Method Article
Burada, genotip-fenotip bağımlılıklarını araştırmak ve glioblastoma tedavisi için potansiyel ilaçları taramak için laboratuvar mühendisliği glioblastoma organoidleri (LEGO) üretmek ve kullanmak için kapsamlı bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz.
Glioblastoma (GBM), yüksek derecede malign primer beyin tümörleri grubu olarak tanımlanır ve en ölümcül malignitelerden biri olarak kabul edilir. GBM'nin genetik ve hücresel özellikleri, devam eden araştırmaların odak noktası olmuştur ve RNA ekspresyonu, DNA metilasyonu veya hücresel bileşimde varyasyonları olan bir grup heterojen hastalık olduğunu ortaya koymuştur. Mevcut moleküler verilerin zenginliğine rağmen, aktarılabilir klinik öncesi modellerin eksikliği, bu bilgilerin tedavi sınıflandırmasından ziyade hastalık sınıflandırmasına uygulanmasını sınırlamıştır. Hastaların genetik bilgilerinin klinik faydalara aktarılması ve GBM'nin ayrıntılı tanımları, genotip-fenotip ilişkileri ve tedavi ilerlemeleri arasındaki boşluğun kapatılması önemli zorluklar olmaya devam etmektedir. Bu bağlamda, gelişmiş bir insan GBM organoid modeli olan Laboratuvar Mühendisliğine Tabi Glioblastoma Organoid'i (LEGO) sunuyoruz ve genotip-fenotip bağımlılıklarının incelenmesinde ve GBM için potansiyel ilaçların taranmasında kullanımını gösteriyoruz. Bu modeli kullanarak, lipid metabolizması düzensizliğini GBM ilerlemesinde kritik bir kilometre taşı olarak tanımladık ve mikrozomal trigliserit transfer protein inhibitörü Lomitapid'in GBM için potansiyel bir tedavi olarak umut vaat ettiğini keşfettik.
Glioblastoma (GBM), yetişkinlerde teşhis edilen tüm primer beyin tümörlerinin %60'ından fazlasını oluşturur ve medyan sağkalım iki yıldan azdır 1,2,3. Bu hastalığın altta yatan karmaşıklığını deşifre etmek için önemli çabalara, hedefe yönelik tedaviler veya immünoterapilerle sürekli girişimlere ve potansiyel anti-kanser ilaçlarının taranmasına rağmen, yeni tanı konan GBM hastaları için tedavi stratejisi, maksimum güvenli cerrahi rezeksiyon ve ardından temozolomid (TMZ) ile birlikte radyoterapi (RT) ve ardından adjuvan TMZ4
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
1. iPSC'lerin lusiferaz etiketlemesi
NOT: iPSC'lerin kültürlenmesiyle ilgili ayrıntılı talimatlar için, hücrelerin elde edildiği kurumlar veya şirketler tarafından sağlanan protokole bakın. Bu protokolde açıklanan tüm deneylerde, iyileşme sonrası 3-10 pasajlarındaki iPSC'ler kullanıldı ve farklılaşma belirtileri gösteren hücreler atıldı. Virüs üretimi için, puromisine dirençli bir kaset ile birlikte Luc2'yi çalıştıran bir EF1α promotörü içeren plazmitler kullanıldı.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Elimizde, mutant iPSC'lerden türetilen LEGO'lar, WT izojenik kontrolüne kıyasla daha fazla genleşme gösterdi (Şekil 1C) ve 4 haftalık kültürden sonra atipik nükleer gösterdi (Şekil 1D), bu da mutant organoidlerdeki hücrelerin potansiyel malign dönüşümünü destekler18. Organoidlerin tümörjenik potansiyeli, daha önce gösterdiğimiz gibi, gerekirse ksenogreftli deneylerle daha fazla do?.......
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
İnsan GBM'sinde kişiselleştirilmiş tedavi eksikliği, büyük ölçüde, insan hücre hatları veya fare modelleri gibi birçok GBM modelinin, insan GBM'sini aslına uygun olarak özetleyememesi gerçeğine bağlanabilir. Sonuç olarak, bu model sistemlere dayalı olarak seçilen tedavi stratejileri klinik uygulamalara aktarılamamaktadır. Bunun yerine, organoidler, insan fizyolojik koşullarının varlığıyla bu translasyonel problemlerin üstesinden gelebilir. Bu amaçla, LEGO'y.......
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft Grant SFB1389 (H-K.L.), Deutsche Krebshilfe Grant 110227 (H-K.L.), Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) hibe 647055 (H-K.L.), Deutschen Konsortium für Translationale Krebsforschung (DKTK) hibe AIM2GO (H-K.L.) tarafından desteklenmektedir.
....Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Accutase | A6964 | Sigma-Aldrich | Passaging reagent B |
| Antibiotic-Antimycotic | 15240096 | Life-Technologies | |
| B27 | 17504044 | Life Technologies | |
| B27 without vitamin A | 12587010 | Life Technologies | |
| Bbs1-HF | R3539S | New England Biolabs | |
| Bsa1-HF | R3535S | New England Biolabs | |
| CHIR99021 | 4423 | Tocris Bioscience | |
| CloneR | #05889 | STEMCELL Technologies | Reagent to facilitate single-cell survival |
| D-Luciferin | L2916 | Invitrogen | Luciferase Substrate |
| DMEM/F-12 | 11330032 | Life Technologies | |
| EcoRl-HF | R3101T | New England Biolabs | |
| Fetal Bovine Serum | 30-2020 | ATCC | |
| FGF-2 | 100-18B | PeproTech | |
| GlutaMAX | 35050038 | Life Technologies | |
| Heparin | H3149 | Sigma-Aldrich | |
| hES-quality Fetal Bovine Serum | 10270106 | Life Technologies | |
| Insulin Solution | I9278 | Sigma-Aldrich | |
| IVIS Lumina II | NA | PerkinElmer | |
| Knockout serum replacement | 10828-028 | Life Technologies | |
| L-Ascorbic Acid | A4544-25G | Sigma-Aldrich | |
| Matrigel® hES qualified | 354277 | Corning | Basement matrix membrane |
| MEM-NEAA | 11140050 | Life Technologies | |
| mTeSR Plus | 100-0276 | STEMCELL Technologies | Human embryonic cell qualified culture medium |
| N2 | 17502048 | Life Technologies | |
| Neon Electroporation System | NA | Thermo Fisher Scientific | Electroporation system |
| Neon Transfection System 100 µL Kit | MPK10096 | Invitrogen | Electroporation kit |
| Neurobasal medium | 21103049 | Life Technologies | |
| Online knockout efficiency analysis | NA | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | |
| Organoid Embedding Sheet | # 08579 | STEMCELL Technologies | |
| Penicillin-Streptomycin | 15140122 | Life-Technologies | |
| Polybrene (10mg/mL) | TR-1003-50UL | Merck Millipore | |
| Puromycin | P8833 | Sigma-Aldrich | |
| px330-A-1x2 | https://www.addgene.org/58766/ | Addgene | |
| px330-S-2 | https://www.addgene.org/58778/ | Addgene | |
| px459 | https://www.addgene.org/48139/ | Addgene | |
| ReleSR | 5872 | STEMCELL Technologies | Passaging reagent A |
| Rock Inhibitor | 72304 | STEMCELL Technologies | |
| sgRNA design | NA | https://zlab.bio/guide-design-resources | |
| sgRNA design | NA | NA | www.benchling.com |
| T4 DNA ligase | M0202S | New England Biolabs | |
| β-Mercaptoethanol | M3148 | Sigma-Aldrich |
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission