Canlı Sıçanlardan Nöral Kök Hücrelerin ve Oligodendrosit Progenitör Hücrelerin İzolasyonuna Yönelik "Beyin Sağım" Yöntemi

Özet

Canlı sıçanların beyinlerinden nöral kök hücrelerin ve oligodendrosit progenitör hücrelerinin izolasyonu için bir yöntem burada deneysel olarak ayrıntılı olarak sunulmaktadır. Refahlarından ödün vermeden bu hücrelerin aynı hayvanlardan birden fazla toplanmasına izin verir.

Özet

Dokuya özgü nöral kök hücreler (NSC'ler) memeli doğum sonrası beyninde aktif kalır. Yeni nöronlar ve glia ürettikleri özel nişlerde bulunurlar. Böyle bir niş, lateral ventriküllerin lateral duvarları boyunca, ependimal hücre tabakasına bitişik olan subependimal bölgedir (SEZ; ventriküler-subventriküler bölge olarak da adlandırılır). Oligodendrosit progenitör hücreleri (OPC'ler), oligodendrositler üretebilen bir proliferatif progenitör hücre havuzu oluşturarak, merkezi sinir sistemi boyunca bol miktarda dağılmıştır.

Hem NSC'ler hem de OPC'ler kendi kendini yenileme potansiyeli ve sessizlik/aktivasyon döngüleri sergiler. Konumları nedeniyle, bu hücrelerin izolasyonu ve deneysel incelemesi postmortem olarak gerçekleştirilir. Burada, diğer hücrelerin yanı sıra NSC'lerin ve OPC'lerin canlı hayvanlardan izolasyonu için bir yöntem olan "beyin sağımını" ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu, kemirgenlerde kullanılmak üzere tasarlanmış ve sıçanlarda test edilmiş iki aşamalı bir protokoldür. İlk olarak, hücreler stereotaksik intraserebroventriküler (i.c.v.) bir "serbest bırakma kokteyli" enjeksiyonu yoluyla dokudan "salınır". Ana bileşenler, ependimal hücreleri hedef alan ve ventriküler duvar denudasyonunu indükleyen nöraminidaz, bir integrin-β1-bloke edici antikor ve fibroblast büyüme faktörü-2'dir. İkinci bir "toplama" adımında, beyin omurilik sıvısının sıvı biyopsileri, anestezi uygulanmış sıçanlarda bir insizyona gerek kalmadan cisterna magna'dan gerçekleştirilir.

Burada sunulan sonuçlar, izole hücrelerin endojen profillerini koruduğunu ve SEZ'in NSC'lerinin sessizliklerini koruduğunu göstermektedir. Ependimal tabakanın denüdasyonu, enjeksiyonun anatomik seviyesi ile sınırlıdır ve protokol (serbest bırakma ve toplama) hayvanlar tarafından iyi tolere edilir. Bu yeni yaklaşım, deney hayvanlarında endojen nörojenez ve gliogenez ile ilgili uzunlamasına çalışmaların yapılmasının yolunu açmaktadır.

Giriş

Dokuya özgü kök hücreler, ilgili dokuları oluşturan tüm hücre popülasyonlarına yol açabilen kısmen bağlı hücrelerdir. Multipotent olmalarının yanı sıra, kendi kendini yenileyen hücrelerdir ve homeostazı ve dokuların rejeneratif kapasitesini korumak için çok önemlidir¹. Bazı dokuya özgü kök hücreler, bağırsak veya hematopoetik kök hücreler gibi aktif, güçlü bir şekilde proliferatif bir durumda kalır. Beyin kök hücreleri gibi diğerleri büyük ölçüde hareketsiz veya uykuda kalır². Yetişkin beyninde, nöral kök hücreler (NSC'ler), genellikle niş adı verilen özel alanlarda bulunabilir. Lateral ventriküllerin subependimal bölgesinde (SEZ) ve hipokampusun dentat girusunda bu kadar iyi tanımlanmış iki alan bulunur. SEZ nişi, başta koku soğancıklarına doğru göç eden ve yerel internöron popülasyonuna katkıda bulunan nöroblastlar olmak üzere en yüksek sayıda hücre üretir; Buna karşılık, üretilen oligodendroblastlar bitişik korpus kallozuma (CC) göç ^eder3. Oligodendrosit progenitör hücreleri (OPC'ler), merkezi sinir sistemi boyunca yaygın olarak dağılmış mitotik olarak aktif hücrelerdir: i) oligodendroglial soya bağlıdır, ii) demiyelinizasyon bölgelerine göç edebilir ve iii) miyelinizan oligodendrositlere farklılaşabilir. OPC'ler ayrıca kendini yenileme potansiyeli ve sessizlik sergiler⁴.

Şimdiye kadar, NSC'lerin ve OPC'lerin izolasyonu ve çalışması, diseke beyin ve omurilik dokusunun postmortem ayrışmasını gerektiriyordu. Bu deneysel sınırlamayı aşmak için, ilk kez beyin NSC'lerinin ve OPC'lerinin canlı hayvanlardan izole edilmesine izin veren bir yöntem oluşturduk. Bu yönteme "sağım" diyoruz, çünkü havuzları tükenmediği için birden fazla hücre toplanmasına olanak tanır. Protokol, büyük beyin boyutlarından dolayı, esas olarak SEZ veya CC'yi hedef alan sıçanlarda geliştirilmiştir ve iki ana adım içermektedir. İlk olarak, NSC'ler veya OPC'ler, nöraminidaz içeren bir "salım kokteyli", ventriküler duvar denudasyonunu indükleyen bir toksin, bir integrin-β1-bloke edici antikor ve fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) içeren bir "salım kokteyli" enjeksiyonu yoluyla dokudan "çıkarılır". Kokteyl, lateral ventriküller içinde bilateral olarak stereotaksik olarak enjekte edilir. Kullanım amacı NSC'lerin izolasyonu ise, lateral ventriküllerin rostral alanları hedeflenir. Amaç OPC'leri daha saf bir şekilde izole etmekse, kokteyl hipokampal fimbria bölgesine kaudal olarak enjekte edilir. İkinci bir "toplama" adımında, beyin omurilik sıvısının (BOS) sıvı biyopsileri, anestezi uygulanmış sıçanların sarnıç magnasından bir insizyona gerek kalmadan gerçekleştirilir. Likit biyopsi NSC kültür besiyeri ile karıştırılır ve kaplamaya kadar 4 °C'de tutulabilir.

Protokol

Hayvan ıslahı, bakımı ve deneysel prosedürler, İçişleri Bakanlığı tarafından yetkilendirilen 1986 tarihli Birleşik Krallık Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası ve Yunanistan Cumhuriyeti'nin 56/2013 sayılı Başkanlık Kararnamesi uyarınca yürütülmüş, Cambridge ve Patras Üniversitelerinin Hayvan Refahı ve Etik İnceleme Organları tarafından incelenmiş ve yerel Valilik Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve incelenmiştir (Protokol numarası: 5675/39/18-01-2021). Yaşları 2 ile 4 ay arasında değişen ve vücut ağırlıkları 150 g ile 250 g arasında olan erkek ve dişi Sprague-Dawley, Wistar ve Long-Evans sıçanları kullanıldı. Protokol, Şekil 1'de grafiksel olarak özetlenmiştir.

1. Kokteyl hazırlığını serbest bırakın

NOT: İşlem günü taze olarak hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Miktarlar, her bir lateral ventriküle enjekte edilecek 2 μL başına i.c.v. başına verilir. Amaçlanan enjeksiyon başına ek 1 μL hazırlayın.

1. Clostridium perfringens'ten (Clostridium welchii) 0.5 μL 500 mU nöraminidaz hazırlayın.
   NOT: Bunu -1 °C'de steril suda seyreltilmiş 20 U/μL stok olarak saklayın. Diğer nöraminidaz türleri test edilmemiştir.
2. 1 μg integrin-β1-bloke edici antikor içeren 1 μL hazırlayın.
   NOT: 4 °C'de saklayın.
3. 0.5 μg bazik fibroblast büyüme faktörü (rekombinant insan FGF-bazik) içeren 0.5 μL hazırlayın.
   NOT: -20 °C'de steril suda seyreltilmiş 1 μg/μL stok olarak saklayın.

2. Serbest bırakma kokteyli enjeksiyonu

NOT: Tüm işlem 20 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Ameliyatı aseptik koşullarda yapmaya özen gösterin. Tüm yüzeyleri antiseptik ile temizleyin (örneğin, %3 veya %6 hidrojen peroksit). Otoklavlanmış veya kolayca steril aletler, eldivenler, önlükler ve örtüler kullanın.

1. Deney hayvanını izofluran inhalasyonu ile uyuşturun (indüksiyon için% 2.5 ve% 2 idame). Kornea refleksini, uyaranlara tepkiyi (arka bacak ve kuyruk sıkışma testi) ve solunum modunu kontrol ederek anestezi derinliğini onaylayın.
   NOT: Cerrahi prosedürler, intraperitoneal olarak enjekte edilebilir anestezi ile indüklenen genel anestezi altında yapılabilir (ör., ketamin [40 mg / kg] ve ksilazin [10 mg / kg]). Derin anestezi, kornea refleksi, uyaranlara tepki (arka bacak ve kuyruk sıkışma testi) ve solunum şekli kontrol edilerek doğrulandı.
2. Anestezi indüksiyonu üzerine subkutan analjezi uygulayın (ör., 0.3 mg / mL buprenorfin).
3. Fareyi stereotaksik çerçeveye monte edin.
4. Başın kürkünü bir ustura ile tıraş edin ve cildi% 10 povidon-iyot çözeltisi ve ardından alkol gibi antiseptiklerle temizleyin. Steril pamuklu çubuklar kullanarak antiseptiği üç kez uygulayın. Her seferinde 3-5 saniye dairesel hareketlerle ovalayın. Kuruluğu önlemek için göz merhemi sürün.
5. Steril bir neşter kullanarak orta çizgi boyunca başın derisinde 2 cm'lik bir kesi yapın.
6. Steril bezler ve steril salin kullanarak kafatasını titizlikle temizleyin.
7. Stereotaksik cihaza monte edilmiş 10 μL'lik bir Hamilton şırıngasının iğnesinin kenarını kullanarak bregmayı tanımlayın. Bregma'yı "nokta 0,0" olarak ayarlayın.
   NOT: Bregma, sagital ve koronal sütürler arasındaki kesişme noktası olarak tanımlanır. Daha fazla ayrıntı Paxinos ve Watson^5'in sıçan beyni atlasında bulunabilir.
8. Cihazı ön arka (AP) = 0.3 mm, yanal (L) = +1.2 mm (SEZ'yi hedeflemek için) veya AP = 1.5 mm, L = +2.0 mm (CC'yi hedeflemek için) koordinatlarına taşıyın.
9. Bir diş matkabı kullanarak 1 mm'lik bir çapak deliği açın.
   NOT: Elle delerken, kortikal yüzeye zarar vermemeye dikkat edin. Kanamanın önemli olması beklenmez. Kanı tuzlu suyla temizleyin ve daha kalıcı kanamayı durdurmak için basınç uygulayın.
10. 10 μL'lik Hamilton şırıngasına 4 μL serbest bırakma kokteyli yükleyin.
11. Dura ile temas etmek için Hamilton şırıngasının iğnesini (tercihen künt veya konik kenar) indirin.
12. İğneyi istenen derinlikte (D = 3,5 mm) yerleştirin.
    NOT: Dokuyu nemli tutmak için dura yüzeyine salin dökün.
13. 2 μL salım kokteylini 1 μL/dk oranında infüze edin.
14. Serbest bırakma kokteylinin yüzeye çıkmasını önlemek için yavaş alımdan önce iğneyi 2 dakika daha yerinde bırakın.
15. AP = 0,3 mm, L = -1,2 mm (SEZ'yi hedeflemek için) veya AP = 1,5 mm, L = -2,0 mm (CC'yi hedeflemek için) koordinatlarındaki diğer yarım küre için 2.8-2.14 adımlarını tekrarlayın.
16. Kesiyi 5-0 naylon (çap 0,1 mm) ile dikin ve dikişli bölgeyi antiseptik ile temizleyin.
17. Anestezik sağlayan maskeyi çıkarın ve hayvanı operasyon sonrası izleme alanına aktarın.
    NOT: Anesteziden iyileşme ve yaslanmanın sürdürülmesi 5-10 dakika içinde ve tam iyileşme (normal davranış) 25 dakika içinde gerçekleşmelidir.
    1. İyi ısıtılmış (24-25 °C), hava yollarını tıkayabilecek küçük parçacıklı yatakların olmadığı sessiz bir alanda iyileşmeyi (canlı ve kesintisiz hareket, suya sık erişim) yakından izleyin. Hayvanı kafes arkadaşlarının şirketine (yeni hayvanlara değil) ancak tam iyileşmeyi onayladıktan sonra iade edin.
    2. Ameliyattan sonra hayvanı bakım tesisinde en az 48 saat izleyin. Analjezi (örneğin, 0.3 mg / mL buprenorfin, deri altı) uygulayarak ağrı belirtilerini (başın gizlenmesi, anormal baş veya vücut duruşu, aşırı duyarlılık ve aşırı uyarılabilirlik) ele alın. Rengi solmuş veya kürkü dikilmiş hayvanları sorumlu veterinere yönlendirin.

3. Beyin omurilik sıvısı (BOS) sıvı biyopsisi

NOT: Tüm işlem 10 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Burada tarif edilen sıvı biyopsi, salım kokteylinin enjeksiyonundan 3 gün sonra gerçekleştirilir, ancak gerektiğinde tam olarak aynı şekilde yapılabilir. Ameliyatı aseptik koşullarda yapmaya özen gösterin. Tüm yüzeyleri antiseptik (örn. %3 veya %6 hidrojen peroksit) ile temizleyin. Otoklavlanmış veya kolayca steril aletler, eldivenler, önlükler ve örtüler kullanın.

1. Hayvanı izofluran inhalasyonu ile uyuşturun (indüksiyon için% 2.5 ve bakım için% 2). Korneayı kontrol ederek anestezi derinliğini onaylayın
   refleks, uyaranlara tepki (arka bacak ve kuyruk sıkışma testi) ve solunum şekli.
   NOT: Cerrahi prosedürler, intraperitoneal olarak enjekte edilebilir anestezi ile indüklenen genel anestezi altında yapılabilir (ör., ketamin [40 mg / kg] ve ksilazin [10 mg / kg]). Bununla birlikte, prosedür kısa olduğu için, özellikle biyopsiler ardışık günlerde birden çok kez yapılacaksa, bu tavsiye edilmez.
2. Anestezi indüksiyonu üzerine subkutan analjezi uygulayın (ör., 0.3 mg / mL buprenorfin).
3. Deney hayvanını stereotaksik çerçeveye monte edin. Öne ve arkaya doğru dönme hareketini engellemeden kafayı sabitlemek için kulak çubuklarını kullanın.
4. Boynun arkasının iyi bir şekilde uzaması sağlanabilmesi için kafayı aşağı doğru 40° açıyla sabitleyin.
   NOT: Bunu yapmanın bir yolu, cihazın^{ağız çubuğunu kullanmaktır 6}.
5. Bir jilet kullanarak boyun bölgesindeki kürkü tıraş edin ve cildi% 10 povidon-iyot çözeltisi ve ardından alkol gibi antiseptiklerle temizleyin. Steril pamuklu çubuklar kullanarak antiseptiği üç kez uygulayın. Her seferinde 3-5 saniye dairesel hareketlerle ovalayın.
6. Parmak ucuyla, oksipital çıkıntı ile atlas^6'nın omurgası arasında yer alan eşkenar dörtgen şeklindeki bastırılabilir alanı bulun.
7. Bir nokta işareti çizin (örneğin, bir işaretleyici kullanarak).
8. Stereotaksik çerçeveye 1 mL veya 0.5 mL'lik bir şırınga sabitleyin.
   NOT: Daha iyi emiş sağladıkları ve daha az ölü hacme sahip oldukları için çıkarılamayan iğneli şırıngaların kullanılması tavsiye edilir.
9. İğneyi nokta işaretindeki cilt ile temas noktasına getirin.
10. Bir çift forseps ile, şırıngayı cilt katmanlarından indirirken cildi kaldırın.
11. Şırıngada negatif basınç oluşturmak için pistonu hafifçe geri çekin.
12. Şırıngada sıvı (BOS) görünene kadar iğneyi çok yavaş daldırmak için yeniden başlatın.
13. İğneyi bu pozisyona yerleştirin ve BOS'un yavaş akışına izin verin.
    NOT: BOS akışı çok yavaşsa iğne hafifçe alçaltılabilir veya yükseltilebilir.
14. BOS'u 120 μL'ye kadar yavaşça (40 μL/dk'lık adımlarla) çıkarmaya başlayın.
15. Şırıngayı yavaşça alın.
16. Deney hayvanının sıvı yenilenmesini desteklemek için intraperitoneal olarak 1 mL normal serum uygulayın.
17. Sıvı biyopsiyi (BOS) 400 μL NSC ortamı ile karıştırın ve mikrosantrifüj tüpünü daha fazla kullanana kadar 4 ° C'de tutun.
    NOT: Likit biyopsiler dondurulmamışsa 3 saat içinde işlenmelidir.
18. Anesteziyi sağlayan maskeyi çıkarın ve hayvanı operasyon sonrası izleme alanına aktarın.
    NOT: Anesteziden iyileşme ve yaslanmanın sürdürülmesi 5-10 dakika içinde ve tam iyileşme (normal davranış) 25 dakika içinde gerçekleşmelidir.
    1. İyi ısıtılmış (24-25 °C), hava yollarını tıkayabilecek küçük parçacıklı yatakların olmadığı sessiz bir alanda iyileşmeyi (canlı ve kesintisiz hareket, suya sık erişim) yakından izleyin. Hayvanı, ancak tam iyileşme onaylandıktan sonra kafes arkadaşlarının şirketine (yeni hayvanlara değil) iade edin.
    2. Ameliyattan sonra hayvanı bakım tesisinde en az 48 saat izleyin. Ağrı belirtileri (başın gizlenmesi, anormal baş veya vücut duruşu, aşırı duyarlılık ve aşırı uyarılabilirlik) gözlenirse, analjezi uygulayın (ör., deri altından 0.3 mg / mL buprenorfin). Rengi solmuş veya kürkü dikilmiş hayvanları sorumlu veterinere yönlendirin.

4. İmmünofloresan için dokunun işlenmesi

1. Hayvanı 20 mL buz gibi soğuk salinin intrakardiyal infüzyonu ve ardından 50 mL buz soğuk% 4 paraformaldehit (PFA; pH = 7.4 fosfat tamponlu salin [PBS] içinde) ile ötenazi yapın.
2. Beyin dokusunu inceleyin.
   1. Servikal bölgede bir kesim yapmak için makas kullanarak kafayı vücuttan ayırın. Cildi çıkarmak için makası kullanın ve ardından beyin dokusuna zarar vermemek için makasın uçları yukarı bakacak şekilde kafatasının kemiğini sagital orta hat boyunca kesin. Koronal orta çizgiyi geçerek mümkün olduğunca kesmeye devam etmeyi hedefleyin.
   2. Supraoksipital ve parietal kemiklerden ve son olarak frontal kemiklerden başlayarak kemikleri çıkarmak için forseps kullanın.
   3. Beyin dokusu ortaya çıktığında, kafatasından çıkarmak için forseps veya bir spatula kullanın. Bunu kolaylaştırmak için, istenmiyorsa beynin tabanındaki sinirleri ve koku soğancıklarını kesin.
3. Dokuyu gece boyunca 4 ° C'de% 2 PFA'da sabitleyin.
4. Dokuyu %30 sükroz (PBS'de) içinde 4 ° C'de en az 48 saat boyunca doku dibe çökene kadar kriyo ile koruyun.
5. Dokuyu -80 °C'de dondurun.
6. Beyin dokusunu bir kriyostat ile 14 μm kalınlığında koronal bölümlere kesin.
7. Standart protokolleri kullanarak immünofloresan boyama gerçekleştirin ^3,7
   1. Bölümleri bloke edici tampon (% 3 sığır serum albümini [BSA,,% 0.1 Triton X-100, PBS'de) ile oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
   2. Antijen alımını gerçekleştirin (10 mM sitrat tamponunda 15 dakika kaynatma, pH = 6.0, cam kavanozlar kullanarak).
      NOT: Bu adım isteğe bağlıdır, ancak nükleer antijenler için gereklidir.
   3. Oda sıcaklığına getirin ve 4 ° C'de gece boyunca bloke edici tamponda glial fibriler asidik protein (GFAP), doublecortin (Dcx), S100β ve β-katenine ( Malzeme Tablosuna bakınız) karşı birincil antikorlarla inkübe edin.
   4. Oda sıcaklığında nükleer karşı boyama için 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile PBS'de ikincil antikorlarla 2 saat inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
   5. Lamelleri monte edin.

5. İmmünofloresan için izole edilmiş hücrelerin işlenmesi

1. Hücreleri, poli-D-lizin (100 μg / mL) ile kaplanmış, mikroskopi için uyumlu 96 oyuklu plakalara yerleştirin.
2. Hücreleri buz gibi soğuk% 2 PFA'da 10 dakika sabitleyin ve 3x'i PBS ile yıkayın.
3. PDGFRa, GFAP, Dcx,^{SOX2 ve ID3} için standart prosedürleri ^3,7 kullanarak immünofloresan uygulayın (Malzeme Tablosuna bakın).
4. Hücreleri karanlıkta 4 ° C'de PBS + NaN_3'te (% 0.1) tutun.

6. Mikroskopi ve görüntü analizi

1. Epifloresan veya konfokal mikroskopi kullanarak görüntü alın ve hücre sayaçları gibi standart görüntü analizi yazılım araçlarını kullanarak hücre sayımları gerçekleştirin.

Sonuçlar

NSC'lerin serbest bırakılması ve toplanması
SEZ'in NSC'leri, BOS'tan sadece ependimal hücrelerin tek tabakası ile ayrılır, ancak enterkalasyon mono-siliyer süreçler yoluyla ventriküler içerikle doğrudan temas halinde kalırlar ^8,9. Nöraminidaz, sialik asit kalıntılarının bölünmesi yoluyla spesifik olarak ependimal hücrelere etki eder ve ventriküler duvarın denudasyonunu indükleyebilir. Bu, ventrikül y...

Tartışmalar

Kök ve progenitör hücreler, memeli beyin dokusunda nispeten seyrektir. Ek olarak, NSC'ler kolay ve güvenli biyopsiler için erişilemeyen alanlarda (ventriküler duvarlar, hipokampus) bulunur. Bu nedenle, şimdiye kadar bu tür hücrelerle deneysel olarak çalışmanın tek yolu, ölüm sonrası izolasyonları olmuştur. Sağım adı verilen, canlı sıçanlardan NSC'lerin ve OPC'lerin tek veya tekrarlanan toplanmasına izin veren bir yöntem burada adım adım açıklanmaktadır. Yöntem iki temel özelliğe dayanma...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX