JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, genotip-fenotip bağımlılıklarını araştırmak ve glioblastoma tedavisi için potansiyel ilaçları taramak için laboratuvar mühendisliği glioblastoma organoidleri (LEGO) üretmek ve kullanmak için kapsamlı bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz.

Özet

Glioblastoma (GBM), yüksek derecede malign primer beyin tümörleri grubu olarak tanımlanır ve en ölümcül malignitelerden biri olarak kabul edilir. GBM'nin genetik ve hücresel özellikleri, devam eden araştırmaların odak noktası olmuştur ve RNA ekspresyonu, DNA metilasyonu veya hücresel bileşimde varyasyonları olan bir grup heterojen hastalık olduğunu ortaya koymuştur. Mevcut moleküler verilerin zenginliğine rağmen, aktarılabilir klinik öncesi modellerin eksikliği, bu bilgilerin tedavi sınıflandırmasından ziyade hastalık sınıflandırmasına uygulanmasını sınırlamıştır. Hastaların genetik bilgilerinin klinik faydalara aktarılması ve GBM'nin ayrıntılı tanımları, genotip-fenotip ilişkileri ve tedavi ilerlemeleri arasındaki boşluğun kapatılması önemli zorluklar olmaya devam etmektedir. Bu bağlamda, gelişmiş bir insan GBM organoid modeli olan Laboratuvar Mühendisliğine Tabi Glioblastoma Organoid'i (LEGO) sunuyoruz ve genotip-fenotip bağımlılıklarının incelenmesinde ve GBM için potansiyel ilaçların taranmasında kullanımını gösteriyoruz. Bu modeli kullanarak, lipid metabolizması düzensizliğini GBM ilerlemesinde kritik bir kilometre taşı olarak tanımladık ve mikrozomal trigliserit transfer protein inhibitörü Lomitapid'in GBM için potansiyel bir tedavi olarak umut vaat ettiğini keşfettik.

Giriş

Glioblastoma (GBM), yetişkinlerde teşhis edilen tüm primer beyin tümörlerinin %60'ından fazlasını oluşturur ve medyan sağkalım iki yıldan azdır 1,2,3. Bu hastalığın altta yatan karmaşıklığını deşifre etmek için önemli çabalara, hedefe yönelik tedaviler veya immünoterapilerle sürekli girişimlere ve potansiyel anti-kanser ilaçlarının taranmasına rağmen, yeni tanı konan GBM hastaları için tedavi stratejisi, maksimum güvenli cerrahi rezeksiyon ve ardından temozolomid (TMZ) ile birlikte radyoterapi (RT) ve ardından adjuvan TMZ4 olmaya devam etmektedir.

Glioblastomun tümörler içinde ve arasında oldukça heterojen mutasyonel doğası, bu tümörün moleküler özelliklerini incelemeyi son derece zorlaştırır ve bu da sonunda tedavi başarısızlığına yol açar. Bu nedenle, genetik mutasyonların çeşitliliğini GBM hastalarında en sık görülen mutasyon modüllerine indirgeyerek hastalığın karmaşıklığını gidermekönemlidir 5,6,7,8 ve her bir mutasyonel alt klonun moleküler sonuçlarını ayrı ayrı araştırmak önemlidir.

Son zamanlarda, organoidler kanser araştırmaları için umut verici bir model olarak ortaya çıkmıştır. Organoidler, nispeten düşük bir maliyetle üretilmesi ve genişletilmesi kolay olurken, bir insan mikro çevresi ve karmaşık hücresel bileşenler sergiledikleri için kanonik kanser modellerini aşmaktadır9. Glioma10,11'i incelemek için kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9) ile genetik olarak tasarlanmış organoidlerin öncüleri de vardı. Bu yönü takiben, GBM hastalarında tanımlanan sık mutasyonların CRISPR / Cas9 genetik mühendisliğine dayanan bir dizi indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) tabanlı insan GBM organoid modeli (LEGO: Laboratuvar Mühendisliği Glioblastoma Organoid) oluşturduk. LEGO'ların tek hücreli transkriptomu, DNA metilomu, metabolomu, lipidomu, proteomu ve fosfo-proteomunun ayrıntılı karakterizasyonu ile, LEGO'ların insan GBM'si ile yüksek benzerliğini gösterdik ve GBM'nin ilerlemesi sırasında önemli kilometre taşları keşfettik ve lusiferaz bazlı ilaç taraması ile GBM tedavisi için birkaç potansiyel ilaç belirledik, bu sonuçların detayları daha önce yayınlanmıştı12. Bu makale, LEGO'ların üretimi ve ilaç taraması için ayrıntılı protokolü açıklamaktadır (Şekil 1A).

Protokol

1. iPSC'lerin lusiferaz etiketlemesi

NOT: iPSC'lerin kültürlenmesiyle ilgili ayrıntılı talimatlar için, hücrelerin elde edildiği kurumlar veya şirketler tarafından sağlanan protokole bakın. Bu protokolde açıklanan tüm deneylerde, iyileşme sonrası 3-10 pasajlarındaki iPSC'ler kullanıldı ve farklılaşma belirtileri gösteren hücreler atıldı. Virüs üretimi için, puromisine dirençli bir kaset ile birlikte Luc2'yi çalıştıran bir EF1α promotörü içeren plazmitler kullanıldı.

  1. Hücreler ~%70 birleşmeye ulaştığında, iPSC'leri sırasıyla 37 ° C'de 4 dakika boyunca pasaj reaktifleri A ve B ile sindirin ( Malzeme Tablosuna bakın), 5 dakika boyunca 120 x g'da santrifüjleyin ve hafif pipetleme ile tek hücreli bir süspansiyona yeniden süspanse edin.
  2. Hücreleri sayın ve bir bazal matris membranı (BMM) kaplı 48 oyuklu plakanın her bir oyuğunda 1 x 104 tek hücre iPSC tohumlayın, 10 μM rho kinaz (ROCK) inhibitörü içeren insan embriyonik hücre nitelikli kültür ortamı ile 24 saat boyunca kültür yapın (bkz.
  3. Hücreleri lentivirüs içeren lusiferaz eksprese eden plazmitler (MOI yaklaşık 10) ve 8 μg / mL Polibren ile enfekte edin (bkz. Ortamı, 6 saat sonra taze bir insan embriyonik hücre nitelikli kültür ortamı ile değiştirin.
  4. 24 saat sonra, hücre kültürü ortamına 150 μg / mL Lusiferaz Substratı (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve biyolüminesans görüntüleme ekipmanı ile biyolüminesans (BLI) sinyalini 5 saniye maruz bırakarak kontrol edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
  5. Kültür ortamına 2 gün boyunca 2 μg / mL puromisin ekleyin, daha sonra hücreleri genişletmek için ortamı 1 hafta boyunca her gün değiştirin.
  6. Hücreler ~%70 birleşmeye ulaştığında, iPSC'leri sırasıyla 37 ° C'de 4 dakika boyunca pasaj reaktifleri A ve B ile sindirin ( Malzeme Tablosuna bakın), 5 dakika boyunca 120 x g'da santrifüjleyin ve hafif pipetleme ile tek hücreli bir süspansiyona yeniden süspanse edin.
  7. Hücreleri sayın ve tek hücreleri 2 tabak için 10 cm'lik tabak başına 50 hücre konsantrasyonunda tohumlayın. Klonların çapı 3-5 mm'ye ulaşana kadar ortamı iki günde bir değiştirin (Şekil 1B).
  8. BLI sinyalini yukarıda açıklandığı gibi kontrol edin ve sterilize edilmiş 10 μL pipet uçları ile mikroskop altında güçlü BLI sinyallerine sahip klonları seçin.
  9. Daha fazla kullanım için hücreleri genişletin.

2. gRNA tasarımı ve plazmid klonlama

NOT: Bu adımlar Bölüm 1 ile eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilir. Uygun bir seçim sistemine sahip CRISPR / Cas9 plazmitleri çalışmalıdır. Bu spesifik plazmitler, birkaç hedef genin aynı anda nakavt edilmesini sağladıkları için kullanıldı. Bu bölüm, iki gRNA iskelesi ile bir plazmitin nasıl klonlanacağını gösterir; aynı prensibi izleyerek bir plazmitte daha fazla gRNA iskelesi klonlanabilir. Orijinal protokol daha önce13 yayınlanmıştı.

  1. Çevrimiçi web araçlarıyla ilgili genleri hedefleyen gRNA'lar tasarlayın (bkz. Tüm birleştirme varyantlarında sunulan ekzonları hedefleyen gRNA'ları seçin ve transkripsiyon başlangıç bölgesine en yakın olanı bulun.
  2. gRNA oligolarını tavlayın (5 dakika boyunca 95 °C, 1 °C/s hızında 25 °C'ye soğutun) ve pX330A-1x2'yi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve pX330S-2 (Malzeme Tablosuna bakınız) plazmitlerini Bbs1 enzimi ile doğrusallaştırın.
  3. gRNA'lardan birini sırasıyla pX330A-1x2 veya pX330S-2 ile, oda sıcaklığında (RT) T4 ligaz ile 4 saat boyunca bağlayın.
  4. Elde edilen iki plazmiti BsaI enzimi (1 saat boyunca 37 ° C) ile sindirin ve ürünleri jel ekstraksiyonu ile saflaştırın.
  5. gRNA iskelelerini pX330S-2-gRNA plazmidinden RT'de T4 ligaz ile doğrusallaştırılmış pX330A-2x4-gRNA plazmidine 4 saat boyunca bağlayın.
  6. PX459 (Malzeme Tablosuna bakınız) plazmidinden puromisin direnç genini (PuroR) EcoRI sindirimi (1 saat boyunca 37 ° C) ve 4 saat boyunca RT'de ardışık T4 ligasyonu ile elde edilen plazmitlere klonlayın.
  7. Plazmitleri DH5alfa yetkin hücrelerde dönüştürün ve genişledikten sonra plazmitleri çıkarın.

3. iPSC'lerde nakavt oluşturma ve doğrulama

NOT: 9'ten önce yayınlanan standart CRISPR/Cas13,14 nakavt protokollerini izleyin. Bu bölüm, elektroporasyon yoluyla nakavtları gerçekleştirmek için kullanılan yöntemi açıklar.

  1. iPSC'leri her biri 37 ° C'de 4 dakika boyunca pasaj reaktifleri A ve B ile sindirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve hücreleri 120 x g'da 5 dakika boyunca döndürün ve insan embriyonik hücre nitelikli kültür ortamında yeniden süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu) tek hücreli süspansiyonlar oluşturmak için.
  2. Hücreleri sayın ve numune başına 1.2 x 106 hücre elde etmek için birkaç tüpe bölün ve hücreleri 5 dakika boyunca 120 x g'da döndürün.
  3. Bu arada, 15 μg plazmitleri, transfeksiyon kitinden 135 μL yeniden süspansiyon tamponu içinde karıştırın (bkz. Malzeme Tablosu).
  4. Hücre peletini yeniden süspanse etmek için 120 μL karışım kullanın.
  5. Hücreleri bir elektroporasyon sistemi ile 20 ms boyunca 1200 V'ta iki darbe için elektroporate edin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve elde edilen hücreleri, tek hücreli sağkalımı kolaylaştırmak için reaktif içeren bir insan embriyonik hücre nitelikli kültür ortamı ile 6 oyuklu bir plaka kuyusunda kaplayın (bkz.
  6. 2 gün boyunca her 12 saatte bir kültür ortamına 2 μg / mL puromisin ekleyin. Ardından, hasattan önce hücreleri 1 hafta boyunca genişletin.
  7. Western blotting veya webtool analizi ile nakavtın verimliliğini kontrol edin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve en yüksek verimliliğe sahip nakavt popülasyonunu seçin.
  8. En yüksek nakavt verimliliğine sahip iPSC'leri, her biri 37 ° C'de 4 dakika boyunca pasaj reaktifleri A ve B ile sindirin ve hücreleri 120 x g'da 5 dakika boyunca döndürün . Tek hücreli süspansiyonlar oluşturmak için insan embriyonik hücre nitelikli kültür ortamında yeniden süspanse edin.
  9. Hücreleri sayın ve tek hücreli hayatta kalmayı kolaylaştırmak için bir reaktif ile birlikte verilen önceden ısıtılmış insan embriyonik hücre nitelikli kültür ortamı içeren iki adet 10 cm'lik tabakta (her tabakta 50 hücre) yaklaşık 100 hücre tohumlayın.
  10. Ortamı her gün değiştirin ve hücreleri 2 hafta boyunca kültürleyin.
  11. Tek hücreli kolonilerin çapı 3-5 mm olduğunda, mikroskop altında 10 μL pipet uçları ile kolonileri toplayın ve hücreleri 48 oyuklu plakadan oluşan iki kuyucukta genişletin.
  12. Hücreler% 30 -% 50 birleşmeye ulaştığında, DNA'yı 48 oyuklu plakanın bir kuyusundan çıkarın ve PCR gerçekleştirin.
  13. PCR ürünlerini sıralayın ve sonuçları web aracıyla analiz edin (bkz.
  14. TA klonlama ve batı lekeleri ile nakavt sonuçlarını genişletmek ve daha fazla doğrulamak için 5 pozitif klon seçin.

4. Organoid Kültür

NOT: Organoidler, küçük adaptasyonlarla daha önce yayınlanmış protokollerizlenerek üretilmiştir 15,16,17. Organoidlerin optimal yaşı (kültür süresi), çalışmanın özel amacına göre belirlenmelidir. Örneğin, genotip-fenotip ilişkilerini araştırırken veya organoid büyüme modellerini gözlemlerken, 1-4 ay veya daha uzun arasında değişen birden fazla zaman noktasının analiz edilmesi önerilir. 2-2.5 aylık organoidler, ilaç tarama sonuçlarının doğruluğunu etkileyebilecek daha büyük boyutlarda besin sınırlamaları nedeniyle merkezde nekrotik bir çekirdek geliştirme eğiliminde olduklarından, ilaç taraması için kullanıldı.

  1. 0. günde, iPSC'leri 37 ° C'de sırasıyla 4 dakika boyunca pasaj reaktifleri A ve B ile sindirin ( Malzeme Tablosuna bakınız), 5 dakika boyunca 120 x g'da santrifüjleyin ve düşük bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) hES ortamı kullanarak tek hücreli bir süspansiyona yeniden süspanse edin (Tablo 1).
  2. Hücreleri sayın ve 6 × 104 hücre / mL konsantrasyona ulaşmak için uygun sayıda hücre ekleyin.
  3. Düşük bFGF hES ortamı içeren hücrelere 50 μM ROCK inhibitörü ve 6 ng/mL bFGF ekleyin.
  4. Hem kontrol (WT organoidleri) hem de deneysel (nakavt organoidler) grupları için 96 oyuklu ultra düşük bağlantı plakasının her bir oyuğuna 150 μL hücre süspansiyonu (9000 hücre) tohumlayın.
  5. 3. günde, her bir oyuktan 80 μL eski kültür ortamını dikkatlice çıkarın ve 150 μL taze düşük bFGF hES ortamı ekleyin.
  6. 5. günde, embriyonik cisimler (EB'ler) parlamaya ve pürüzsüz kenarlara sahip olmaya başladığında, her oyuktan mümkün olduğunca fazla eski kültür ortamını çıkarın ve 150 μL ila 200 μL taze nöral indüksiyon ortamı ekleyin (Tablo 1).
  7. 7. günde, her oyuktan mümkün olduğunca çok eski kültür ortamını çıkarın ve 150-200 μL nöral indüksiyon ortamı ekleyin.
  8. 9. günde, doku kültürü mikroskobu altında EB'leri gözlemleyin ve dışarıdan daha parlak olan EB'leri seçin.
  9. Aşağıdaki adımlara başlamadan önce BMM'yi 4 °C'de veya buz üzerinde 30 dakika çözdürün.
  10. EB'leri organoid gömme tabakasına aktarmak için 200 μL genişliğinde bir pipet ucu kullanın (Malzeme Tablosuna bakın), fazla ortamı çıkarın, organoidlerin üzerine 30 μL BMM damlatın, EB'leri 10 μL'lik bir pipet ucu ile damlacığın ortasına yerleştirin ve 37 °C inkübatörde 20 dakika katılaşmasına izin verin.
  11. BMM damlacıklarını 3 mL NeuroDMEM - A ortamı (Tablo 1) ve 3 μM CHIR99021 (bkz. Malzeme Tablosu) içeren 6 oyuklu bir plakaya yıkayın.
  12. 11. günde, her bir oyuktan eski kültür ortamının mümkün olduğunca fazlasını çıkarın ve 3 μM CHIR99021 içeren 3 mL taze NeuroDMEM -A ortamı ekleyin.
  13. 13. günde, her bir kuyucuktan mümkün olduğunca çok eski kültür ortamını çıkarın ve 3 mL NeuroDMEM + A kültür ortamı ekleyin (Tablo 1). 6 oyuklu plakayı inkübatörde 75 rpm'de dönen bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
  14. Organoidler kullanılana kadar her 3 günde bir NeuroDMEM + A ortamını yenileyin.
  15. Önceki yayın12'de yapıldığı gibi standart protokolleri veya ilaç taramasını takip ederek multi-omik analiz için organoidleri kullanın.

5. LEGO'lu uyuşturucu ekranı

NOT: iPSC'ler veya organoidler BLI için maruz kalma süresi, çeşitli ekipman veya laboratuvar ortamları kullanılarak değerlendirilmelidir.

  1. İstenilen yaştaki organoidleri, deneyden 2 gün önce, oyuk başına bir organoid olmak üzere 1 mL NeuroDMEM + A ortamı içeren 24 oyuklu bir plakaya aktarın.
  2. 150 μg/mL D-lusiferin ekleyin ve çalkalayıcı üzerinde 15-30 dakika inkübe edin.
  3. BLI'yi daha önce açıklandığı gibi 1 s-5 s'lik bir maruz kalma süresiyle gerçekleştirin.
  4. Sonraki deneyler için benzer sinyal güçlerine sahip organoidleri seçin (her grup için en az 3 organoid).
  5. 0. günde, 5.2 ve 5.3 adımlarını tekrarlayın. Daha sonra organoidlerin kültür ortamına dimetil sülfoksit (DMSO) veya ilgili ilaçları uygulayın. 10 μM'lik bir başlangıç ilaç konsantrasyonu ile başlayın, daha sonra bir IC50 testi yapın veya konsantrasyonu farklı amaçlara göre daha da ayarlayın.
  6. Her 2 günde bir 5.5 adımını tekrarlayın. Organoidleri 6-10 gün boyunca tedavi edin.
    NOT: Süre, farklı amaçlara veya ilaçların farklı doğasına göre değiştirilebilir.
  7. Ortama 100 μM BrdU ekleyin ve gerekirse sonraki proliferasyon analizi için organoidleri hasat etmeden önce 2 saat boyunca bir CO2 inkübatöründe inkübe edin.
  8. BLI sinyalini aynı gün ölçülen DMSO kontrolüne normalleştirin ve daha sonra ilaç tedavisinin etkisini değerlendirmek için ilaç tedavisinden önce karşılaştırın. P değeri 0.05'ten düşük olan ve% 50'den fazla etkili bir sinyal düşüşü olan ilaçları düşünün.

Sonuçlar

Elimizde, mutant iPSC'lerden türetilen LEGO'lar, WT izojenik kontrolüne kıyasla daha fazla genleşme gösterdi (Şekil 1C) ve 4 haftalık kültürden sonra atipik nükleer gösterdi (Şekil 1D), bu da mutant organoidlerdeki hücrelerin potansiyel malign dönüşümünü destekler18. Organoidlerin tümörjenik potansiyeli, daha önce gösterdiğimiz gibi, gerekirse ksenogreftli deneylerle daha fazla do?...

Tartışmalar

İnsan GBM'sinde kişiselleştirilmiş tedavi eksikliği, büyük ölçüde, insan hücre hatları veya fare modelleri gibi birçok GBM modelinin, insan GBM'sini aslına uygun olarak özetleyememesi gerçeğine bağlanabilir. Sonuç olarak, bu model sistemlere dayalı olarak seçilen tedavi stratejileri klinik uygulamalara aktarılamamaktadır. Bunun yerine, organoidler, insan fizyolojik koşullarının varlığıyla bu translasyonel problemlerin üstesinden gelebilir. Bu amaçla, LEGO'y...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur

Teşekkürler

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft Grant SFB1389 (H-K.L.), Deutsche Krebshilfe Grant 110227 (H-K.L.), Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) hibe 647055 (H-K.L.), Deutschen Konsortium für Translationale Krebsforschung (DKTK) hibe AIM2GO (H-K.L.) tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AccutaseA6964Sigma-Aldrich Passaging reagent B
Antibiotic-Antimycotic15240096Life-Technologies
B27 17504044Life Technologies 
B27 without vitamin A 12587010Life Technologies 
Bbs1-HFR3539SNew England Biolabs
Bsa1-HFR3535SNew England Biolabs
CHIR990214423Tocris Bioscience
CloneR#05889STEMCELL Technologies Reagent to facilitate single-cell survival
D-LuciferinL2916InvitrogenLuciferase Substrate
DMEM/F-1211330032Life Technologies 
EcoRl-HFR3101TNew England Biolabs
Fetal Bovine Serum 30-2020ATCC 
FGF-2100-18BPeproTech 
GlutaMAX35050038Life Technologies 
HeparinH3149Sigma-Aldrich 
hES-quality Fetal Bovine Serum10270106Life Technologies 
Insulin SolutionI9278Sigma-Aldrich 
IVIS Lumina IINAPerkinElmer
Knockout serum replacement10828-028Life Technologies 
L-Ascorbic AcidA4544-25GSigma-Aldrich 
Matrigel® hES qualified354277CorningBasement matrix membrane
MEM-NEAA11140050Life Technologies 
mTeSR Plus100-0276STEMCELL Technologies Human embryonic cell qualified culture medium
N2 17502048Life Technologies 
Neon Electroporation SystemNAThermo Fisher ScientificElectroporation system
Neon Transfection System 100 µL KitMPK10096InvitrogenElectroporation kit
Neurobasal medium21103049Life Technologies 
Online knockout efficiency analysisNAhttp://shinyapps.datacurators.nl/tide/
Organoid Embedding Sheet # 08579STEMCELL Technologies 
Penicillin-Streptomycin 15140122Life-Technologies
Polybrene (10mg/mL)TR-1003-50ULMerck Millipore
PuromycinP8833Sigma-Aldrich
px330-A-1x2https://www.addgene.org/58766/Addgene 
px330-S-2 https://www.addgene.org/58778/Addgene 
px459https://www.addgene.org/48139/Addgene 
ReleSR5872STEMCELL Technologies Passaging reagent A
Rock Inhibitor72304STEMCELL Technologies 
sgRNA designNAhttps://zlab.bio/guide-design-resources
sgRNA designNANAwww.benchling.com
T4 DNA ligaseM0202SNew England Biolabs
β-Mercaptoethanol M3148Sigma-Aldrich 

Referanslar

  1. Stupp, R., et al. Effect of tumor-treating fields plus maintenance temozolomide vs maintenance temozolomide alone on survival in patients with glioblastoma: A randomized clinical trial. JAMA. 318 (23), 2306-2316 (2017).
  2. Rock, K., et al. A clinical review of treatment outcomes in glioblastoma multiforme--the validation in a non-trial population of the results of a randomised phase iii clinical trial: Has a more radical approach improved survival. Br J Radiol. 85 (1017), e729-e733 (2012).
  3. Louis, D. N., et al. The 2016 world health organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathol. 131 (6), 803-820 (2016).
  4. Wen, P. Y., et al. Glioblastoma in adults: A Society for Neuro-Oncology (SNO) and European Society of Neuro-Oncology (EANO) consensus review on current management and future directions. Neuro Oncol. 22 (8), 1073-1113 (2020).
  5. Ohgaki, H., Kleihues, P. Genetic pathways to primary and secondary glioblastoma. Am J Pathol. 170 (5), 1445-1453 (2007).
  6. Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Abou-El-Ardat, K., et al. Comprehensive molecular characterization of multifocal glioblastoma proves its monoclonal origin and reveals novel insights into clonal evolution and heterogeneity of glioblastomas. Neuro Oncol. 19 (4), 546-557 (2017).
  9. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  10. Ogawa, J., Pao, G. M., Shokhirev, M. N., Verma, I. M. Glioblastoma model using human cerebral organoids. Cell Rep. 23 (4), 1220-1229 (2018).
  11. Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nat Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
  12. Wang, C., et al. A multidimensional atlas of human glioblastoma-like organoids reveals highly coordinated molecular networks and effective drugs. NPJ Precis Oncol. 8 (1), 19 (2024).
  13. Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/CAS9 vector system. Sci Rep. 4 (1), 5400 (2015).
  14. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-CAS9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  15. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. 35 (7), 659-666 (2017).
  16. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  17. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  18. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  19. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  20. Da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discov. 23 (8), 862-868 (2018).
  21. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Rep. 26 (12), 3203-3211.e5 (2019).
  22. Garreta, E., et al. Rethinking organoid technology through bioengineering. Nat Mater. 20 (2), 145-155 (2021).
  23. Zhao, X., et al. Review on the vascularization of organoids and organoids-on-a-chip. Front Bioeng Biotechnol. 9, 637048 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GlioblastomGBMOrganoid K lt rla TaramasLaboratuvar M hendisli inde Glioblastoma Organoid LEGOGenetik zelliklerRNA EkspresyonuDNA MetilasyonuTedavi Tabakala masGenotip Fenotip li kileriLipid MetabolizmasLomitapidMikrozomal Trigliserid Transfer Protein nhibit r

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır