Il metodo di "mungitura del cervello" per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti da ratti vivi

Riepilogo

Un metodo per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti dal cervello di ratti vivi è presentato qui in dettaglio sperimentale. Permette di raccogliere più cellule dagli stessi animali senza comprometterne il benessere.

Abstract

Le cellule staminali neurali tessuto-specifiche (NSC) rimangono attive nel cervello postnatale dei mammiferi. Risiedono in nicchie specializzate, dove generano nuovi neuroni e glia. Una di queste nicchie è la zona subependimale (SEZ; chiamata anche zona ventricolare-subventricolare), che si trova lungo le pareti laterali dei ventricoli laterali, adiacente allo strato cellulare ependimale. Le cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) sono abbondantemente distribuite in tutto il sistema nervoso centrale, costituendo un pool di cellule progenitrici proliferative che possono generare oligodendrociti.

Sia le NSC che le OPC mostrano un potenziale di auto-rinnovamento e cicli di quiescenza/attivazione. A causa della loro posizione, l'isolamento e l'indagine sperimentale di queste cellule viene eseguita post mortem. Qui descriviamo in dettaglio la "mungitura cerebrale", un metodo per l'isolamento di NSC e OPC, tra le altre cellule, da animali vivi. Si tratta di un protocollo in due fasi progettato per l'uso nei roditori e testato nei ratti. In primo luogo, le cellule vengono "rilasciate" dal tessuto tramite iniezione intracerebroventricolare stereotassica (i.c.v.) di un "cocktail di rilascio". I componenti principali sono la neuraminidasi, che prende di mira le cellule ependimali e induce la denudazione della parete ventricolare, un anticorpo bloccante l'integrina-β1 e il fattore di crescita dei fibroblasti-2. In una seconda fase di "raccolta" vengono eseguite biopsie liquide di liquido cerebrospinale dalla cisterna magna, in ratti anestetizzati senza necessità di incisione.

I risultati qui presentati mostrano che le cellule isolate mantengono il loro profilo endogeno e che le NSC della ZES conservano la loro quiescenza. La denudazione dello strato ependimale è limitata al livello anatomico dell'iniezione e il protocollo (rilascio e raccolta) è ben tollerato dagli animali. Questo nuovo approccio apre la strada all'esecuzione di studi longitudinali sulla neurogenesi endogena e sulla gliogenesi negli animali da esperimento.

Introduzione

Le cellule staminali tessuto-specifiche sono cellule parzialmente impegnate che possono dare origine a tutte le popolazioni cellulari che costituiscono i rispettivi tessuti. Oltre ad essere multipotenti, sono cellule che si autorinnovano e sono fondamentali per mantenere l'omeostasi e la capacità rigenerativa dei tessuti¹. Alcune cellule staminali tessuto-specifiche rimangono in uno stato attivo e fortemente proliferativo, come le cellule staminali intestinali o ematopoietiche. Altri, come le cellule staminali cerebrali, rimangono in gran parte quiescenti o dormienti². Nel cervello adulto, le cellule staminali neurali (NSC) possono essere trovate in aree specializzate, spesso chiamate nicchie. Due di queste aree ben descritte esistono nella zona subependimale (SEZ) dei ventricoli laterali e nel giro dentato dell'ippocampo. La nicchia SEZ genera il maggior numero di cellule, principalmente neuroblasti che migrano verso i bulbi olfattivi e contribuiscono alla popolazione interneuronale locale; al contrario, gli oligodendroblasti generati migrano verso l'adiacente corpo calloso (CC)³. Le cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) sono cellule mitoticamente attive, ampiamente distribuite in tutto il sistema nervoso centrale, che: i) sono impegnate nella linea oligodendrogliale, ii) possono migrare verso i siti di demielinizzazione e iii) possono differenziarsi in oligodendrociti mielinizzanti. Gli OPC mostrano anche un potenziale di auto-rinnovamento e di quiescenza⁴.

Fino ad ora, l'isolamento e lo studio di NSC e OPC richiedevano la dissociazione post mortem del cervello sezionato e del tessuto del midollo spinale. Per aggirare questa limitazione sperimentale, abbiamo stabilito un metodo che consente, per la prima volta, l'isolamento di NSC e OPC cerebrali da animali vivi. Chiamiamo questo metodo "mungitura", perché consente più raccolte di cellule poiché i loro pool non sono esauriti. Il protocollo è stato sviluppato nei ratti, a causa delle loro grandi dimensioni cerebrali, prendendo di mira principalmente la ZES, o CC, e comprende due passaggi principali. In primo luogo, le NSC o OPC vengono "rimosse" dal tessuto tramite iniezione endovenosa di un "cocktail di rilascio" contenente neuraminidasi, una tossina che induce la denudazione della parete ventricolare, un anticorpo bloccante l'integrina-β1 e il fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2). Il cocktail viene iniettato stereotassicamente bilateralmente all'interno dei ventricoli laterali. Se l'uso previsto è l'isolamento delle NSC, vengono prese di mira le aree rostrali dei ventricoli laterali. Se l'obiettivo è quello di isolare gli OPC in modo più puro, il cocktail viene iniettato caudalmente nell'area della fimbria dell'ippocampo. In una seconda fase di "raccolta", vengono eseguite biopsie liquide di liquido cerebrospinale (CSF) dalla cisterna magna di ratti anestetizzati senza la necessità di un'incisione. La biopsia liquida viene miscelata con il terreno di coltura NSC e può essere mantenuta a 4 °C fino alla placcatura.

Protocollo

L'allevamento, il mantenimento e le procedure sperimentali degli animali sono stati condotti in conformità con l'UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, autorizzato dal Ministero dell'Interno, e con il Decreto Presidenziale 56/2013 della Repubblica Ellenica, esaminati dagli Organi di Revisione Etica e per il Benessere degli Animali delle Università di Cambridge e Patrasso, nonché approvati e controllati dal Comitato locale per la cura e l'uso degli animali della Prefettura (Numero di protocollo: 5675/39/18-01-2021). Sono stati utilizzati ratti maschi e femmine di Sprague-Dawley, Wistar e Long-Evans, con età variabile tra i 2 e i 4 mesi e con peso corporeo compreso tra 150 g e 250 g. Il protocollo è riepilogato graficamente nella Figura 1.

1. Rilascia la preparazione del cocktail

NOTA: Preparare fresco il giorno della procedura e conservare sul ghiaccio. Le quantità sono indicate per 2 μL da iniettare per via endovenosa in ciascun ventricolo laterale. Preparare 1 μL aggiuntivo per ogni iniezione prevista.

1. Preparare 0,5 μL di neuraminidasi 500 mU da Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
   NOTA: Conservare in formato 1 U/μL diluito in acqua sterile a -20 °C. Altri tipi di neuraminidasi non sono stati testati.
2. Preparare 1 μL contenente 1 μg di anticorpo bloccante l'integrina-β1.
   NOTA: Conservare a 4 °C.
3. Preparare 0,5 μL contenenti 0,5 μg di fattore di crescita basico dei fibroblasti (FGF-basico umano ricombinante).
   NOTA: Conservare in formato 1 μg/μL diluito in acqua sterile a -20 °C.

2. Iniezione del cocktail di rilascio

NOTA: L'intero processo può essere eseguito entro 20 minuti. Avere cura di eseguire l'intervento chirurgico in condizioni asettiche. Pulire tutte le superfici con antisettico (ad es. perossido di idrogeno al 3% o al 6%). Utilizzare strumenti, guanti, camici e teli sterilizzati in autoclave o facilmente sterili.

1. Anestetizzare l'animale da esperimento mediante inalazione di isoflurano (2,5% per induzione e 2% per mantenimento). Confermare la profondità dell'anestesia controllando il riflesso corneale, la reazione agli stimoli (test di pizzicamento degli arti posteriori e della coda) e la modalità di respirazione.
   NOTA: Le procedure chirurgiche possono essere eseguite in anestesia generale indotta da anestesia iniettabile intraperitoneale (ad es. ketamina [40 mg/kg] e xilazina [10 mg/kg]). L'anestesia profonda è stata confermata controllando il riflesso corneale, la reazione agli stimoli (test di pizzicamento degli arti posteriori e della coda) e la modalità di respirazione.
2. Somministrare analgesia per via sottocutanea (ad es. 0,3 mg/mL di buprenorfina) dopo l'induzione dell'anestesia.
3. Montare il ratto sul telaio stereotassico.
4. Radere il pelo della testa con un rasoio e pulire la pelle con un antisettico, come una soluzione di iodio povidone al 10% e poi alcool. Applicare l'antisettico tre volte utilizzando tamponi di cotone sterili. Strofinare con movimenti circolari per 3-5 secondi ogni volta. Applicare un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza.
5. Fai un'incisione di 2 cm nella pelle della testa lungo la linea mediana usando un bisturi sterile.
6. Pulisci meticolosamente il cranio utilizzando tamponi sterili e soluzione fisiologica sterile.
7. Identificare il bregma utilizzando il bordo dell'ago di una siringa Hamilton da 10 μL montata sul dispositivo stereotassico. Impostare il bregma come "punto 0,0".
   NOTA: Il bregma è identificato come il punto di intersezione tra la sutura sagittale e quella coronale. Maggiori dettagli possono essere trovati nell'atlante del cervello dei ratti di Paxinos e Watson⁵.
8. Spostare il dispositivo alle coordinate anteroposteriore (AP) = 0,3 mm, laterale (L) = +1,2 mm (per puntare la SEZ) o AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (per mirare alla CC).
9. Praticare un foro di 1 mm utilizzando un trapano dentale.
   NOTA: Quando si perfora a mano, fare attenzione a non ferire la superficie corticale. L'emorragia non dovrebbe essere considerevole. Eliminare il sangue con soluzione fisiologica e applicare pressione per fermare l'emorragia più persistente.
10. Caricare 4 μL del cocktail di rilascio nella siringa Hamilton da 10 μL.
11. Abbassare l'ago (preferibilmente smussato o conico) della siringa Hamilton in modo da entrare in contatto con la dura.
12. Inserire l'ago alla profondità desiderata (D = 3,5 mm).
    NOTA: Versare soluzione fisiologica sulla superficie della dura per mantenere il tessuto idratato.
13. Infondere 2 μL del cocktail di rilascio alla velocità di 1 μL/min.
14. Lasciare l'ago in posizione per altri 2 minuti prima di un recupero lento per evitare che il cocktail di rilascio emerga.
15. Ripetere i passaggi 2.8-2.14 per l'altro emisfero alle coordinate AP = 0.3 mm, L = -1.2 mm (per puntare alla SEZ) o AP = 1.5 mm, L = -2.0 mm (per puntare al CC).
16. Suturare l'incisione con nylon 5-0 (diametro 0,1 mm) e pulire l'area suturata con antisettico.
17. Rimuovere la maschera che fornisce l'anestetico e trasferire l'animale nell'area di monitoraggio post-operatoria.
    NOTA: Il recupero dall'anestesia e il mantenimento dell'incubito devono avvenire entro 5-10 minuti e il recupero completo (comportamento normale) entro 25 minuti.
    1. Monitorare attentamente il recupero (movimento vivido e ininterrotto, accesso frequente all'acqua) in uno spazio ben riscaldato (24-25 °C), tranquillo e senza lettiera di piccole particelle, che possono ostruire le vie aeree. Riportare l'animale in compagnia dei suoi compagni di gabbia (non a nuovi animali) solo dopo aver confermato il completo recupero.
    2. Monitorare l'animale presso la struttura di mantenimento per almeno 48 ore dopo l'intervento. Affrontare i segni di dolore (occultamento della testa, postura anomala della testa o del corpo, ipersensibilità e ipereccitabilità alla manipolazione) somministrando analgesia (ad es. 0,3 mg/mL di buprenorfina, per via sottocutanea). Indirizzare gli animali con pelo scolorito o eretto al veterinario responsabile.

3. Biopsia liquida del liquido cerebrospinale (CSF)

NOTA: L'intero processo può essere eseguito entro 10 minuti. La biopsia liquida qui descritta viene eseguita 3 giorni dopo l'iniezione del cocktail di rilascio, ma può essere eseguita esattamente allo stesso modo ogni volta che è necessario. Avere cura di eseguire l'intervento chirurgico in condizioni asettiche. Pulire tutte le superfici con antisettico (ad es. perossido di idrogeno al 3% o al 6%). Utilizzare strumenti, guanti, camici e teli sterilizzati in autoclave o facilmente sterili.

1. Anestetizzare l'animale mediante inalazione di isoflurano (2,5% per induzione e 2% per mantenimento). Confermare la profondità dell'anestesia controllando la cornea
   il riflesso, la reazione agli stimoli (test di pizzicamento degli arti posteriori e della coda) e la modalità di respirazione.
   NOTA: Le procedure chirurgiche possono essere eseguite in anestesia generale indotta da anestesia iniettabile intraperitoneale (ad es. ketamina [40 mg/kg] e xilazina [10 mg/kg]). Tuttavia, questo non è consigliabile in quanto la procedura è breve, soprattutto se le biopsie verranno eseguite più volte in giorni consecutivi.
2. Somministrare analgesia per via sottocutanea (ad es. 0,3 mg/mL di buprenorfina) dopo l'induzione dell'anestesia.
3. Montare l'animale da esperimento sul telaio stereotassico. Utilizzare le barre auricolari per fissare la testa senza ostacolare il movimento rotatorio verso la parte anteriore e posteriore.
4. Stabilizzare la testa con un angolo di 40° verso il basso in modo da ottenere una buona estensione della parte posteriore del collo.
   NOTA: Un modo per farlo è utilizzare la barra della bocca del dispositivo⁶.
5. Radere il pelo nella zona del collo usando un rasoio e pulire la pelle con un antisettico, come una soluzione di iodio povidone al 10% e poi alcool. Applicare l'antisettico tre volte utilizzando tamponi di cotone sterili. Strofinare con movimenti circolari per 3-5 secondi ogni volta.
6. Con la punta del dito, trova l'area depressiva a forma di rombo posizionata tra la protuberanza occipitale e la colonna vertebrale dell'atlante⁶.
7. Disegna un punto (ad esempio, usando un pennarello).
8. Fissare una siringa da 1 mL o 0,5 mL sul telaio stereotassico.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare siringhe con aghi non staccabili in quanto producono una migliore aspirazione e hanno un volume morto inferiore.
9. Portare l'ago nel punto di contatto con la pelle in corrispondenza del punto di riferimento.
10. Con un paio di pinze, sollevare la pelle abbassando la siringa attraverso gli strati cutanei.
11. Recuperare leggermente lo stantuffo per generare una pressione negativa nella siringa.
12. Ricominciare a immergere l'ago molto lentamente fino a quando nella siringa non compare del liquido cerebrospinale.
13. Sistemare l'ago in questa posizione e consentire il lento flusso del liquido cerebrospinale.
    NOTA: L'ago può essere abbassato o sollevato leggermente se il flusso del liquido cerebrospinale è molto lento.
14. Iniziare a rimuovere il liquido cerebrospinale lentamente (con incrementi di 40 μL/min) fino a 120 μL.
15. Recuperare lentamente la siringa.
16. Somministrare per via intraperitoneale 1 ml di siero normale per supportare il rifornimento di liquidi dell'animale da esperimento.
17. Miscelare la biopsia liquida (CSF) con 400 μL di terreno NSC e mantenere la provetta per microcentrifuga a 4 °C fino al successivo utilizzo.
    NOTA: Le biopsie liquide devono essere processate entro 3 ore se non congelate.
18. Rimuovere la maschera che fornisce l'anestetico e trasferire l'animale nell'area di monitoraggio post-operatoria.
    NOTA: Il recupero dall'anestesia e il mantenimento dell'incubito devono avvenire entro 5-10 minuti e il recupero completo (comportamento normale) entro 25 minuti.
    1. Monitorare attentamente il recupero (movimento vivido e ininterrotto, accesso frequente all'acqua) in uno spazio ben riscaldato (24-25 °C), tranquillo e senza lettiera di piccole particelle, che possono ostruire le vie aeree. Restituire l'animale alla compagnia dei suoi compagni di gabbia (non ai nuovi animali) solo dopo che è stato confermato il completo recupero.
    2. Monitorare l'animale presso la struttura di mantenimento per almeno 48 ore dopo l'intervento. Se si osservano segni di dolore (occultamento della testa, postura anomala della testa o del corpo, ipersensibilità e ipereccitabilità alla manipolazione), somministrare analgesia (ad es. 0,3 mg/mL di buprenorfina per via sottocutanea). Indirizzare gli animali con pelo scolorito o eretto al veterinario responsabile.

4. Processamento di tessuti per immunofluorescenza

1. L'eutanasia dell'animale mediante infusione intracardiaca di 20 mL di soluzione fisiologica ghiacciata, seguita da 50 ml di paraformaldeide ghiacciata al 4% (PFA; in soluzione salina tamponata con fosfato) [PBS] di pH = 7,4).
2. Sezionare il tessuto cerebrale.
   1. Separa la testa dal corpo usando le forbici per fare un taglio nella zona cervicale. Usa le forbici per rimuovere la pelle e poi taglia l'osso del cranio lungo la linea mediana sagittale, con le punte delle forbici rivolte verso l'alto per non danneggiare il tessuto cerebrale. Cerca di continuare a tagliare il più possibile, superando la linea mediana coronale.
   2. Utilizzare le pinze per rimuovere le ossa, partendo dalle ossa sopraoccipitali e parietali e infine dalle ossa frontali.
   3. Una volta che il tessuto cerebrale è stato rivelato, usa la pinza o una spatola per sollevarlo dal cranio. Per facilitare questo, taglia i nervi alla base del cervello e i bulbi olfattivi, se non lo desideri.
3. Post-fissare il tessuto per una notte in PFA al 2% a 4 °C.
4. Crioproteggere il tessuto con saccarosio al 30% (in PBS) per almeno 48 ore a 4 °C fino a quando il tessuto non affonda sul fondo.
5. Congelare il tessuto a -80 °C.
6. Tagliare il tessuto cerebrale in sezioni coronali spesse 14 μm con un criostato.
7. Eseguire la colorazione in immunofluorescenza utilizzando protocolli standard ^3,7
   1. Incubare le sezioni con tampone bloccante (3% albumina sierica bovina [BSA], 0,1% Triton X-100, in PBS) per 2 ore a temperatura ambiente.
   2. Eseguire il recupero dell'antigene (ebollizione per 15 minuti in tampone citrato 10 mM, pH = 6,0, utilizzando barattoli di vetro).
      NOTA: Questo passaggio è facoltativo, ma necessario per gli antigeni nucleari.
   3. Portare a temperatura ambiente e incubare con anticorpi primari contro la proteina acida fibrillare gliale (GFAP), la doppia cortina (Dcx), S100β e la β-catenina (vedere la tabella dei materiali) nel tampone bloccante per una notte a 4 °C.
   4. Incubare per 2 ore con anticorpi secondari in PBS con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per la controcolorazione nucleare a temperatura ambiente (vedere la tabella dei materiali).
   5. Montare i vetrini coprioggetti.

5. Processamento di cellule isolate per immunofluorescenza

1. Placcare le cellule in piastre a 96 pozzetti compatibili per la microscopia, rivestite con poli-D-lisina (100 μg/mL).
2. Fissare le celle in PFA ghiacciato al 2% per 10 minuti e lavarle 3 volte con PBS.
3. Eseguire l'immunofluorescenza utilizzando le procedure standard^3,7 per PDGFRα, GFAP^, Dcx, SOX2 e ID3 (vedere la tabella dei materiali).
4. Tenere le celle in PBS + NaN₃ (0,1%) a 4 °C al buio.

6. Microscopia e analisi delle immagini

1. Acquisisci immagini utilizzando l'epifluorescenza o la microscopia confocale ed esegui la conta cellulare utilizzando strumenti software standard per l'analisi delle immagini, come i contatori di cellule.

Risultati

Rilascio e raccolta di NSC
Le NSC della ZES sono separate dal liquido cerebrospinale solo dal monostrato di cellule ependimali, sebbene rimangano in contatto diretto con il contenuto ventricolare attraverso processi monociliati intercalanti ^8,9. La neuraminidasi agisce in modo specifico sulle cellule ependimali attraverso la scissione dei residui di acido sialico e può indurre la denudazione della parete ventricolare. Questo...

Discussione

Le cellule staminali e progenitrici sono relativamente scarse nel tessuto cerebrale dei mammiferi. Inoltre, le NSC sono localizzate in aree inaccessibili per biopsie facili e sicure (pareti ventricolari, ippocampo). Pertanto, l'unico modo per lavorare sperimentalmente con tali cellule, finora, è stato il loro isolamento post mortem. Un metodo che consente la raccolta singola o ripetuta di NSC e OPC da ratti vivi, chiamato mungitura, è descritto qui passo dopo passo. Il metodo si basa su due caratteristiche chiave: i) l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX