JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье мы описываем комплексный протокол создания и использования лабораторно спроектированных органоидов глиобластомы (LEGO) для исследования зависимости генотипа и фенотипа и скрининга потенциальных препаратов для лечения глиобластомы.

Аннотация

Глиобластома (ГБМ) описывается как группа высокозлокачественных первичных опухолей головного мозга и является одним из самых смертоносных злокачественных новообразований. Генетические и клеточные характеристики ГБМ были в центре внимания текущих исследований, показывающих, что это группа гетерогенных заболеваний с вариациями экспрессии РНК, метилирования ДНК или клеточного состава. Несмотря на обилие доступных молекулярных данных, отсутствие переносимых доклинических моделей ограничило применение этой информации для классификации заболеваний, а не для стратификации лечения. Перенос генетической информации пациентов в клинические преимущества и преодоление разрыва между подробными описаниями ГБМ, ассоциациями генотип-фенотип и достижениями в лечении остаются значительными проблемами. В этом контексте мы представляем усовершенствованную модель органоида ГБМ человека, органоид глиобластомы (LEGO), и иллюстрируем ее использование для изучения зависимости генотипа и фенотипа и скрининга потенциальных препаратов для лечения ГБМ. Используя эту модель, мы определили нарушение липидного обмена как критическую веху в прогрессировании ГБМ и обнаружили, что микросомальный ингибитор белка переноса триглицеридов Ломитапид является перспективным в качестве потенциального лечения ГБМ.

Введение

Глиобластома (ГБМ) составляет более 60% всех диагностированных первичных опухолей головного мозга у взрослых, с медианой выживаемости менее двух лет 1,2,3. Несмотря на значительные усилия по расшифровке основной сложности этого заболевания, постоянные попытки таргетной терапии или иммунотерапии, а также скрининг потенциальных противораковых препаратов, стратегией лечения пациентов с впервые диагностированным ГБМ остается максимально безопасная хирургическая резекция с последующей лучевой терапией (ЛТ) в сочетании с темозоломидом (ТМЗ) и затем адъювантом ТМЗ4.

Крайне гетерогенная мутационная природа глиобластомы внутри и между опухолями чрезвычайно затрудняет препарирование молекулярных свойств этой опухоли, что в конечном итоге приводит к неудаче лечения. Таким образом, необходимо деусложнить заболевание путем сокращения разнообразия генетических мутаций до модулей мутаций, которые чаще всего встречаются у пациентов с ГБМ 5,6,7,8, и исследовать молекулярные последствия каждого мутационного субклона в отдельности.

В последнее время органоиды стали многообещающей моделью для исследований рака. Органоиды превосходят канонические модели рака, поскольку они демонстрируют человеческое микроокружение и сложные клеточные компоненты, при этом их легко создавать и расширять при относительнонизкой стоимости. Также были пионеры генетически модифицированных органоидов с кластеризованными регулярно чередующимися короткими палиндромными повторами (CRISPR)/CRISPR-ассоциированным белком 9 (Cas9) для изучения глиомы10,11. Следуя этому направлению, мы создали набор моделей органоидов GBM человека на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) (LEGO: Laboratory Engineered Glioblastoma Organoid) на основе генной инженерии CRISPR/Cas9 частых мутаций, выявленных у пациентов с GBM. С детальной характеристикой одноклеточного транскриптома, метилома ДНК, метаболома, липидома, протеома и фосфо-протеома LEGO, мы продемонстрировали большое сходство LEGO с человеческим ГБМ и обнаружили основные вехи в прогрессировании ГБМ, а с помощью скрининга лекарств на основе люциферазы мы определили несколько потенциальных препаратов для лечения ГБМ, подробности таких результатов были опубликованы ранее12. В этой статье описан подробный протокол создания и скрининга лекарственных препаратов LEGO (Рисунок 1A).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Мечение люциферазой ИПСК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробных инструкций по культивированию ИПСК обратитесь к протоколу, предоставленному учреждениями или компаниями, у которых были получены клетки. Во всех экспериментах, описанных в этом протоколе, использовали иПСК в пассажах 3-10 после восстановления, и любые клетки, проявляющие признаки дифференцировки, отбрасывали. Для производства вируса использовали плазмиды, содержащие промотор EF1α, управляющий Luc2, а также устойчивую к пуромицину кассету.

  1. Когда клетки достигнут ~70% конфлюенции, расщепляют иПСК с помощью проходящих реагентов A и B (см. Таблицу материалов) соответственно в течение 4 мин при 37 °C, центрифугируют при 120 x g в течение 5 мин и ресуспендируют в одноклеточную суспензию с помощью щадящего пипетирования.
  2. Подсчитайте клетки и затравите 1 x 104 одиночные клетки iPSC в каждой лунке 48-луночного планшета, покрытого базальной матричной мембраной (BMM), культивируйте в течение 24 ч питательной средой, квалифицированной для эмбриональных клеток человека, содержащей ингибитор 10 μM рокиназы (ROCK) (см. Таблицу материалов).
  3. Инфицируйте клетки лентивирус-содержащими люцифераз-экспрессирующими плазмидами (MOI около 10) и полибреном 8 мкг/мл (см. Таблицу материалов). Замените среду свежей питательной средой для эмбриональных клеток человека через 6 часов.
  4. Через 24 ч добавьте субстрат люциферазы 150 мкг/мл (см. Таблицу материалов) в среду для культивирования клеток и проверьте сигнал биолюминесценции (BLI) с помощью оборудования для биолюминесцентной визуализации (см. Таблицу материалов) с экспозицией 5 с.
  5. Добавьте 2 мкг/мл пуромицина в питательную среду в течение 2 дней, затем меняйте среду через день в течение 1 недели для расширения клеток.
  6. Когда клетки достигнут ~70% конфлюенции, расщепляют иПСК с помощью проходящих реагентов A и B (см. Таблицу материалов) соответственно в течение 4 мин при 37 °C, центрифугируют при 120 x g в течение 5 мин и ресуспендируют в одноклеточную суспензию с помощью щадящего пипетирования.
  7. Подсчитайте ячейки и засейте одиночные клетки в концентрации 50 клеток на 10 см чашки на 2 чашки. Меняйте среду через день до тех пор, пока клоны не достигнут 3-5 мм в диаметре (рисунок 1Б).
  8. Проверьте сигнал BLI, как описано выше, и выберите клоны с сильными сигналами BLI под микроскопом со стерилизованными наконечниками для дозаторов объемом 10 мкл.
  9. Разверните ячейки для дальнейшего использования.

2. Дизайн гРНК и клонирование плазмид

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги могут быть выполнены одновременно с разделом 1. Плазмиды CRISPR/Cas9 при правильной системе отбора должны работать. Эти специфические плазмиды были использованы, потому что они позволяют одновременно нокаутировать несколько генов-мишеней. В этом разделе показано, как клонировать плазмиду с помощью двух скаффолдов гРНК; По тому же принципу можно клонировать больше скаффолдов гРНК в одну плазмиду. Первоначальный протокол был ранее опубликован13.

  1. Проектируйте гРНК, нацеленные на соответствующие интересующие гены, с помощью онлайн-веб-инструментов (см. Таблицу материалов). Выберите гРНК, нацеленные на экзоны, представленные во всех вариантах сплайсинга, и найдите ближайшую к начальному сайту транскрипции.
  2. Отжигите олигопласты гРНК (95 °C в течение 5 мин, охладите до 25 °C со скоростью 1 °C/с) и линеаризуйте плазмиды pX330A-1x2 (см. Таблицу материалов) и pX330S-2 (см. Таблицу материалов) ферментом Bbs1.
  3. Лигатировать одну из гРНК с помощью pX330A-1x2 или pX330S-2 соответственно с Т4-лигазой при комнатной температуре (RT) в течение 4 ч.
  4. Две полученные плазмиды расщепляют ферментом BsaI (37 °C в течение 1 ч) и очищают продукты путем экстракции гелем.
  5. Лигатировать скаффолды гРНК от плазмиды pX330S-2-gRNA к линеаризованной плазмиде pX330A-1x2-gRNA с Т4-лигазой при ОТ в течение 4 ч.
  6. Клонирование гена резистентности к пуромицину (PuroR) из плазмиды pX459 (см. Таблицу материалов) в полученные плазмиды путем расщепления EcoRI (37 °C в течение 1 ч) и последующего лигирования T4 при ОТ в течение 4 ч.
  7. Трансформируйте плазмиды в DH5alpha-компетентные клетки и экстрагируйте плазмиды после экспансии.

3. Генерация и валидация нокаута на iPSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте стандартным протоколам нокаута CRISPR/Cas9, опубликованным до 13,14. В этом разделе описан метод, используемый для выполнения нокаутов с помощью электропорации.

  1. Расщепляют иПСК с помощью прошедших реагентов А и В (см. Таблицу материалов) в течение 4 мин при 37 °С каждый, а затем замедляют клетки в течение 5 мин при 120 x g и ресуспендируют в питательной среде, пригодной для эмбриональных клеток человека (см. Таблицу материалов) для получения суспензий одиночных клеток.
  2. Подсчитайте клетки и разделите их на несколько пробирок, чтобы получить 1,2 x 106 клеток на образец, и вращайте клетки при 120 x g в течение 5 минут.
  3. Тем временем смешайте 15 г плазмид в 135 μл буфера для ресуспензии из набора для трансфекции (см. Таблицу материалов).
  4. Используйте 120 мкл смеси для ресуспендирования клеточной гранулы.
  5. Электропорировать клетки в течение двух импульсов при напряжении 1200 В в течение 20 мс с помощью системы электропорации (см. Таблицу материалов) и поместить полученные клетки в одну 6-луночную лунку с питательной средой для эмбриональных клеток человека, содержащей реагент для облегчения выживания одиночных клеток (см. Таблицу материалов).
  6. Добавляйте 2 мкг/мл пуромицина в питательную среду каждые 12 ч в течение 2 дней. Затем разверните ячейки за 1 неделю до сбора урожая.
  7. Проверьте эффективность нокаута с помощью вестерн-блоттинга или анализа webtool (см. Таблицу материалов) и выберите популяцию нокаута с наибольшей эффективностью.
  8. Расщепляют ИПСК с высочайшей эффективностью нокаута с помощью реагентов A и B в течение 4 мин при 37 °C каждый, а затем замедляют клетки в течение 5 мин при 120 x g. Ресуспендируют в питательной среде, пригодной для эмбриональных клеток человека, для получения суспензий одиночных клеток.
  9. Подсчитайте клетки и засемените примерно 100 клеток в двух чашках по 10 см (по 50 клеток в каждой чашке), содержащих предварительно подогретую питательную среду для эмбриональных клеток человека, снабженную реагентом для облегчения выживания одиночных клеток.
  10. Меняйте среду через день и культивируйте клетки в течение 2 недель.
  11. Когда колонии одиночных клеток достигнут 3-5 мм в диаметре, выберите колонии с наконечниками пипеток объемом 10 мкл под микроскопом и разверните клетки в двух лунках по 48 луночных планшетов.
  12. Когда клетки достигнут 30%-50% конфлюенции, извлеките ДНК из одной лунки из 48-луночного планшета и проведите ПЦР.
  13. Секвенируйте продукты ПЦР и проанализируйте результаты с помощью веб-инструмента (см. Таблицу материалов).
  14. Выберите 5 положительных клонов для расширения и дальнейшей проверки результатов нокаута с помощью клонирования TA и вестерн-блотов.

4. Органоидная культура

Примечание: Органоиды были сгенерированы в соответствии с ранее опубликованными протоколами с незначительными адаптациями 15,16,17. Оптимальный возраст органоидов (продолжительность культивирования) должен определяться исходя из конкретной цели исследования. Например, при исследовании ассоциаций между генотипом и фенотипом или наблюдении за моделями роста органоидов рекомендуется анализировать несколько временных точек в диапазоне от 1-4 месяцев или дольше. Органоиды в возрасте 2-2,5 месяцев использовались для скрининга лекарств, так как они имели тенденцию к развитию некротического ядра в центре из-за ограничений питательных веществ при больших размерах, что могло повлиять на точность результатов скрининга лекарств.

  1. В день 0 расщепляют иПСК с помощью промежуточных реагентов А и В (см. Таблицу материалов) соответственно в течение 4 мин при 37 °C, центрифугируют при 120 x g в течение 5 мин и ресуспендируют в одноклеточную суспензию с использованием низкоосновных сред роста фибробластов (bFGF) hES (табл. 1).
  2. Подсчитайте клетки и добавьте соответствующее количество клеток, чтобы достичь концентрации 6 ×10 4 клеток/мл.
  3. Добавьте 50 мкМ ингибитор ROCK и 6 нг/мл bFGF к клеткам с низким содержанием bFGF hES.
  4. Засейте 150 мкл клеточной суспензии (9000 клеток) в каждую лунку 96-луночного планшета со сверхнизким присоединением как для контрольной (WT-органоиды), так и для экспериментальной (нокаут-органоиды) групп.
  5. На 3-й день осторожно удалите 80 мкл старой питательной среды из каждой лунки и добавьте 150 мкл свежей среды с низким содержанием bFGF hES.
  6. На 5-й день, когда эмбриональные тела (БЭ) начинают светлеть и иметь гладкие края, удалите как можно больше старой питательной среды из каждой лунки и добавьте от 150 до 200 мл свежей среды для нервной индукции (табл. 1).
  7. На 7-й день удалите как можно больше старой питательной среды из каждой лунки и добавьте 150-200 мкл нейроиндукционной среды.
  8. На 9-й день понаблюдайте за БЭ под микроскопом тканевой культуры и выберите те из них, которые ярче снаружи.
  9. Разморозьте BMM при 4 °C или на льду в течение 30 минут, прежде чем приступать к следующим этапам.
  10. С помощью отрезанного наконечника для дозатора объемом 200 мкл перенесите БЭ на лист для заделки органоидов (см. Таблицу материалов), удалите излишки среды, капните 30 мкл BMM на органоиды, расположите БЭ в середине капли с помощью наконечника пипетки объемом 10 мкл и дайте ему застыть в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 20 минут.
  11. Смойте капли BMM на 6-луночный планшет, содержащий 3 мл среды NeuroDMEM - A (Таблица 1) и 3 мкМ CHIR99021 (см. Таблицу материалов).
  12. На 11-й день удалите как можно больше старой питательной среды из каждой лунки и добавьте 3 мл свежей среды NeuroDMEM -A, содержащей 3 мкМ CHIR99021.
  13. На 13-й день удалите как можно больше старой питательной среды из каждой лунки и добавьте 3 мл питательной среды NeuroDMEM + A (Таблица 1). Поместите 6-луночный планшет на шейкер, вращающийся со скоростью 75 об/мин в инкубаторе.
  14. Обновляйте среду NeuroDMEM + A каждые 3 дня до использования органоидов.
  15. Используйте органоиды для мультиомного анализа в соответствии со стандартными протоколами или для скрининга лекарственных средств, как это было выполнено в предыдущей публикации12.

5. Скрининг на наркотики с помощью LEGOs

ПРИМЕЧАНИЕ: Время воздействия iPSCs или органоидов BLI следует оценивать с использованием различного оборудования или лабораторных условий.

  1. Перенесите органоиды в нужном возрасте в 24-луночный планшет, содержащий 1 мл среды NeuroDMEM + A, по одному органоиду на лунку, за 2 дня до эксперимента.
  2. Добавьте 150 мкг/мл D-люциферина и выдерживайте в шейкере в течение 15-30 минут.
  3. Выполняйте BLI, как описано выше, с временем воздействия 1 с-5 с.
  4. Для последующих экспериментов выберите органоиды с одинаковой мощностью сигнала (не менее 3 органоидов для каждой группы).
  5. В день 0 повторите шаги 5.2 и 5.3. Затем нанесите диметилсульфоксид (ДМСО) или заинтересованные препараты на питательную среду органоидов. Начните с начальной концентрации препарата 10 μM, затем проведите анализ IC50 или отрегулируйте концентрацию в соответствии с различными целями.
  6. Повторяйте шаг 5.5 каждые 2 дня. Обрабатывать органоидами в течение 6-10 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность может быть изменена в зависимости от различных целей или характера препаратов.
  7. Добавьте 100 мкМ BrdU в среду и инкубируйте ее в инкубаторе CO2 в течение 2 ч перед сбором органоидов, если это необходимо, для последующего анализа пролиферации.
  8. Нормализуйте сигнал BLI к контрольному ДМСО, измеренный в тот же день, а затем сравните его с сигналом до лечения препаратом для оценки эффекта лечения препаратом. Рассмотрите препараты со значением P менее 0,05 и снижением сигнала более чем на 50% эффективными.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В наших руках LEGO, полученные из мутантных иПСК, показали повышенную экспансию по сравнению с изогенным контролем WT (рисунок 1C) и показали атипичное ядро после 4 недель культивирования (рисунок 1D), что подтверждает потенциальную злокачес...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Отсутствие персонализированного лечения человеческого GBM в значительной степени можно объяснить тем фактом, что многие модели GBM, такие как человеческие клеточные линии или мышиные модели, не могут точно воспроизвести человеческий GBM. Следовательно, стратегии лечени...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов, который можно было бы раскрыть

Благодарности

Эта работа поддержана грантом Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB1389 (H-K.L.), Deutsche Krebshilfe grant 110227 (H-K.L.), Грантом Европейского исследовательского совета (ERC) 647055 (H-K.L.), Немецким консортиумом по переводу Krebsforschung (DKTK) грантом AIM2GO (H-K.L.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AccutaseA6964Sigma-Aldrich Passaging reagent B
Antibiotic-Antimycotic15240096Life-Technologies
B27 17504044Life Technologies 
B27 without vitamin A 12587010Life Technologies 
Bbs1-HFR3539SNew England Biolabs
Bsa1-HFR3535SNew England Biolabs
CHIR990214423Tocris Bioscience
CloneR#05889STEMCELL Technologies Reagent to facilitate single-cell survival
D-LuciferinL2916InvitrogenLuciferase Substrate
DMEM/F-1211330032Life Technologies 
EcoRl-HFR3101TNew England Biolabs
Fetal Bovine Serum 30-2020ATCC 
FGF-2100-18BPeproTech 
GlutaMAX35050038Life Technologies 
HeparinH3149Sigma-Aldrich 
hES-quality Fetal Bovine Serum10270106Life Technologies 
Insulin SolutionI9278Sigma-Aldrich 
IVIS Lumina IINAPerkinElmer
Knockout serum replacement10828-028Life Technologies 
L-Ascorbic AcidA4544-25GSigma-Aldrich 
Matrigel® hES qualified354277CorningBasement matrix membrane
MEM-NEAA11140050Life Technologies 
mTeSR Plus100-0276STEMCELL Technologies Human embryonic cell qualified culture medium
N2 17502048Life Technologies 
Neon Electroporation SystemNAThermo Fisher ScientificElectroporation system
Neon Transfection System 100 µL KitMPK10096InvitrogenElectroporation kit
Neurobasal medium21103049Life Technologies 
Online knockout efficiency analysisNAhttp://shinyapps.datacurators.nl/tide/
Organoid Embedding Sheet # 08579STEMCELL Technologies 
Penicillin-Streptomycin 15140122Life-Technologies
Polybrene (10mg/mL)TR-1003-50ULMerck Millipore
PuromycinP8833Sigma-Aldrich
px330-A-1x2https://www.addgene.org/58766/Addgene 
px330-S-2 https://www.addgene.org/58778/Addgene 
px459https://www.addgene.org/48139/Addgene 
ReleSR5872STEMCELL Technologies Passaging reagent A
Rock Inhibitor72304STEMCELL Technologies 
sgRNA designNAhttps://zlab.bio/guide-design-resources
sgRNA designNANAwww.benchling.com
T4 DNA ligaseM0202SNew England Biolabs
β-Mercaptoethanol M3148Sigma-Aldrich 

Ссылки

  1. Stupp, R., et al. Effect of tumor-treating fields plus maintenance temozolomide vs maintenance temozolomide alone on survival in patients with glioblastoma: A randomized clinical trial. JAMA. 318 (23), 2306-2316 (2017).
  2. Rock, K., et al. A clinical review of treatment outcomes in glioblastoma multiforme--the validation in a non-trial population of the results of a randomised phase iii clinical trial: Has a more radical approach improved survival. Br J Radiol. 85 (1017), e729-e733 (2012).
  3. Louis, D. N., et al. The 2016 world health organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathol. 131 (6), 803-820 (2016).
  4. Wen, P. Y., et al. Glioblastoma in adults: A Society for Neuro-Oncology (SNO) and European Society of Neuro-Oncology (EANO) consensus review on current management and future directions. Neuro Oncol. 22 (8), 1073-1113 (2020).
  5. Ohgaki, H., Kleihues, P. Genetic pathways to primary and secondary glioblastoma. Am J Pathol. 170 (5), 1445-1453 (2007).
  6. Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Abou-El-Ardat, K., et al. Comprehensive molecular characterization of multifocal glioblastoma proves its monoclonal origin and reveals novel insights into clonal evolution and heterogeneity of glioblastomas. Neuro Oncol. 19 (4), 546-557 (2017).
  9. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  10. Ogawa, J., Pao, G. M., Shokhirev, M. N., Verma, I. M. Glioblastoma model using human cerebral organoids. Cell Rep. 23 (4), 1220-1229 (2018).
  11. Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nat Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
  12. Wang, C., et al. A multidimensional atlas of human glioblastoma-like organoids reveals highly coordinated molecular networks and effective drugs. NPJ Precis Oncol. 8 (1), 19(2024).
  13. Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/CAS9 vector system. Sci Rep. 4 (1), 5400(2015).
  14. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-CAS9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  15. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. 35 (7), 659-666 (2017).
  16. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  17. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  18. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  19. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  20. Da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discov. 23 (8), 862-868 (2018).
  21. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Rep. 26 (12), 3203-3211.e5 (2019).
  22. Garreta, E., et al. Rethinking organoid technology through bioengineering. Nat Mater. 20 (2), 145-155 (2021).
  23. Zhao, X., et al. Review on the vascularization of organoids and organoids-on-a-chip. Front Bioeng Biotechnol. 9, 637048(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

LEGO

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены