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Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo abrangente para gerar e utilizar organoides de glioblastoma projetados em laboratório (LEGO) para investigar dependências genótipo-fenótipo e rastrear possíveis medicamentos para tratamento de glioblastoma.

Resumo

O glioblastoma (GBM) é descrito como um grupo de tumores cerebrais primários altamente malignos e se destaca como uma das malignidades mais letais. As características genéticas e celulares do GBM têm sido um ponto focal de pesquisas em andamento, revelando que é um grupo de doenças heterogêneas com variações na expressão de RNA, metilação do DNA ou composição celular. Apesar da riqueza de dados moleculares disponíveis, a falta de modelos pré-clínicos transferíveis limitou a aplicação dessas informações à classificação da doença, em vez da estratificação do tratamento. Transferir as informações genéticas dos pacientes para benefícios clínicos e preencher a lacuna entre descrições detalhadas de GBM, associações genótipo-fenótipo e avanços no tratamento continuam sendo desafios significativos. Nesse contexto, apresentamos um modelo avançado de organoide de GBM humano, o Laboratorial Engineered Glioblastoma Organoid (LEGO), e ilustramos seu uso no estudo das dependências genótipo-fenótipo e na triagem de potenciais medicamentos para GBM. Utilizando este modelo, identificamos a desregulação do metabolismo lipídico como um marco crítico na progressão do GBM e descobrimos que o inibidor da proteína de transferência de triglicerídeos microssomal Lomitapide mostra-se promissor como um tratamento potencial para GBM.

Introdução

O glioblastoma (GBM) é responsável por mais de 60% de todos os tumores cerebrais primários diagnosticados em adultos, com sobrevida média inferior a dois anos 1,2,3. Apesar dos esforços consideráveis para decifrar a complexidade subjacente desta doença, tentativas contínuas com terapias direcionadas ou imunoterapias e triagem de potenciais drogas anticancerígenas, a estratégia de tratamento para pacientes com GBM recém-diagnosticados continua sendo a ressecção cirúrgica segura máxima seguida de radioterapia (RT) combinada com temozolomida (TMZ) e, em seguida, TMZ adjuvante4.

A natureza mutacional altamente heterogênea do glioblastoma dentro e entre os tumores torna extremamente difícil dissecar as propriedades moleculares desse tumor, o que eventualmente leva ao fracasso do tratamento. Assim, é essencial descomplexificar a doença reduzindo a variedade de mutações genéticas aos módulos de mutações que ocorrem com mais frequência em pacientes com GBM 5,6,7,8 e investigar as consequências moleculares de cada subclone mutacional individualmente.

Recentemente, os organoides surgiram como um modelo promissor para a pesquisa do câncer. Os organoides superam os modelos canônicos de câncer, pois exibem um microambiente humano e componentes celulares complexos, sendo fáceis de gerar e expandir com um custo relativamente baixo9. Houve também pioneiros de organoides geneticamente modificados com repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) / proteína 9 associada a CRISPR (Cas9) para estudar o glioma10,11. Seguindo essa direção, geramos um conjunto de modelos de organoides humanos GBM baseados em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) (LEGO: Laboratory Engineered Glioblastoma Organoid) com base na engenharia genética CRISPR/Cas9 das mutações frequentes identificadas em pacientes com GBM. Com a caracterização detalhada do transcriptoma de célula única, DNA metiloma, metaboloma, lipidoma, proteoma e fosfo-proteoma de LEGOs, demonstramos a alta semelhança de LEGOs com GBM humano e descobrimos marcos importantes durante a progressão do GBM, e com a triagem de drogas à base de luciferase, identificamos vários medicamentos potenciais para o tratamento de GBM, os detalhes de tais resultados foram publicados anteriormente12. Este artigo descreve o protocolo detalhado para a geração e triagem de drogas de LEGOs (Figura 1A).

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Protocolo

1. Marcação de luciferase das iPSCs

NOTA: Para obter instruções detalhadas sobre a cultura de iPSCs, consulte o protocolo fornecido pelas instituições ou empresas das quais as células foram obtidas. Em todos os experimentos descritos neste protocolo, as iPSCs nas passagens 3-10 pós-recuperação foram usadas, e quaisquer células que apresentassem sinais de diferenciação foram descartadas. Para a produção do vírus, foram utilizados plasmídeos contendo um promotor EF1α que conduz Luc2, juntamente com um resistente à puromicina.

  1. Quando as células atingirem ~ 70% de confluência, digerir iPSCs com os reagentes A e B de passagem (ver Tabela de Materiais), respectivamente, por 4 min a 37 ° C, centrifugar a 120 x g por 5 min e ressuspender em uma única suspensão celular por pipetagem suave.
  2. Contar as células e semear 1 x 104 células individuais de iPSC em cada alvéolo de uma placa de 48 poços revestida com membrana de matriz basal (BMM), cultura durante 24 h com meio de cultura qualificado para células embrionárias humanas contendo 10 μM de inibidor de rho quinase (ROCK) (ver Tabela de Materiais).
  3. Infecte as células com plasmídeos que expressam luciferase contendo lentivírus (MOI em torno de 10) e 8 μg / mL de polibreno (ver Tabela de Materiais). Substituir o meio por um meio de cultura novo qualificado para células embrionárias humanas 6 h mais tarde.
  4. Após 24 h, adicione 150 μg / mL de substrato de luciferase (ver Tabela de Materiais) ao meio de cultura de células e verifique o sinal de bioluminescência (BLI) com equipamento de imagem de bioluminescência (ver Tabela de Materiais) com uma exposição de 5 s.
  5. Adicione 2 μg/mL de puromicina ao meio de cultura por 2 dias e, em seguida, troque o meio em dias alternados por 1 semana para expandir as células.
  6. Quando as células atingirem ~ 70% de confluência, digerir iPSCs com os reagentes A e B de passagem (ver Tabela de Materiais), respectivamente, por 4 min a 37 ° C, centrifugar a 120 x g por 5 min e ressuspender em uma única suspensão celular por pipetagem suave.
  7. Conte as células e semeie as células individuais a uma concentração de 50 células por placa de 10 cm para 2 pratos. Mudar o meio em dias alternados até que os clones atinjam 3-5 mm de diâmetro (figura 1B).
  8. Verifique o sinal BLI conforme descrito acima e escolha os clones com sinais BLI fortes ao microscópio com pontas de pipeta esterilizadas de 10 μL.
  9. Expanda as células para uso posterior.

2. Desenho de gRNA e clonagem de plasmídeos

NOTA: Essas etapas podem ser executadas simultaneamente com a Seção 1. Os plasmídeos CRISPR/Cas9 com um sistema de seleção adequado devem funcionar. Esses plasmídeos específicos foram usados porque permitem o nocaute simultâneo de vários genes-alvo. Esta seção demonstra como clonar um plasmídeo com dois andaimes de gRNA; mais andaimes de gRNA podem ser clonados em um plasmídeo seguindo o mesmo princípio. O protocolo original foi publicado anteriormente13.

  1. Projete gRNAs direcionados aos respectivos genes de interesse com ferramentas da web online (consulte a Tabela de Materiais). Selecione os gRNAs direcionados aos éxons apresentados em todas as variantes de splicing e localize o mais próximo do local de início da transcrição.
  2. Recozer oligos de gRNA (95 °C por 5 min, esfriar até 25 °C a uma velocidade de 1 °C/s) e linearizar os plasmídeos pX330A-1x2 (ver Tabela de Materiais) e pX330S-2 (ver Tabela de Materiais) com a enzima Bbs1.
  3. Ligue um dos gRNAs com pX330A-1x2 ou pX330S-2, respectivamente, com T4 ligase à temperatura ambiente (RT) por 4 h.
  4. Digerir os dois plasmídeos resultantes com a enzima BsaI (37 °C durante 1 h) e purificar os produtos por extracção em gel.
  5. Ligue os andaimes de gRNA do plasmídeo pX330S-2-gRNA para o plasmídeo linearizado pX330A-1x2-gRNA com T4 ligase em RT por 4 h.
  6. Clone o gene de resistência à puromicina (PuroR) do plasmídeo pX459 (ver Tabela de Materiais) para os plasmídeos resultantes por digestão EcoRI (37 ° C por 1 h) e ligação T4 subsequente em RT por 4 h.
  7. Transforme os plasmídeos em células competentes para DH5alfa e extraia os plasmídeos após a expansão.

3. Geração e validação de nocaute em iPSCs

NOTA: Siga os protocolos padrão de nocaute CRISPR/Cas9 publicados antes de13,14. Esta seção descreve o método utilizado para realizar os nocautes via eletroporação.

  1. Digerir as iPSCs com os reagentes A e B (ver Tabela de Materiais) durante 4 min a 37 °C cada, centrifugar as células durante 5 min a 120 x g e ressuspender em meio de cultura qualificado para células embrionárias humanas (ver Tabela de Materiais) para gerar suspensões unicelulares.
  2. Conte as células e divida-as em vários tubos para obter 1,2 x 106 células por amostra e gire as células a 120 x g por 5 min.
  3. Enquanto isso, misture 15 μg dos plasmídeos em 135 μL de tampão de ressuspensão do kit de transfecção (ver Tabela de Materiais).
  4. Use 120 μL da mistura para ressuspender o pellet celular.
  5. Eletroporar as células por dois pulsos a 1200 V por 20 ms com um sistema de eletroporação (ver Tabela de Materiais) e colocar as células resultantes em um poço de placa de 6 poços com um meio de cultura qualificado de células embrionárias humanas contendo reagente para facilitar a sobrevivência de uma única célula (ver Tabela de Materiais).
  6. Adicionar 2 μg/ml de puromicina ao meio de cultura de 12 em 12 h durante 2 dias. Em seguida, expanda as células por 1 semana antes da colheita.
  7. Verifique a eficiência do nocaute por western blotting ou análise de ferramentas da web (consulte Tabela de Materiais) e selecione a população de nocaute com a maior eficiência.
  8. Digerir as iPSCs com a maior eficiência de nocaute com os reagentes A e B de passagem por 4 min a 37 ° C cada e girar as células por 5 min a 120 x g. Ressuspender em meio de cultura qualificado para células embrionárias humanas para gerar suspensões unicelulares.
  9. Contar as células e semear cerca de 100 células em duas placas de 10 cm (50 células em cada placa) contendo meio de cultura qualificado de células embrionárias humanas pré-aquecidas e fornecido com um reagente para facilitar a sobrevivência de uma única célula.
  10. Troque o meio a cada dois dias e cultive as células por 2 semanas.
  11. Quando as colônias unicelulares tiverem 3-5 mm de diâmetro, escolha as colônias com pontas de pipeta de 10 μL ao microscópio e expanda as células em dois poços de placas de 48 poços.
  12. Quando as células atingirem 30% -50% de confluência, extraia o DNA de um poço da placa de 48 poços e faça PCR.
  13. Sequencie os produtos de PCR e analise os resultados com a ferramenta da web (consulte a Tabela de Materiais).
  14. Selecione 5 clones positivos para expandir e validar ainda mais os resultados do nocaute com clonagem de TA e western blots.

4. Cultura Organoide

NOTA: Os organoides foram gerados seguindo protocolos publicados anteriormente com pequenas adaptações 15,16,17. A idade ideal dos organoides (a duração da cultura) deve ser determinada com base no objetivo específico do estudo. Por exemplo, ao investigar associações genótipo-fenótipo ou observar padrões de crescimento de organoides, recomenda-se analisar vários pontos de tempo variando de 1 a 4 meses ou mais. Organoides com idade entre 2 e 2,5 meses foram usados para triagem de drogas, pois tendiam a desenvolver um núcleo necrótico no centro devido a limitações de nutrientes em tamanhos maiores, o que poderia afetar a precisão dos resultados da triagem de drogas.

  1. No dia 0, digerir iPSCs com os reagentes A e B de passagem (ver Tabela de Materiais) respectivamente por 4 min a 37 ° C, centrifugar a 120 x g por 5 min e ressuspender em uma única suspensão celular usando meio hES de baixo fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF) (Tabela 1).
  2. Conte as células e adicione um número apropriado de células para atingir uma concentração de 6 × 104 células / mL.
  3. Adicione 50 μM de inibidor de ROCK e 6 ng/mL de bFGF às células contendo baixo bFGF hES em meio.
  4. Semear 150 μL de suspensão celular (9000 células) em cada poço da placa de fixação ultrabaixa de 96 poços para os grupos controle (organoides WT) e experimental (organoides knockout).
  5. No dia 3, remova cuidadosamente 80 μL de meio de cultura antigo de cada poço e adicione 150 μL de meio fresco de baixo bFGF hES.
  6. No dia 5, quando os corpos embrionários (EBs) começarem a brilhar e ter bordas lisas, remova o máximo possível de meio de cultura antigo de cada poço e adicione 150 μL a 200 μL de meio de indução neural fresco (Tabela 1).
  7. No dia 7, remova o máximo possível de meio de cultura antigo de cada poço e adicione 150-200 μL de meio de indução neural.
  8. No dia 9, observe os EBs sob o microscópio de cultura de tecidos e selecione os EBs que são mais brilhantes do lado de fora.
  9. Descongele o BMM a 4 °C ou no gelo por 30 min antes de iniciar as etapas a seguir.
  10. Use uma ponta de pipeta cortada de 200 μL de largura para transferir os EBs para a folha de incorporação de organoides (consulte a Tabela de Materiais), remova o meio excessivo, coloque 30 μL de BMM nos organoides, posicione os EBs no meio da gota com uma ponta de pipeta de 10 μL e deixe-a solidificar na incubadora de 37 ° C por 20 min.
  11. Lave as gotículas de BMM para uma placa de 6 poços contendo 3 mL de meio NeuroDMEM - A (Tabela 1) e 3 μM CHIR99021 (ver Tabela de Materiais).
  12. No dia 11, remova o máximo do meio de cultura antigo de cada poço e adicione 3 mL de NeuroDMEM fresco - Um meio contendo 3 μM CHIR99021.
  13. No dia 13, remova o máximo possível do meio de cultura antigo de cada poço e adicione 3 mL de meio de cultura NeuroDMEM + A (Tabela 1). Coloque a placa de 6 poços em um agitador girando a 75 rpm na incubadora.
  14. Atualize o meio NeuroDMEM + A a cada 3 dias até que os organoides sejam usados.
  15. Utilizar os organoides para análise multiômica seguindo os protocolos padrão ou triagem de drogas realizada na publicação anterior12.

5. Tela de drogas com LEGOs

NOTA: O tempo de exposição para iPSCs ou organoides BLI deve ser avaliado usando vários equipamentos ou ambientes de laboratório.

  1. Transfira organoides na idade desejada para uma placa de 24 poços contendo 1 mL de meio NeuroDMEM + A, um organoide por poço, 2 dias antes do experimento.
  2. Adicione 150 μg/mL de D-luciferina e incube no agitador por 15-30 min.
  3. Execute o BLI conforme descrito anteriormente com um tempo de exposição de 1 s-5 s.
  4. Selecione os organoides com intensidades de sinal semelhantes para experimentos subsequentes (pelo menos 3 organoides para cada grupo).
  5. No dia 0, repita as etapas 5.2 e 5.3. Em seguida, aplique dimetilsulfóxido (DMSO) ou medicamentos interessados no meio de cultura dos organoides. Comece com uma concentração inicial do medicamento de 10 μM e, em seguida, execute um ensaio IC50 ou ajuste a concentração ainda mais de acordo com diferentes finalidades.
  6. Repita a etapa 5.5 a cada 2 dias. Trate os organoides por 6 a 10 dias.
    NOTA: A duração pode ser alterada de acordo com diferentes finalidades ou a natureza diferente dos medicamentos.
  7. Adicionar 100 μM de BrdU ao meio e incubá-lo numa incubadora de CO2 durante 2 h antes de colher os organoides, se necessário, para posterior análise de proliferação.
  8. Normalize o sinal BLI para o controle DMSO medido no mesmo dia e compare-o com antes do tratamento medicamentoso para avaliar o efeito do tratamento medicamentoso. Considere medicamentos com um valor de P inferior a 0,05 e uma diminuição de sinal de mais de 50% de eficácia.

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Resultados

Em nossas mãos, os LEGOs derivados de iPSCs mutantes apresentaram maior expansão em comparação com o controle isogênico WT (Figura 1C) e apresentaram nuclear atípico após 4 semanas de cultivo (Figura 1D), o que suporta a potencial transformação maligna das células em organoides mutantes18. O potencial tumorigênico dos organoides pode ser verificado com experimentos xenoenxertados, se necessári...

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Discussão

A falta de tratamento personalizado no GBM humano pode ser atribuída em grande parte ao fato de que muitos modelos de GBM, como linhagens de células humanas ou modelos de camundongos, não podem recapitular fielmente o GBM humano. Consequentemente, as estratégias de tratamento selecionadas com base nesses sistemas modelo não podem ser transferidas para aplicações clínicas. Em vez disso, os organoides podem resolver esses problemas translacionais com a presença de condições fisi...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pela SFB1389 de concessão da Deutsche Forschungsgemeinschaft (H-K.L.), Deutsche Krebshilfe grant 110227 (H-K.L.), European Research Council (ERC) grant 647055 (H-K.L.), Deutschen Konsortium für Translationale Krebsforschung (DKTK) grant AIM2GO (H-K.L.).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AccutaseA6964Sigma-Aldrich Passaging reagent B
Antibiotic-Antimycotic15240096Life-Technologies
B27 17504044Life Technologies 
B27 without vitamin A 12587010Life Technologies 
Bbs1-HFR3539SNew England Biolabs
Bsa1-HFR3535SNew England Biolabs
CHIR990214423Tocris Bioscience
CloneR#05889STEMCELL Technologies Reagent to facilitate single-cell survival
D-LuciferinL2916InvitrogenLuciferase Substrate
DMEM/F-1211330032Life Technologies 
EcoRl-HFR3101TNew England Biolabs
Fetal Bovine Serum 30-2020ATCC 
FGF-2100-18BPeproTech 
GlutaMAX35050038Life Technologies 
HeparinH3149Sigma-Aldrich 
hES-quality Fetal Bovine Serum10270106Life Technologies 
Insulin SolutionI9278Sigma-Aldrich 
IVIS Lumina IINAPerkinElmer
Knockout serum replacement10828-028Life Technologies 
L-Ascorbic AcidA4544-25GSigma-Aldrich 
Matrigel® hES qualified354277CorningBasement matrix membrane
MEM-NEAA11140050Life Technologies 
mTeSR Plus100-0276STEMCELL Technologies Human embryonic cell qualified culture medium
N2 17502048Life Technologies 
Neon Electroporation SystemNAThermo Fisher ScientificElectroporation system
Neon Transfection System 100 µL KitMPK10096InvitrogenElectroporation kit
Neurobasal medium21103049Life Technologies 
Online knockout efficiency analysisNAhttp://shinyapps.datacurators.nl/tide/
Organoid Embedding Sheet # 08579STEMCELL Technologies 
Penicillin-Streptomycin 15140122Life-Technologies
Polybrene (10mg/mL)TR-1003-50ULMerck Millipore
PuromycinP8833Sigma-Aldrich
px330-A-1x2https://www.addgene.org/58766/Addgene 
px330-S-2 https://www.addgene.org/58778/Addgene 
px459https://www.addgene.org/48139/Addgene 
ReleSR5872STEMCELL Technologies Passaging reagent A
Rock Inhibitor72304STEMCELL Technologies 
sgRNA designNAhttps://zlab.bio/guide-design-resources
sgRNA designNANAwww.benchling.com
T4 DNA ligaseM0202SNew England Biolabs
β-Mercaptoethanol M3148Sigma-Aldrich 

Referências

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