Быстрое развитие схем идентификации состояния клеток с помощью политрансфекции

Резюме

Сложные генетические схемы требуют много времени для проектирования, тестирования и оптимизации. Чтобы облегчить этот процесс, клетки млекопитающих трансфицируются таким образом, чтобы можно было тестировать несколько стехиометрий компонентов схемы в одной лунке. В этом протоколе описаны этапы планирования экспериментов, трансфекции и анализа данных.

Аннотация

Генетические схемы млекопитающих продемонстрировали потенциал для обнаружения и лечения широкого спектра болезненных состояний, но оптимизация уровней компонентов цепи остается сложной и трудоемкой. Чтобы ускорить этот процесс, наша лаборатория разработала политрансфекцию, высокопроизводительное расширение традиционной трансфекции млекопитающих. При политрансфекции каждая клетка в трансфицированной популяции по существу выполняет свой эксперимент, проверяя поведение схемы при разных числах копий ДНК и позволяя пользователям анализировать большое количество стехиометрий в реакции с одним горшком. До сих пор были продемонстрированы политрансфекции, которые оптимизируют соотношения трехкомпонентных цепей в одной яме ячеек; В принципе, тот же метод можно использовать для разработки еще более крупных схем. Результаты политрансфекции могут быть легко применены для поиска оптимальных соотношений ДНК и котрансфекта для переходных цепей или для выбора уровней экспрессии компонентов схемы для генерации стабильных клеточных линий.

Здесь мы демонстрируем использование политрансфекции для оптимизации трехкомпонентной схемы. Протокол начинается с принципов экспериментального дизайна и объясняет, как политрансфекция основывается на традиционных методах совместной трансфекции. Далее проводится политрансфекция клеток с последующей проточной цитометрией через несколько дней. Наконец, данные анализируются путем изучения срезов данных одноклеточной проточной цитометрии, которые соответствуют подмножествам клеток с определенными соотношениями компонентов. В лаборатории политрансфекция использовалась для оптимизации клеточных классификаторов, контроллеров обратной связи и прямой связи, бистабильных мотивов и многого другого. Этот простой, но мощный метод ускоряет циклы проектирования сложных генетических схем в клетках млекопитающих.

Введение

Область синтетической биологии млекопитающих быстро прогрессировала: от разработки простых частей восприятия и ответа в культивируемых клеточных линиях до оптимизации сложных сетей генов для решения реальных проблем в диагностике и терапии¹. Эти сложные схемы способны воспринимать биологические входы от профилей микроРНК до цитокинов и низкомолекулярных лекарств, а также реализовывать схемы логической обработки, включая транзисторы, полосовые фильтры, тумблеры и осцилляторы. Они также показали многообещающие результаты на животных моделях таких заболеваний, как рак, артрит, диабет и многих других 1,2,3,4,5. Однако по мере роста сложности схемы оптимизация уровней каждого из ее компонентов становится все более сложной задачей.

Одним из особенно полезных типов генетической схемы является классификатор клеток, который может быть запрограммирован на восприятие и реагирование на клеточные состояния. Селективная продукция белков или выходов РНК в определенных клеточных состояниях является мощным инструментом для направления и программирования дифференцировки клеток и органоидов, выявления и уничтожения больных клеток и/или нежелательных типов клеток, а также регулирования функции терапевтических клеток 1,2,3,4,5 . Однако создание схем в клетках млекопитающих, которые могут точно классифицировать клеточные состояния из нескольких клеточных видов РНК и / или белков, было очень сложной задачей.

Одним из наиболее трудоемких этапов разработки схемы классификации клеток является оптимизация относительных уровней экспрессии отдельных генов компонентов, таких как датчики и факторы обработки, в схеме. Чтобы ускорить оптимизацию схем и позволить строить более сложные схемы, в недавних работах использовалось математическое моделирование схем классификаторов ячеек и их компонентов для прогнозирования оптимальных составов и топологий ^6,7. Несмотря на то, что до сих пор это показало мощные результаты, математический анализ ограничен необходимостью систематической характеристики поведения входа-вывода генов компонентов в схеме, что отнимает много времени. Кроме того, в сложных генетических схемах может возникнуть множество контекстно-зависимых проблем, в результате чего поведение полной схемы не поддается предсказаниям, основанным на характеристиках отдельных частей ^8,9.

Для более быстрой разработки и тестирования сложных схем млекопитающих, таких как классификаторы состояния клеток, наша лаборатория разработала метод, называемый политрансфекцией¹⁰, эволюцию протоколов плазмидной котрансфекции. При совместной трансфекции несколько видов плазмидной ДНК комплексируются вместе с положительно заряженным липидным или полимерным реагентом, а затем доставляются в клетки коррелированным образом (рис. 1A). При политрансфекции плазмиды отдельно образуют комплекс с реагентом, так что ДНК из каждого трансфекционного комплекса доставляется в клетки декоррелированным образом (рис. 1B). Используя этот метод, клетки в трансфицированной популяции подвергаются воздействию многочисленных комбинаций соотношений двух или более полезных нагрузок ДНК, несущих различные компоненты схемы.

Для измерения соотношений компонентов цепи, доставляемых в каждую ячейку, каждый трансфекционный комплекс в политрансфекции содержит конститутивно экспрессируемый флуоресцентный репортер, который служит прокси для клеточного поглощения комплекса. ДНК-наполнитель, которая не содержит каких-либо элементов, активных в клетке млекопитающих, используется для настройки относительного количества флуоресцентного репортера и компонентов схемы, доставляемых в клетку в одном трансфекционном комплексе, и более подробно обсуждается в обсуждении. Примером ДНК-наполнителя, используемой в лаборатории Вайса, является плазмида, содержащая последовательность терминатора, но без промотора, кодирующей последовательности и т. д. Затем можно сравнить клетки с различными соотношениями компонентов цепи, чтобы найти оптимальные соотношения для функции генной цепи. Это, в свою очередь, дает полезные прогнозы для выбора промоторов и других элементов схемы для достижения оптимальных уровней экспрессии генов при объединении компонентов схемы в единый вектор для генетической интеграции (например, лентивирус, транспозон или посадочная площадка). Таким образом, вместо того, чтобы выбирать соотношения между компонентами схемы на основе интуиции или с помощью трудоемкого процесса проб и ошибок, политрансфекция оценивает широкий спектр стехиометрий между генетическими частями в реакции с одним горшком.

В нашей лаборатории политрансфекция позволила оптимизировать многие генетические схемы, включая классификаторы клеток, контроллеры обратной связи и прямой связи, а также бистабильные мотивы. Этот простой, но мощный метод значительно ускоряет циклы проектирования сложных генетических схем в клетках млекопитающих. С тех пор политрансфекция использовалась для характеристики нескольких генетических цепей, чтобы выявить их многомерные функции передачи ввода-вывода с высоким разрешением¹⁰, оптимизировать альтернативную топологию схемы для классификации состояния клетки 11 и ускорить различные опубликованные^12,13 и текущие проекты.

Здесь мы описываем и изображаем рабочий процесс использования политрансфекции для быстрой оптимизации генетической цепи (рис. 2). Протокол показывает, как генерировать высококачественные данные политрансфекции и избежать нескольких распространенных ошибок в протоколе политрансфекции и анализе данных (рис. 3). Затем он демонстрирует, как использовать политрансфекцию для характеристики простых компонентов схемы и, в процессе, сравнивать результаты политрансфекции с совместной трансфекцией (рис. 4). Наконец, результаты политрансфекции показывают оптимизацию схемы классификатора рака (рис. 5).

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Таблицы 1 и 2 служат важными ссылками для этого протокола. В таблице 1 показано масштабирование реагентов для реакций, а в таблице 2 показана арифметика соотношения ДНК для примера политрансфекции, описанной в протоколе (верхняя половина), и для возможного последующего эксперимента (нижняя половина).

1. Подготовка клеток к трансфекции

1. Перед началом протокола убедитесь, что культура эмбриональных клеток почек человека (HEK293) сливается на 60-80%. Для этого за 2 дня до этого высевают 1 x 10⁶ клеток в чашку Петри для культуры тканей размером 100 мм x 15 мм и инкубируют при 37 °C с 5%_CO2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя наш протокол фокусируется на клетках HEK293, другие типы клеток могут быть заменены.
2. Подготовьте среду и клетки к трансфекции, как описано ниже.
   1. Предварительно подогрейте не менее 20 мл раствора модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) с 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS) и 1% заменимыми аминокислотами (NEAA; см. Таблицу материалов) до 37 °C. Предварительно подогрейте не менее 2,4 мл трипсина и 2,4 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) до 37 ° C. Предварительно подогрейте среднюю сыворотку до ~16 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы по культивированию тканей должны выполняться с осторожностью в шкафу биобезопасности.
3. Ресуспендируйте клетки в растворе DMEM, как описано ниже.
   1. Аспирировать и утилизировать текущие носители. Нанесите 2 мл PBS на культуру клеток HEK293 для промывки клеток. Аспирируйте и утилизируйте PBS.
   2. Распределите 2 мл трипсина на клеточную культуру HEK293. Поместите чашку Петри в инкубатор при температуре 37 °C на 3 минуты или до тех пор, пока клетки не перестанут прилипать к чашке. Верните блюдо в шкаф биобезопасности и разбавьте клеточный раствор, дозировав 8 мл раствора DMEM в тарелку.
   3. Смешайте раствор, аккуратно пипетируя вверх и вниз несколько раз. Аспирируйте все носители и поместите их в коническую пробирку объемом 15 мл.
4. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 3 мин, чтобы гранулировать их. Аспирируйте носитель (стараясь не аспирировать клетки) и выбросьте его. Ресуспендируют клетки в 5 мл раствора DMEM, перемешивая, осторожно пипетируя вверх и вниз.
5. Оцените текущую концентрацию ячеек с помощью автоматизированного счетчика ячеек (приведенного в таблице материалов). Засейте шесть лунок (в этом примере) в 24-луночную тарелку с 1 x 10⁵ ячейками (для плотности посева 50 000 ячеек/^см2).
6. Добавьте раствор DMEM до 500 мкл (сначала добавьте раствор DMEM в лунки), а затем пометьте одну лунку на каждую обработку следующим образом: без контроля цвета, контроль mKO2, контроль TagBFP, контроль NeonGreen, контроль цвета и политрансфекция 1. Контрольные лунки TagBFP, mKO2 и NeonGreen представляют собой одноцветные регуляторы для всех флуоресцентных белков, включенных в политрансфекцию.

2. Выполнение трансфекции

1. Подготовьте пробирки для каждого агрегата ДНК. Отложите в сторону пробирки для микроцентрифуг объемом 1,5 мл и пометьте пробирки как: без контроля цвета, контроль mKO2, контроль TagBFP, контроль NeonGreen, контроль всего цвета, смесь политрансфекции 1 и смесь политрансфекции 2.
   1. Добавьте 36 мкл восстановленной сывороточной среды в контрольную камеру без цвета, контроль mKO2, контроль TagBFP, контроль NeonGreen и все пробирки для контроля цвета. Добавьте 18 мкл восстановленной сывороточной среды в каждую из пробирок для политрансфекционной смеси 1 и политрансфекционной смеси 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предполагается, что концентрация плазмиды составляет 150 нг/мкл.
   2. Добавьте 600 нг плазмиды-наполнителя в пробирку без контроля цвета. Добавьте 300 нг мКО2 и 300 нг плазмиды-наполнителя в цветную контрольную трубку мКО2. Добавьте 300 нг TagBFP и 300 нг плазмиды-наполнителя в пробирку для контроля цвета TagBFP.
   3. Добавьте 300 нг конститутивной плазмиды NeonGreen и 300 нг плазмиды-наполнителя в цветную контрольную трубку NeonGreen. Добавьте по 100 нг mKO2, TagBFP и конститутивного NeonGreen, а также 300 нг плазмиды-наполнителя в контрольную трубку для всех цветов.
   4. Добавьте 150 нг мКО2 в 1 пробирку для политрансфекционной смеси. Добавьте 75 нг репортерной плазмиды NeonGreen и 75 нг плазмиды-наполнителя в пробирку политрансфекционной смеси 1.
   5. Добавьте 150 нг TagBFP в пробирку для политрансфекционной смеси 2. Добавьте 75 нг плазмиды L7ae и 75 нг плазмиды-наполнителя в пробирку с политрансфекционной смесью 2.
2. Создайте мастер-смесь для трансфекции в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, объединив 216 мкл восстановленной сывороточной среды с 9,48 мкл реагента для трансфекции (см. Таблицу 1 для соотношения реагентов и масштабирования реакции). Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз, и отложите в сторону.
3. Добавьте 1,58 мкл реагента-усилителя в каждую из пробирок без контроля цвета, одного контроля цвета и всех пробирок для контроля цвета. Добавьте 79 мкл реагента-усилителя в каждую из пробирок с политрансфекционной смесью. Смешайте каждую трубку по отдельности, энергично пипетируя.
4. Добавьте мастер-смесь трансфекции в каждую пробирку, содержащую ДНК.
   1. Добавьте 37,58 мкл мастер-смеси трансфекции в каждую из трубок без контроля цвета, контроля одного цвета и всех трубок контроля цвета. Смешайте каждую трубку по отдельности, энергично пипетируя.
   2. Добавьте 18,79 мкл смеси для трансфекции в каждую из пробирок смеси для политрансфекции. Смешайте каждую трубку по отдельности, энергично пипетируя.
5. Распределите смеси для трансфекции в лунки.
   1. Пипетка 65,97 мкл каждой смеси для трансфекции для бесцветных, одноцветных и всех элементов управления цветом в соответствующие лунки.
   2. Пипеткой 32,98 мкл политрансфекции смешайте 1 в лунку для политрансфекции и быстро, но осторожно закрутите пластину плотной восьмеркой вдоль плоской поверхности для эффективного распределения комплексов. Затем пипетку 32,98 мкл политрансфекционной смеси 2 помещают в ту же лунку для политрансфекции и таким же образом перемешивают пластину.
6. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C, с 5% CO₂ и без встряхивания, на 48 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения жизнеспособности клеток клеточную среду можно заменять каждые 6 ч после трансфекции (хотя это не всегда необходимо, а с клетками HEK293 и его производными нужно быть осторожным, чтобы не отсоединить клетки от пластины при смене среды).

Реагент	Количество			Масштабирование
Восстановленная сывороточная среда для смеси ДНК	36 мкл на контрольную трубку, 18 мкл на политрансфекционную трубку			0,05 мкл Снижение сывороточной среды/нг ДНК на пробирку с дополнительным объемом на 10-20% для учета пипетирования
ДНК	300-600 нг на тюбик
П3000	1,58 мкл на контрольную трубку, 0,79 мкл на политрансфекционную трубку			0,0022 мкл P3000/нг ДНК на пробирку, с 10-20% дополнительной
Уменьшенная сыворотка для мастер-микса Lipo	36 мкл на контрольную трубку, 18 мкл на политрансфекционную трубку			0,05 мкл снижал общую ДНК сывороточной среды/нг с дополнительным объемом на 10-20% для учета пипетки
Реагент для трансфекции и энхансера	1,58 мкл на контрольную трубку, 0,79 мкл на политрансфекционную трубку			0,0022 мкл ДНК липофектамина 3000 / нг, с 10-20% дополнительной

Таблица 1: Удаление накипи реагентами при трансфекциях. В таблице указано правильное соотношение реагента для включения количества ДНК, включенного в одну лунку. Это может быть использовано для эффективного масштабирования реакций и формирования мастер-смесей. Количество реагента было масштабировано, чтобы включить 20% избыток.

3. Подготовка клеток к проточной цитометрии

1. Предварительно подогрейте не менее 4,2 мл раствора DMEM до 37 °C. Предварительно нагрейте не менее 4,2 мл трипсина и 4,2 мл PBS до 37 °C. Храните буферный раствор для сортировки клеток, активируемого флуоресценцией (FACS), при температуре 4 °C до готовности к использованию.
2. Ресуспендируют клетки в буферном растворе FACS (PBS с добавлением 1% BSA, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА] и 0,1% азида натрия [NaN₃], чтобы уменьшить комкование; см. Таблицу материалов), как описано ниже.
   1. Аспирируйте и утилизируйте текущую среду в каждой скважине. Распределите по 5 мл PBS в каждую лунку, чтобы промыть клетки. Аспирируйте и утилизируйте PBS.
   2. Распределите по 5 мл трипсина в каждую лунку. Поместите тарелку в инкубатор при температуре 37 °C на 3 минуты или до тех пор, пока ячейки не перестанут прилипать к блюду. Верните пластину в шкаф биобезопасности и разбавьте клеточные растворы, дозировав 5 мл раствора DMEM в каждую лунку.
   3. Для каждой лунки перемешайте раствор, аккуратно пипетируя вверх и вниз несколько раз. Для каждой лунки аспирируйте всю среду и поместите ее в коническую пробирку объемом 15 мл.
3. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 3 мин, чтобы гранулировать их. Аспирируйте носитель, стараясь не аспирировать клетки и не выбрасывать их. В каждой пробирке ресуспендируют клетки в 5 мл буферного раствора FACS, перемешивая, осторожно пипетируя вверх и вниз.
4. Пропустите каждый раствор клеточной суспензии через ситечко (для удаления комков) в отдельные конические пробирки для проточной цитометрии. Держите эти пробирки на льду не более 1 часа и как можно скорее проведите проточную цитометрию.

4. Выполнение проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с проточным цитометром требует надлежащей подготовки и знания необходимых задач. Поскольку программное обеспечение и оборудование могут различаться, а пользователи должны быть обучены в целом, этот раздел относится к конкретным операциям, которые полезно выполнять.

1. Во-первых, исследуйте клетки, трансфицированные с помощью плазмиды-наполнителя (без контроля цвета), чтобы выбрать характеристики клеток и избежать аномалий (включая агрегаты, мусор и т. Д.). Несмотря на то, что существует множество комбинаций параметров для различения ячеек, используйте следующие три основных параметра в качестве хорошего способа визуализации отличительных признаков.
   1. Сравните область бокового рассеяния (логарифмическая или линейная шкала для предпочтения/типа ячейки) по сравнению с областью прямого рассеяния (линейная шкала).
   2. Сравните высоту бокового разброса (логарифмическая шкала) с шириной бокового разброса (линейная шкала).
   3. Сравните ширину прямого разброса (линейная шкала) с высотой прямого разброса (линейная шкала).
2. Затем посмотрите на одноцветные элементы управления. Используйте регулятор всех цветов для настройки напряжений прибора таким образом, чтобы сигналы от каждого флуоресцентного белка нормализовались до эквивалентных произвольных единиц (а.е.) флуоресценции. Затем запустите элементы управления одним цветом для каждого флуоресцентного белка, которые используются для установки компенсационной матрицы, позволяющей корректировать просачивание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале должен быть виден полный динамический диапазон значений флуоресценции. Дальнейшая нормализация сигналов флуоресцентных белков может быть осуществлена путем преобразования в стандартизированные единицы (например, молекулы эквивалентного флуоресцеина [MEFLs; см. Beal et ^al.15]). Чтобы включить преобразование MEFL во время анализа, запустите радужные калибровочные шарики. Такая калибровка также полезна для уменьшения колебаний сигнала от прибора к прибору и в повседневной^жизни16.
3. Запустите пробирку с образцом политрансфекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Там, где это возможно, рекомендуется запускать ячейки размером 1,000 x 10^ (^ = смеси), так как политрансфекции более высокой размерности должны быть разделены на большее количество ячеек во время анализа, и каждая ячейка нуждается в достаточном количестве ячеек (в идеале >10) для проведения статистически значимых сравнений.

5. Проведение анализа после эксперимента

1. Первоначально используйте данные с элементов управления (и, если применимо, бусин), чтобы обеспечить точные результаты. Используйте один из доступных программных инструментов для выполнения стробирования живых клеток (с использованием ворот, описанных выше), компенсации и коррекции автофлуоресценции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы используем либо пользовательский код MATLAB (например, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis или Cytoflow¹⁷), который имеет как графический пользовательский интерфейс, так и библиотеку Python, подходящую как для фазы предварительной обработки, так и для анализа политрансфекции.

Метод	Сложный	нг флуоресцентный маркер	нг L7ae (фракция)	нг Репортер (дробь)	ng ДНК наполнителя (фракция)	Всего (нг)
Политрансфекция 1						600
→	1	150	75 (½)		75 (½)	300
→	2	150		75 (½)	75 (½)	300
Политрансфекция 2						600
→	1	150	25 (1/6)		125 (5/6)	300
→	2	150		125 (5/6)	25(1/6)	300

Таблица 2: Количество ДНК для политрансфекции, продемонстрированное в протоколе, и пример последующего эксперимента с настроенными соотношениями плазмид. В верхней половине таблицы показан состав плазмид, используемых в простом эксперименте по политрансфекции. Нижняя половина показывает состав обновленного эксперимента, который регулирует соотношения плазмид для лучшей выборки гипотетического пространства концентрации, где модулятор экспрессии генов находится в более оптимальном соотношении 1:5 по отношению к его репортеру, что дает больше трансфицированных клеток для выборки вокруг этого соотношения.

Результаты

На рисунке 1 мы сравниваем котрансфекцию с политрансфекцией. При совместной трансфекции все плазмиды доставляются в одну и ту же смесь для трансфекции, что приводит к высокой корреляции между количеством каждой плазмиды, получаемой любой отдельной клеткой (?...

Обсуждение

Методы быстрого прототипирования, такие как автоматизированное проектирование (САПР), макетирование и 3D-печать, произвели революцию в механических, электрических и гражданских инженерных дисциплинах. Возможность быстрого поиска среди множества возможных решений данной проблемы зна?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI