon için DNA miktarları ve ayarlanmış plazmid oranları ile örnek bir takip deneyi. Tablonun üst yarısı, basit bir poli-transfeksiyon deneyinde kullanılan plazmidlerin bileşimini göstermektedir. Alt yarı, plazmid oranlarını, gen ekspresyon modülatörünün muhabirine göre daha optimal bir 1: 5 oranında olduğu varsayımsal bir konsantrasyon alanını daha iyi alt örneklemek için ayarlayan güncellenmiş bir deneyin bileşimini gösterir ve bu oran etrafında örneklemek için daha fazla transfekte hücre verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1'de, ko-transfeksiyonu poli-transfeksiyonla karşılaştırıyoruz. Bir ko-transfeksiyonda, tüm plazmidler aynı transfeksiyon karışımında verilir, bu da herhangi bir hücrenin aldığı her plazmidin miktarı arasında yüksek korelasyon ile sonuçlanır (Şekil 1A). Her hücreye verilen toplam plazmidlerin sayısı önemli ölçüde değişmekle birlikte, popülasyondaki bireysel hücrelerdeki iki muhabir proteinin floresansı iyi ilişkilidir, bu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bilgisayar destekli tasarım (CAD), breadboard ve 3D baskı gibi hızlı prototipleme yöntemleri mekanik, elektrik ve inşaat mühendisliği disiplinlerinde devrim yarattı. Belirli bir zorluğa yönelik birçok olası çözümü hızlı bir şekilde arama yeteneği, bir alandaki ilerlemeyi büyük ölçüde hızlandırır. Poli-transfeksiyonun, genetik devrelerin hızlı prototiplenmesini sağlayan biyolojik mühendislik için benzer bir teknoloji olduğuna inanıyoruz. Ek olarak, diğer hızlı prototipleme teknolojil...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

R.W., Strand Therapeutics ve Replay Bio'nun kurucu ortaklarındandır; R.W. ve R.J., hücre tipi sınıflandırıcı ile ilgili geçici bir patent başvurusunda bulundu.

Teşekkürler

Poli-transfeksiyon yönteminin geliştirilmesine ve hücre sınıflandırıcılarına uygulanmasına öncülük eden veya katkıda bulunan eski Weiss Lab üyelerine teşekkür etmek isteriz: Jeremy Gam, Bre DiAndreth ve Jin Huh; Daha fazla yöntem geliştirme/optimizasyona katkıda bulunan diğer Weiss laboratuvar üyeleri: Wenlong Xu, Lei Wang ve Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard ve Patrick Donahue ve Hailey Edelstein da dahil olmak üzere grup üyeleri, çoklu transfeksiyonu test etmek ve geri bildirim sağlamak için; ve Prof. Nika Shakiba bu makaleyi davet ettiği ve geri bildirimde bulunduğu için. Ulusal Sağlık Enstitüleri'ne [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792] de teşekkür ederiz; Ulusal Bilim Vakfı [1745645]; Bu çalışmayı finanse etmek için NCI'den Kanser Merkezi Desteği (çekirdek) Hibe [P30CCA14051, kısmen] ve Ulusal Sağlık Enstitüleri [P50GM098792].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
15mL Corning Falcon conical tubesThermoFisher Scientific14-959-53A
24-well petri dishAny company of choice(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albuminNEBB9000S
CentrifugeAny company of choiceCapable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell CounterThermoFisher ScientificAMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermoFisher ScientificC10228
CytoflowNon-commercial software packagehttps://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# 
DMEMVWR10-013-CVUse the correct media for your cell type
EDTA ThermoFisher Scientific03690-100ML
Fetal bovine serumSigma AldrichF4135
HEK cellsATCCCRL-1573Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cellsATCCCRL-12401Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancerThermoFisher ScientificL3000001Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometerBD BiosciencesN/A
MEM Non-Essential Amino Acids SolutionGibco11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mLAny company of choice
Opti-MEMThermoFisher Scientific31985070reduced serum medium
Phosphate buffered salineThermoFisher Scientific70011044
Rainbow calibration beadsSpherotechURCP-100-2H
Sodium azideSigma AldrichS2002
TrypsinVWR25-053-CI

Referanslar

  1. Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
  2. Sayeg, M. K., et al. Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).
  3. Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
  4. Nissim, L., et al. Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy. Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).
  5. Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Molecular Systems Biology. 6, 444(2010).
  6. Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change. Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).
  7. Prochazka, L., et al. Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human. BioRxiv. , (2021).
  8. Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).
  9. Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
  10. Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106(2019).
  11. Jones, R. D., et al. Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles. Nature Communications. 13 (1), 1720(2022).
  12. Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690(2020).
  13. DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases. Nature Communications. 13 (1), 2582(2022).
  14. Frei, T., et al. Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 4641(2020).
  15. Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report. Massachusetts institute of technology. , Cambridge. MIT-CSAIL-TR-2012-008 (2012).
  16. Beal, J., et al. Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks. ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).
  17. Teague, B. Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2022).
  18. Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames). Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).
  19. Michaels, Y. S., et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nature Communications. 10 (1), 818(2019).
  20. Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
  21. Wroblewska, L., et al. Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery. Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).
  22. Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).
  23. Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. miR-21 as a key regulator of oncogenic processes. Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).
  24. Stanton, B. C., et al. Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates. Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).
  25. Stanton, B. C., et al. Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells. ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 192sentetik biyolojigenetik devrelerh cre s n fland r cy ksek verimli optimizasyongenetik devre h zl prototiplemetransfeksiyonak sitometri analizi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır