Rápido Desenvolvimento de Circuitos de Identificação do Estado Celular com Poli-Transfecção

Resumo

Circuitos genéticos complexos são demorados para projetar, testar e otimizar. Para facilitar esse processo, células de mamíferos são transfectadas de forma a permitir o teste de múltiplas estequiometrias de componentes do circuito em um único poço. Este protocolo descreve as etapas para o planejamento experimental, transfecção e análise dos dados.

Resumo

Circuitos genéticos de mamíferos têm demonstrado o potencial para detectar e tratar uma ampla gama de estados de doenças, mas a otimização dos níveis de componentes do circuito permanece desafiadora e trabalhosa. Para acelerar esse processo, nosso laboratório desenvolveu a politransfecção, uma extensão de alto rendimento da transfecção tradicional de mamíferos. Na politransfecção, cada célula da população transfectada realiza essencialmente um experimento diferente, testando o comportamento do circuito em diferentes números de cópias de DNA e permitindo que os usuários analisem um grande número de estequiometrias em uma reação de pote único. Até o momento, foram demonstradas politransfecções que otimizam as proporções de circuitos de três componentes em um único poço de células; Em princípio, o mesmo método pode ser usado para o desenvolvimento de circuitos ainda maiores. Os resultados da politransfecção podem ser facilmente aplicados para encontrar proporções ótimas de DNA para co-transfect para circuitos transientes ou para escolher níveis de expressão para componentes de circuitos para a geração de linhagens celulares estáveis.

Aqui, demonstramos o uso da politransfecção para otimizar um circuito de três componentes. O protocolo começa com princípios de planejamento experimental e explica como a politransfecção se baseia em métodos tradicionais de cotransfecção. Em seguida, a politransfecção das células é realizada e seguida por citometria de fluxo alguns dias depois. Finalmente, os dados são analisados examinando fatias dos dados de citometria de fluxo de célula única que correspondem a subconjuntos de células com determinadas razões de componentes. No laboratório, a politransfecção tem sido usada para otimizar classificadores de células, controladores de feedback e feedforward, motivos biestáveis e muito mais. Este método simples, mas poderoso, acelera os ciclos de projeto de circuitos genéticos complexos em células de mamíferos.

Introdução

O campo da biologia sintética de mamíferos progrediu rapidamente, desde o desenvolvimento de partes simples de sentido e resposta em linhagens celulares cultivadas até a otimização de redes complexas de genes para enfrentar desafios do mundo real em diagnóstico e terapêutica¹. Esses circuitos sofisticados são capazes de detectar entradas biológicas de perfis de microRNA a citocinas e pequenas moléculas de fármacos, e implementar circuitos de processamento lógico, incluindo transistores, filtros passa-banda, chaves de alternância e osciladores. Também têm mostrado resultados promissores em modelos animais de doenças como câncer, artrite, diabetes e muitas outras 1,2,3,4,5. No entanto, à medida que a complexidade de um circuito cresce, otimizar os níveis de cada um de seus componentes torna-se cada vez mais desafiador.

Um tipo particularmente útil de circuito genético é um classificador celular, que pode ser programado para detectar e responder a estados celulares. A produção seletiva de proteínas ou RNA em estados celulares específicos é uma ferramenta poderosa para orientar e programar a diferenciação de células e organoides, identificar e destruir células doentes e/ou tipos celulares indesejáveis e regular a função de células terapêuticas 1,2,3,4,5 . No entanto, a criação de circuitos em células de mamíferos que possam classificar com precisão os estados celulares de várias espécies de RNA e/ou proteínas celulares tem sido altamente desafiadora.

Uma das etapas mais demoradas do desenvolvimento de um circuito de classificação celular é otimizar os níveis de expressão relativa de genes de componentes individuais, como sensores e fatores de processamento, dentro do circuito. Para acelerar a otimização de circuitos e permitir a construção de circuitos mais sofisticados, trabalhos recentes têm utilizado a modelagem matemática de circuitos classificadores de células e seus componentes para prever composições e topologias ótimas ^6,7. Embora isso tenha mostrado resultados poderosos até agora, a análise matemática é limitada pela necessidade de caracterizar sistematicamente o comportamento de entrada-saída de genes componentes no circuito, o que é demorado. Além disso, uma miríade de problemas dependentes do contexto pode surgir em circuitos genéticos complexos, fazendo com que o comportamento de um circuito completo desafie as previsões baseadas em caracterizações de partes individuais ^8,9.

Para desenvolver e testar mais rapidamente circuitos complexos de mamíferos, como classificadores de estado celular, nosso laboratório desenvolveu uma técnica chamada politransfecção¹⁰, uma evolução dos protocolos de cotransfecção de plasmídeos. Na co-transfecção, múltiplas espécies de DNA plasmidial são complexadas juntamente com um reagente lipídico ou polimérico carregado positivamente e, em seguida, entregues às células de forma correlacionada (Figura 1A). Na politransfecção, os plasmídeos são complexados separadamente com o reagente, de modo que o DNA de cada complexo de transfecção é entregue às células de forma descorrelacionada (Figura 1B). Usando este método, as células dentro da população transfectada são expostas a numerosas combinações de razões de duas ou mais cargas úteis de DNA carregando diferentes componentes do circuito.

Para medir as proporções dos componentes do circuito entregues a cada célula, cada complexo de transfecção dentro de uma politransfecção contém um repórter fluorescente constitutivamente expresso que serve como um proxy para a captação celular do complexo. O DNA de preenchimento que não contém nenhum elemento ativo dentro de uma célula de mamífero é usado para ajustar a quantidade relativa do repórter fluorescente e dos componentes do circuito entregues a uma célula em um único complexo de transfecção e é discutido com mais detalhes na discussão. Um exemplo de DNA de preenchimento usado no laboratório de Weiss é um plasmídeo contendo uma sequência de terminador, mas sem promotor, sequência codificadora, etc. Células com diferentes proporções de componentes do circuito podem então ser comparadas para encontrar razões ideais para a função do circuito gênico. Isso, por sua vez, produz previsões úteis para a escolha de promotores e outros elementos do circuito para alcançar níveis ideais de expressão gênica ao combinar componentes do circuito em um único vetor para integração genética (por exemplo, um lentivírus, transposon ou plataforma de pouso). Assim, em vez de escolher razões entre componentes do circuito com base na intuição ou através de um processo demorado de tentativa e erro, a politransfecção avalia uma ampla gama de estequiometrias entre partes genéticas em uma reação de pote único.

Em nosso laboratório, a politransfecção permitiu a otimização de muitos circuitos genéticos, incluindo classificadores celulares, controladores de feedback e feedforward e motivos biestáveis. Este método simples, mas poderoso, acelera significativamente os ciclos de projeto de circuitos genéticos complexos em células de mamíferos. Desde então, a politransfecção tem sido usada para caracterizar vários circuitos genéticos para revelar suas funções multidimensionais de transferência de entrada-saída em alta resolução¹⁰, otimizar uma topologia de circuito alternativo para classificação de estado celular 11 e acelerar vários projetos publicados^12,13 e em andamento.

Aqui descrevemos e descrevemos o fluxo de trabalho para o uso da politransfecção para otimizar rapidamente um circuito genético (Figura 2). O protocolo mostra como gerar dados de politransfecção de alta qualidade e evitar vários erros comuns no protocolo de politransfecção e na análise dos dados (Figura 3). Em seguida, demonstra como usar a politransfecção para caracterizar componentes de circuitos simples e, no processo, comparar os resultados da politransfecção com a cotransfecção (Figura 4). Finalmente, os resultados da politransfecção mostram otimização do circuito classificador de câncer (Figura 5).

Protocolo

NOTA: A Tabela 1 e a Tabela 2 servem como referências significativas para este protocolo. A Tabela 1 mostra a escala de reagentes para as reações, e a Tabela 2 mostra a aritmética da razão de DNA para um exemplo de politransfecção descrito no protocolo (metade superior) e para um possível experimento de seguimento (metade inferior).

1. Preparação das células para transfecção

1. Certifique-se de que a cultura de células de rim embrionário humano (HEK293) seja 60%-80% confluente antes de iniciar o protocolo. Para isso, semeie 1 x 10⁶ células em uma placa de Petri de cultura de tecido de 100 mm x 15 mm 2 dias antes e incube a 37 °C com 5% de CO₂.
   NOTA: Embora nosso protocolo se concentre em células HEK293, outros tipos de células podem ser substituídos.
2. Prepare os meios e células para transfecções conforme descrito abaixo.
   1. Pré-aquecer pelo menos 20 ml de uma solução de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA; ver Tabela de Materiais) a 37 °C. Pré-aquecer pelo menos 2,4 mL de tripsina e 2,4 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 37 °C também. Meio de soro pré-aquecido reduzido para ~16 °C.
      OBS: Todo trabalho de cultura de tecidos deve ser realizado com cuidado em uma cabine de biossegurança.
3. Ressuspenda as células na solução DMEM conforme descrito abaixo.
   1. Aspirar e descartar os meios atuais. Dispensar 2 mL de PBS na cultura de células HEK293 para lavar as células. Aspirar e eliminar o PBS.
   2. Dispensar 2 mL de tripsina na cultura celular HEK293. Coloque a placa de Petri em uma incubadora a 37 °C por 3 min ou até que as células não aderam mais à placa. Devolver a placa ao armário de biossegurança e diluir a solução celular dispensando 8 ml de solução de DMEM na placa.
   3. Misture a solução pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes. Aspirar todo o meio e colocá-lo em um tubo cônico de 15 mL.
4. Centrifugar as células a 300 x g por 3 min para pastilha-las. Aspirar o meio (tomando cuidado para não aspirar as células) e descartá-lo. Ressuspender as células em 5 mL de solução de DMEM, misturando suavemente pipetando para cima e para baixo.
5. Estime a concentração celular atual usando um contador de células automatizado (listado na Tabela de Materiais). Semeando seis poços (neste exemplo) em uma placa de 24 poços com 1 x 10⁵ células (para uma densidade de semeadura de 50.000 células/cm²).
6. Adicione a solução de DMEM até 500 μL (adicione a solução de DMEM aos poços primeiro) e, em seguida, rotule um poço por tratamento da seguinte forma: nenhum controle de cor, controle mKO2, controle TagBFP, controle NeonGreen, controle de todas as cores e politransfecção 1. Os poços de controle TagBFP, mKO2 e NeonGreen são controles de cor única para todas as proteínas fluorescentes incluídas na politransfecção.

2. Realização da transfecção

1. Prepare tubos para cada agregado de DNA. Separe tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e rotule os tubos como: nenhum controle de cor, controle mKO2, controle TagBFP, controle NeonGreen, controle de todas as cores, mistura de politransfecção 1 e mistura de politransfecção 2.
   1. Adicione 36 μL de meio de soro reduzido ao controle sem cor, controle mKO2, controle TagBFP, controle NeonGreen e todos os tubos de controle de cor. Adicionar 18 μL de soro reduzido a cada um dos tubos da mistura de politransfecção 1 e da mistura de politransfecção 2.
      NOTA: As concentrações plasmidiais são assumidas como sendo 150 ng/μL.
   2. Adicione 600 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle sem cor. Adicione 300 ng de mKO2 e 300 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle de cor mKO2. Adicione 300 ng de TagBFP e 300 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle de cor TagBFP.
   3. Adicionar 300 ng de plasmídeo constitutivo NeonGreen e 300 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle de cor NeonGreen. Adicione 100 ng cada de mKO2, TagBFP e NeonGreen constitutivo, bem como 300 ng de plasmídeo de enchimento, ao tubo de controle de todas as cores.
   4. Adicionar 150 ng de mKO2 ao tubo de mistura de politransfecção 1. Adicione 75 ng de plasmídeo NeonGreen e 75 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de mistura de politransfecção 1.
   5. Adicione 150 ng de TagBFP ao tubo de mistura de politransfecção 2. Adicionar 75 ng de plasmídeo L7ae e 75 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de mistura de politransfecção 2.
2. Crie a mistura mestre de transfecção em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL combinando 216 μL de meio de soro reduzido com 9,48 μL de reagente de transfecção (consulte a Tabela 1 para proporções de reagentes e escala de reação). Misture bem, pipetando para cima e para baixo, e reserve.
3. Adicione 1,58 μL de reagente intensificador a cada um dos tubos sem controle de cor, controle de cor única e todos os tubos de controle de cor. Adicionar 79 μL de reagente potenciador a cada um dos tubos de mistura de politransfecção. Misture cada tubo individualmente pipetando vigorosamente.
4. Adicione a mistura mestra de transfecção a cada tubo contendo DNA.
   1. Adicione 37,58 μL de mistura mestre de transfecção a cada um dos tubos sem controle de cor, controle de cor única e todos os tubos de controle de cor. Misture cada tubo individualmente pipetando vigorosamente.
   2. Adicionar 18,79 μL de mistura mestre de transfecção a cada um dos tubos de mistura de politransfecção. Misture cada tubo individualmente pipetando vigorosamente.
5. Dispense as misturas de transfecção nos poços.
   1. Pipetar 65,97 μL de cada mistura de transfecção para os controles sem cor, cor única e todas as cores para os poços correspondentes.
   2. Pipetar 32,98 μL da mistura de politransfecção 1 no poço de politransfecção e girar a placa rapidamente, mas suavemente, em um padrão apertado de figura oito ao longo de uma superfície plana para distribuir os complexos de forma eficaz. Em seguida, pipetar 32,98 μL da mistura de politransfecção 2 no mesmo poço de politransfecção e girar a placa da mesma maneira.
6. Colocar a placa em incubadora a 37 °C, com 5% de CO₂ e sem agitação, por um período de 48 h.
   NOTA: Para aumentar a viabilidade celular, o meio celular pode ser substituído a cada 6 h após a transfecção (embora isso nem sempre seja necessário, e com células HEK293 e seus derivados, deve-se ter cuidado para não separar as células da placa ao trocar o meio).

Reagente	Quantidade			Escala
Meio de soro reduzido para mistura de DNA	36 μL por tubo de controle, 18 μL por tubo de politransfecção			0,05 μL Meio sérico reduzido/ng DNA por tubo, com 10-20% de volume extra para explicar a pipetagem
ADN	300-600 ng por tubo
P3000	1,58 μL por tubo de controle, 0,79 μL por tubo de politransfecção			0,0022 μL P3000/ng DNA por tubo, com 10-20% extra
Meio de soro reduzido para Lipo master mix	36 μL por tubo de controle, 18 μL por tubo de politransfecção			0,05 μL de DNA total do meio sérico/ng, com 10-20% de volume extra para explicar a pipetagem
Transfecção e reagente potencializador	1,58 μL por tubo de controle, 0,79 μL por tubo de politransfecção			0,0022 μL de Lipofectamina 3000/ng DNA, com 10-20% extra

Tabela 1: Escalonamento de reagentes para transfecções. A tabela indica a proporção correta de reagente a ser incluída para a quantidade de DNA incluída em um único poço. Isso pode ser usado para escalar reações de forma eficaz e formar misturas mestras. As quantidades de reagente foram dimensionadas para incluir um excesso de 20%.

3. Preparação das células para citometria de fluxo

1. Pré-aquecer pelo menos 4,2 ml da solução de DMEM a 37 °C. Pré-aquecer pelo menos 4,2 mL de tripsina e 4,2 mL de PBS a 37 °C. Mantenha a solução tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) a 4 °C até estar pronta para uso.
2. Ressuspender as células na solução tampão FACS (PBS suplementado com BSA a 1%, ácido etilenodiaminotetracético a 5 mM [EDTA] e azida sódica a 0,1% [NaN₃], para reduzir a aglomeração; ver Tabela de Materiais), conforme descrito abaixo.
   1. Aspirar e descartar os meios atuais em cada poço. Dispense 5 mL de PBS em cada poço para lavar as células. Aspirar e eliminar o PBS.
   2. Dispense 5 mL de tripsina em cada poço. Coloque o prato numa incubadora a 37 °C durante 3 minutos ou até que as células deixem de aderir ao prato. Devolver a placa ao gabinete de biossegurança e diluir as soluções celulares dispensando 5 ml de solução de DMEM em cada poço.
   3. Para cada poço, misture a solução pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes. Para cada poço, aspirar todo o meio e colocá-lo em um tubo cônico de 15 mL.
3. Centrifugar as células a 300 x g por 3 min para pastilha-las. Aspirar o meio, tomando cuidado para não aspirar as células e descartá-lo. Em cada tubo, ressuspenda as células em 5 mL de solução tampão FACS, misturando suavemente pipetando para cima e para baixo.
4. Passe cada solução de suspensão celular através de um filtro (para remover aglomerados) em tubos cônicos separados de citometria de fluxo. Mantenha esses tubos no gelo por no máximo 1 h e realize citometria de fluxo o mais rápido possível.

4. Realização de citometria de fluxo

NOTA: Operar um citômetro de fluxo requer treinamento adequado e conhecimento das tarefas necessárias. Como o software e o equipamento podem variar e os usuários devem ser treinados em geral, esta seção refere-se a operações específicas que são úteis para executar.

1. Primeiro, examine as células transfectadas com o controle do plasmídeo de carga (sem controle de cor) para selecionar as características celulares e evitar anomalias (incluindo agregados, detritos, etc.). Embora existam muitas combinações de parâmetros para distinguir células, use as três opções gerais a seguir como uma boa maneira de visualizar características distintivas.
   1. Observe a área de dispersão lateral (log ou escala linear por preferência/tipo de célula) versus a área de dispersão direta (escala linear).
   2. Observe a altura da dispersão lateral (escala logarítmica) versus a largura da dispersão lateral (escala linear).
   3. Observe a largura de dispersão para frente (escala linear) versus a altura de dispersão para frente (escala linear).
2. Em seguida, observe os controles de cor única. Use o controle de todas as cores para sintonizar as tensões do instrumento, de modo que os sinais de cada proteína fluorescente sejam normalizados para unidades arbitrárias equivalentes (u.a.) de fluorescência. Em seguida, execute os controles de cor única para cada proteína fluorescente, que são usados para definir a matriz de compensação, permitindo a correção de sangria.
   NOTA: Idealmente, o intervalo dinâmico completo dos valores de fluorescência deve estar visível. A normalização adicional dos sinais de proteínas fluorescentes pode ser feita através da conversão para unidades padronizadas ( por exemplo, moléculas de fluoresceína equivalente [MEFLs; ver Beal et ^al.15]). Para habilitar a conversão de MEFL durante a análise, execute contas de calibração do arco-íris. Essa calibração também é útil para reduzir a variação instrumental e do sinal do dia-a-dia¹⁶.
3. Execute o tubo de amostra de politransfecção.
   NOTA: Sempre que possível, recomenda-se executar células de 1.000 x 10^ (^ = misturas), pois as politransfecções de dimensões mais altas precisam ser subdivididas em mais compartimentos durante a análise, e cada compartimento precisa de células suficientes (idealmente >10) para fazer comparações estatisticamente significativas.

5. Realização de análise pós-experimento

1. Inicialmente, use os dados dos controles (e, se aplicável, das contas) para garantir resultados precisos. Use uma das ferramentas de software disponíveis para realizar o fechamento de células vivas (usando portões descritos acima), compensação e correção de autofluorescência.
   NOTA: Normalmente, usamos código MATLAB personalizado (por exemplo, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis ou Cytoflow¹⁷), que tem uma interface gráfica do usuário e uma biblioteca python adequada para a fase de pré-processamento e para análise de politransfecção.

Método	Complexo	ng Marcador fluorescente	ng L7ae (fração)	ng Repórter (fração)	ng Filler DNA (fração)	Total (ng)
Politransfecção 1						600
→	1	150	75 (½)		75 (½)	300
→	2	150		75 (½)	75 (½)	300
Politransfecção 2						600
→	1	150	25 (1/6)		125 (5/6)	300
→	2	150		125 (5/6)	25(1/6)	300

Tabela 2: Quantidades de DNA para politransfecção demonstradas no protocolo e um exemplo de experimento de acompanhamento com proporções de plasmídios sintonizados. A metade superior da tabela mostra a composição dos plasmídeos usados em um experimento simples de politransfecção. A metade inferior mostra a composição de um experimento atualizado que ajusta as razões de plasmídios para melhor subamostrar um espaço de concentração hipotético, onde o modulador de expressão gênica está em uma proporção mais ótima de 1:5 em relação ao seu repórter, produzindo mais células transfectadas para amostragem em torno dessa razão.

Resultados

Na Figura 1, comparamos a co-transfecção com a politransfecção. Em uma co-transfecção, todos os plasmídeos são liberados na mesma mistura de transfecção, resultando em alta correlação entre a quantidade de cada plasmídeo que uma única célula recebe (Figura 1A). Enquanto o número de plasmídeos totais entregues a cada célula varia significativamente, a fluorescência das duas proteínas repórteres nas células individuais em toda a população e...

Discussão

Métodos de prototipagem rápida, como CAD (computer-aided design), protoboard e impressão 3D, revolucionaram as disciplinas de engenharia mecânica, elétrica e civil. A capacidade de pesquisar rapidamente muitas soluções possíveis para um determinado desafio acelera muito o progresso em um campo. Acreditamos que a politransfecção é uma tecnologia análoga para a engenharia biológica, permitindo a prototipagem rápida de circuitos genéticos. Além disso, outras tecnologias de prototipagem rápida requerem itera...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI